2009-12-01

1

M

ETODY OZNACZANIA BIAŁEK

Metoda biuretowa

´

Metoda biuretowa

´

Metoda Lowrego (Folin-Ciocalteu)

´

Metoda z użyciem kwasu bis-cynchoninowego (BCA)

´

Metoda Bradforda

´

Absorpcja w nadfiolecie

´

Metoda turbidymetryczna

´

Metoda nefelometryczna

M

ETODA BIURETOWA

Wiązanie peptydowe

Łańcuch peptydowy

Barwny kompleks (kolor fioletowy)

2009-12-01

2

M

ETODA BIURETOWA

´

Skład odczynnika :

CuSO4, winian sodowo – potasowy, NaOH, KJ (

winian sodowo-potasowy - stabilizator,

KJ zapobiega autoredukcji alkalicznego kompleksu miedzi)

KJ zapobiega autoredukcji alkalicznego kompleksu miedzi)

´

Pomiar absorbancji – 540 nm

_________________________________________

´

Czułość metody: 2 - 15 g/L

´

Stosunkowo mało substancji interferujących

(sole amonowe, jony magnezu, biuret)

´

Intensywność barwy powstałego kompleksu nie zależy od składu

´

Intensywność barwy powstałego kompleksu nie zależy od składu

aminokwasowego oznaczanego białka

´

Metoda tania, nieskomplikowana, niewątpliwą jej zaletą jest również

możliwość przystosowania do suchej chemii

´

Metoda użyteczna również do oznaczania peptydów

M

ETODA BIURETOWA

Zastosowanie:

oznaczanie białka całkowitego w surowicy

(wartość referencyjna: 60-80 g/L)

HITACHI

-902

2009-12-01

3

M

ETODA BIURETOWA

Oznaczanie białka:

PMR wartość referencyjna: 0 15 - 0 45 g/l

VITROS 5,1 FS Chemistry System

PMR – wartość referencyjna: 0,15 - 0,45 g/l

M

ETODA

L

OWRY

’

EGO

(F

OLIN

-C

IOCALTEU

)

1.

2

. j

ony Cu

redukują kwas fosforowolframowy i fosforomolibdenowy do

barwnych (niebieskich) tlenków – reakcja katalizowana przez tyrozynę,
tryptofan, cysteinę i prawdopodobnie histydynę zawarte w oznaczanym
białku

+

2009-12-01

4

M

ETODA

L

OWRY

’

EGO

(F

OLIN

-C

IOCALTEU

)

´

Skład odczynników:

9

CuSO4 ,winian sodowo – potasowy, NaOH, Na

2

CO

3

9

odczynnik Folin-Ciocalteu (mieszanina kwasu fosfowolframowego i kwasu
fosfomolibdenowego)

fosfomolibdenowego)

´

Ponieważ odczynnik Folin-Ciocalteu nie jest stabilny w środowisku alkaicznym, musi

być prowadzona jako reakcja dwuetapowa

´

Stężenie barwnego produktu mierzy się spektrofotometrycznie przy długości fali

750 nm

_______________________________________________

´

Metoda bardziej czuła niż metoda biuretowa: 10mg/L – 1 g/L

´

Znacznie więcej substancji interferujących (np. Tris, HEPES, EDTA, SDS i inne

ę j

j

ją y

( p

,

,

,

detergenty, mocznik, DTT, merkaptoetanol, związki tiolowe, redukujące cukry),

reakcja wymaga ścisłej kontroli pH

´

Proces dwuetapowy – więc bardziej czasochłonny

´

Trudna do automatyzacji

´

Natężenie powstałej barwy różna dla różnych białek (zależy od zawartości

aminokwasów: tyrozyny, tryptofanu, cysteiny – problemy z otrzymaniem

uniwersalnej krzywej kalibracyjnej)

M

ETODA Z UŻYCIEM KWASU BIS

-

CYNCHONINOWEGO

(BCA)

Fioletowo – niebieski barwny kompleks

Fioletowo niebieski barwny kompleks

2009-12-01

5

M

ETODA Z UŻYCIEM KWASU BIS

-

CYNCHONINOWEGO

(BCA)

´

Skład odczynnika:

Na2CO3 NaOH Na C H O CuSO4 BCA

Na2CO3, NaOH , Na

2

C

4

H

4

O

6 ,

CuSO4, BCA

´

Pomiar absorbancji – 562 nm

___________________________________________________

´

Czułość metody 0,1–1 g/L lub 0,5 – 10 mg/L

´

Niewielkie różnice współczynnika absorpcji dla różnych białek

´

Reakcja jednoetapowa - kompleks jest stabilny w środowisku alkaicznym

´

Znacznie większa tolerancja metody na większość czynników

interferujących z metoda Lowry’ego (przede wszystkim detergenty)

interferujących z metoda Lowry ego (przede wszystkim detergenty)

