Ogólne założenia

Białko występujące w płynach biologicznych wymaga

pewnego stopnia oczyszczenia, zanim zostanie
właściwie oznaczone (zmierzone), zbadane czy
zastosowane.

1.

Izolowanie białka od innych białek i cząsteczek

zostaje wykonane przez zastosowanie kombinacji kilku
metod opartych na takich właściwościach, jak
rozpuszczalność, ciężar cząsteczkowy, ładunek
cząsteczkowy i swoiste wiązanie się białka za
specyficznymi substancjami.

2.

Diagnostyka i cele terapeutyczne. Laboratoria

kliniczne rutynowo oczyszczają białka w celach
diagnostycznych. Np. białka osocza zwykle bada się
przez rozdział elektroforetyczny.

Techniki oczyszczania

1)

Rozpuszczalność białka jest uwarunkowana

stężeniem soli w roztworze.



Wysalanie. Dodając sole, takie jak siarczan amonu,

do roztworu białek wytrącamy niektóre z nich przy

określonym stężeniu soli, ale nie wytrącamy innych.

Taki typ separacji stosujemy w celu zwiększenia

ilości określonego białka w danej frakcji,

pochodzącej z bardzo złożonej mieszaniny białek,

takiej jak np. próbka osocza krwi.



Odsalanie. Niektóre białka do rozpuszczania w

wodzie wymagają obecności nieorganicznych jonów.

Długotrwała (intensywna) dializa wobec roztworu o

niskim stężeniu soli może więc spowodować

wypadanie niektórych białek z roztworu.

2)

Rozdział w oparciu o ciężar cząsteczkowy.



Dializa. Mieszaninę białek i małych rozpuszczalnych

związków można rozdzielić przez dializę z użyciem

półprzepuszczalnej błony. To czy dana cząsteczka

przejdzie lub nie przez błonę jest uwarunkowane

rozmiarem porów w błonie dializacyjnej.



Sączenie molekularne (chromatografia

molekularno-sitowa, filtracja żelowa) wykorzystuje

kolumny z nierozpuszczalnego polimeru

węglowodanowego w kształcie porowatych ziaren.

Małe cząsteczki mogą wnikać do otworów ziaren a

duże nie. W związku z tym objętość rozpuszczalnika

dostępna dla małych cząsteczek jest większa niż dla

dużych i dlatego mniejsze cząsteczki przepływają

wolniej. Szybkość przepływu przez kolumnę zależy

od ich wielkości i kształtu. Sączenie molekularne jest

wykorzystywane zarówno do wyznaczania ciężaru

cząsteczkowego, jak i rozdziału białek.

Sączenie molekularne



Ultrawirowanie. Duża szybkość wirowania
powoduje rozdział roztworu białek na wiele
składowych.



Szybkość z jaką sedymentują (opadają) białka
podczas zastosowania siły odśrodkowej, zależy od
ich wielkości i kształtu. Im białka o podobnym
kształcie są większe tym szybciej sedymentują.



Dane z badań ultrawirowania często są
przedstawione w jednostkach Svedberga (S), które
odnoszą się do szybkości opadania białka podczas
wirowania.



Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z
dodecylosiarczanem sodu (SDS), wykonana
na usieciowanym żelu poliakrylamidowym, w
obecności SDS i czynnika redukującego, jak np.
β-merkaptoetanolu, rozdziela białka na
podstawie ciężaru cząsteczkowego.

3) Rozdział białek na podstawie ładunku

cząsteczki.



Chromatografia jonowymienna



Białka wiążą się z żywicą jonowymienną w kolumnie.

Siła związania konkretnego białka zależy od ilości reszt

dostępnych do interakcji z żywicą jonowymienną.



Stosowana jest kolumna z nierozpuszczalnym

materiałem jonowymiennym zawierającym grupy

polianionowe lub polikationowe. W odpowiednim pH

grupy te łączą odmiennie naładowane ugrupowania

poprzez interakcję jonową.



Białka mogą być wypłukiwane z wymieniacza przez

wymycie roztworem zawierającym sole , które niszczą

elektrostatyczne interakcje białek z żywicą

jonowymienną.



Jeżeli kolumnę przepłukuje się roztworem soli o

stopniowo wzrastającym stężeniu to słabo związane

białka będą wymyte przed silnie związanymi.