´

Możliwość automatyzacji metody

´

Niemożność przeprowadzenia reakcji w temperaturze pokojowej (37 °C,

wyższa temperatura przyspiesza reakcję – możliwość modyfikacji)

M

ETODA

B

RADFORDA

2009-12-01

6

1.2

odczynnik Bradforda +BSA (12

μg/ml)

odczynnik Bradforda

M

ETODA

B

RADFORDA

0.4

0.6

0.8

1.0

A

400

450

500

550

600

650

700

0.0

0.2

nm

´

Skład odczynnika:

C

i B ill t Bl

G 250 95% t

l 85% k

M

ETODA

B

RADFORDA

Coommassie Brillant Blue G- 250, 95% etanol, 85% kwas

fosforowy

´

Pomiar absorbancji – 595 nm

_________________________________________________________

_______

´

Szeroko stosowana – łatwa w przygotowaniu, wysoce specyficzna

dla białek

´

Duża czułość metody:

1-10 µg (micrometoda) 10-100 µg

y

µg (

)

µg

(macrometoda)

´

Test kompatybilny z większością substancji interferujących w

metodach Lowrego i BCA

2009-12-01

7

´

Nieliniowa krzywa kalibracyjna

M

ETODA

B

RADFORDA

´

Współczynnik absorpcji ściśle zależy

od rodzaju mierzonego białka (przede

wszystkim od zawartości takich

aminokwasów jak lizyna i arginina w

białku), bardzo ważny dobór

d

i d i j k

j k lib

j j

odpowiedniej krzywej kalibracyjnej

´

Ważny czas prowadzenia reakcji –

kompleks barwnik – białko jest

stabilny przez około 1 godzinę

2009-12-01

8

A

BSORBANCJA W NADFIOLECIE

´

Pomiar absorbancji roztworu białka przy długości fali 280 nm

´

Używana do oszacowania stężenia białka, lub do detekcji np.

przez detektor HPLC

´

Światło absorbowane jest przede wszystkim przez

aromatyczne aminokwasy obecne w białku (tyrozyna,

tryptofan)

´

Metoda najmniej czuła ze wszystkich wcześniej

wymienionych

wymienionych

´

Znaczna ilość substancji interferujących (np. kwasy

nukleinowe)

M

ETODA

N

EFELOMETRYCZNA

´

Zasada metody: wykorzystuje efekt Tyndalla – zjawisko

´

Zasada metody: wykorzystuje efekt Tyndalla zjawisko
rozpraszania się światła na cząstkach fazy rozproszonej.

´

Jest metodą analityczną polegającą na pomiarze natężenia
światła rozproszonego przez zawiesinę pod kątem różnym od
180 stopni w stosunku do warstwy padającej (najczęściej pod
kątem 90 lub 45 stopni).

´

Pomiar natężenia światła rozproszonego może być

´

Pomiar natężenia światła rozproszonego może być
wykorzystywany do oznaczania stężenia, a także do określania
stopnia rozdrobnienia koloidów, gdyż natężenie światła
rozproszonego zależy od wielkości cząstek substancji
rozpraszającej.

2009-12-01

9

M

ETODA

N

EFELOMETRYCZNA

´

Najpopularniejszy analizator – BEHRING Nephelometer II
(immunonefelometria)

´

Szeroki panel oznaczanych białek:

(albumina, prealbumina, CRP (hs CRP), transferyna, immunoglobuliny,

transferyna, ceruloplazmina, haptoglobina, składniki dopełniacza, SAA,
cystatyna C,beta2 mikroglobulina, alfa1 maktoglobulina, łańcuchy lekkie
immunoglobulin – kappa, lambda)

´

Wykorzystywany materiał – surowica/ osocze, mocz, PMR

´

Nie nadaje się do oznaczeń w roztworach wstępnie mętnych
(lipemia)

Krzywa Heidelberga

M

ETODA

N

EFELOMETRYCZNA

2009-12-01

10

´

Zasada metody:

I

0

M

ETODA

T

URBIDYMETRYCZNA

I nefelometria

I nefelometria

I turbidymetria

9

Metoda zmętnieniowa: z użyciem kwasu TCA (trichlorooctowego),

kwasu sulfosalicylowego, chlorku benzetonium (NaOH)
9

Zastosowanie: pomiar białka całkowitego w moczu, PMR

(analizator Hitachi – Roche Diagnostics)
9

Liniowość w zakresie 2 – 200 mg/dl