Wysokosprawna chromatografia cieczowa
(HPLC)



Jest podobna do chromatografii jonowymiennej i
innych chromatograficznych metod, w których
roztwór białek jest przepuszczany przez specjalne
złoża zawierające przyłączone boczne grupy wiążące
się w zależności od typu złoża, jonowo lub
chydrofobowo z białkami.



HPLC różni się od konwencjonalnych chromatografii
tym, że jest prowadzona przy zwiększonym
ciśnieniu. Tka wysokociśnieniowa chromatografia
jest szybsza, a wyniki wykazują lepszą rozdzielczość
niż w chromatografii niskociśnieniowej.



Elektroforeza. Metoda wykorzystująca pole
elektryczne do nadania ruchu jakimkolwiek
cząsteczką posiadającym ładunek. Naładowane
cząsteczki poruszają się w polu elektrycznym z
szybkością określoną stosunkiem ich ładunku do
masy oraz ich kształtem.



Metody elektroforetyczne:



Elektroforeza żelowa jest często stosowana w
diagnostyce białek osocza. Próbka nanoszona jest
wąskim pasmem na matrycę (podłoże) i poddawana
elektroforezie w tym podłożu, które jest zwykle żelem
poliakrylamidowym lub agarozowym. Po
elektroforezie białka są wybarwiane. Poszczególne
białka ukazują się w różnych pasmach w zależności
od ich ładunku, rozmiaru i kształtu.



W izoelektrycznym ogniskowaniu, do utworzenia
gradientu wykorzystuje się kwasy
poliaminopolikarboksylowe o znanych wartościach pl.
(pl.-punkt izoelektryczny – pH w którym cząsteczka
nie ma ładunku wypadkowego i nie porusza się w
polu elektrycznym.) określone białko wędruje do
części gradientu o identycznym pl.



Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym z SDS
rozdziela białka na podstawowe ich wielkości.



Kapilarna elektroforeza cieczowa jest techniką, w
której elektroforetyczny rozdział naładowanych
cząsteczek odbywa się w stanie wolnym w roztworze
w rurkach kapilarnych o bardzo małych otworach. Do
stabilizacji sił konwekcji niepotrzebne jest podłoże
(matryca), ponieważ w kapilarach ciepło
elektroforezy szybko się rozprasza.

4) Rozdział przez swoistą zdolność wiązania

(powinowactwo)



Chromatografia powinowactwa (adsorpcyjna)



Technika ta jest oparta na właściwości jaką mają niektóra

białka, a mianowicie możliwości silnego łączenia się z

inną cząsteczką (zwaną ligandem) przez specyficzne,

niekowalencyjne wiązanie



Ligand jest kowalencyjnie związany z powierzchnią

większych nawodnionych cząstek porowatego materiału,

tworząc kolumnę chromatograficzną. Jeżeli roztwór

zawierający mieszaninę białek jest przepuszczany przez

kolumnę, badane białko selektywnie absorbuje się i wiąże

z cząsteczkami liganda, podczas gdy inne białka

przepływają przez kolumnę bez przeszkód. Po odpłukaniu

resztek innych białek zaabsorbowane białko może być

wymyte bardziej stężonym roztworem czystego liganda,

który współzawodniczy o białko z ligandem związanym.



Precypitacja przeciwciałami



Przeciwciała to swoiste białka, które można otrzymać i
użyć do reakcji z żądanym białkiem, znajdującym się
w mieszaninie innych białek (np. wyciąg tkankowy czy
płyn ustrojowy). Interakcja białka i przeciwciała może
wytworzyć wystarczająco duży kompleks antygen-
przeciwciało, aby go oddzielić przez wirowanie,
umożliwiając odzyskanie poszukiwanego białka.



Do utworzenia większego kompleksu niż kompleks
antygen przeciwciało konieczne jest często dodanie
króliczych globulin anty-gamma do mieszaniny
przeciwciała z białkiem i odzyskania tego potrójnego
kompleksu przez wirowanie.



Podobnie jak ligand przeciwciała mogą być
przytwierdzone do nawodnionych matryc i tworzyć
kolumny w chromatografii powinowactwa.

Paulina Sołtys