2009-12-01

1

M

ETODY OZNACZANIA BIAŁEK

Metoda biuretowa

´

Metoda biuretowa

´

Metoda Lowrego (Folin-Ciocalteu)

´

Metoda z użyciem kwasu bis-cynchoninowego (BCA) 

´

Metoda Bradforda

´

Absorpcja w nadfiolecie

´

Metoda turbidymetryczna

´

Metoda nefelometryczna

M

ETODA BIURETOWA

Wiązanie peptydowe

Łańcuch peptydowy

Barwny kompleks (kolor fioletowy)

2009-12-01

2

M

ETODA BIURETOWA

´

Skład odczynnika : 

CuSO4, winian sodowo – potasowy, NaOH, KJ (

winian sodowo-potasowy - stabilizator, 

KJ zapobiega autoredukcji alkalicznego kompleksu miedzi)

KJ zapobiega autoredukcji alkalicznego kompleksu miedzi)

´

Pomiar absorbancji – 540 nm

_________________________________________

´

Czułość metody: 2 - 15 g/L

´

Stosunkowo mało substancji interferujących 

(sole amonowe, jony magnezu, biuret)

´

Intensywność barwy powstałego kompleksu nie zależy od składu 

´

Intensywność barwy powstałego kompleksu nie zależy od składu 

aminokwasowego oznaczanego białka 

´

Metoda tania,  nieskomplikowana, niewątpliwą jej zaletą jest również 

możliwość przystosowania do suchej chemii

´

Metoda użyteczna również do oznaczania peptydów

M

ETODA BIURETOWA

Zastosowanie:

oznaczanie białka całkowitego w surowicy  

(wartość referencyjna: 60-80 g/L)

HITACHI

-902

2009-12-01

3

M

ETODA BIURETOWA

Oznaczanie białka: 

PMR wartość referencyjna: 0 15 - 0 45 g/l

VITROS 5,1 FS Chemistry System

PMR – wartość referencyjna: 0,15 - 0,45 g/l

M

ETODA

L

OWRY

’

EGO

(F

OLIN

-C

IOCALTEU

)

1.

2

. j

ony Cu

redukują kwas fosforowolframowy i fosforomolibdenowy do

barwnych (niebieskich) tlenków – reakcja katalizowana przez tyrozynę,
tryptofan, cysteinę i prawdopodobnie histydynę zawarte w oznaczanym
białku

+

2009-12-01

4

M

ETODA

L

OWRY

’

EGO

(F

OLIN

-C

IOCALTEU

)

´

Skład odczynników:

9

CuSO4 ,winian sodowo – potasowy, NaOH, Na

2

CO

3

9

odczynnik Folin-Ciocalteu  (mieszanina kwasu fosfowolframowego i kwasu 
fosfomolibdenowego)

fosfomolibdenowego)

´

Ponieważ odczynnik Folin-Ciocalteu nie jest stabilny w środowisku alkaicznym, musi 

być prowadzona jako reakcja dwuetapowa

´

Stężenie barwnego produktu mierzy się spektrofotometrycznie przy długości fali 

750 nm

_______________________________________________

´

Metoda bardziej czuła niż metoda biuretowa: 10mg/L – 1 g/L

´

Znacznie więcej substancji interferujących (np. Tris, HEPES, EDTA, SDS i inne 

ę j

j

ją y

( p

,

,

,

detergenty, mocznik, DTT, merkaptoetanol, związki tiolowe, redukujące cukry), 

reakcja wymaga ścisłej kontroli pH

´

Proces dwuetapowy – więc bardziej czasochłonny

´

Trudna do automatyzacji

´

Natężenie powstałej barwy różna dla różnych białek (zależy od zawartości 

aminokwasów: tyrozyny, tryptofanu, cysteiny – problemy z otrzymaniem 

uniwersalnej krzywej kalibracyjnej) 

M

ETODA Z UŻYCIEM KWASU BIS

-

CYNCHONINOWEGO

(BCA)

Fioletowo – niebieski barwny kompleks

Fioletowo  niebieski barwny kompleks 

2009-12-01

5

M

ETODA Z UŻYCIEM KWASU BIS

-

CYNCHONINOWEGO

(BCA)

´

Skład odczynnika:

Na2CO3 NaOH  Na C H O CuSO4  BCA

Na2CO3, NaOH , Na

2

C

4

H

4

O

6 , 

CuSO4, BCA

´

Pomiar absorbancji – 562 nm

___________________________________________________

´

Czułość metody 0,1–1 g/L  lub 0,5 – 10 mg/L 

´

Niewielkie różnice współczynnika absorpcji dla różnych białek 

´

Reakcja jednoetapowa - kompleks jest stabilny w środowisku alkaicznym 

´

Znacznie większa tolerancja metody na większość czynników 

interferujących z metoda Lowry’ego (przede wszystkim detergenty)

interferujących z metoda Lowry ego (przede wszystkim detergenty)

´

Możliwość automatyzacji metody

´

Niemożność przeprowadzenia reakcji w temperaturze pokojowej (37 °C, 

wyższa temperatura przyspiesza reakcję  – możliwość modyfikacji)

M

ETODA

B

RADFORDA

2009-12-01

6

1.2

odczynnik Bradforda +BSA (12

μg/ml)

odczynnik Bradforda

M

ETODA

B

RADFORDA

0.4

0.6

0.8

1.0

 

A

400

450

500

550

600

650

700

0.0

0.2

nm

´

Skład odczynnika:

C

i B ill t    Bl

G 250   95%  t

l   85% k

 

M

ETODA

B

RADFORDA

Coommassie Brillant  Blue G- 250,  95% etanol,  85% kwas 

fosforowy

´

Pomiar absorbancji – 595 nm

_________________________________________________________

_______

´

Szeroko stosowana – łatwa w przygotowaniu, wysoce specyficzna 

dla białek

´

Duża czułość  metody:

1-10 µg (micrometoda) 10-100 µg 

y

µg (

)

µg

(macrometoda)

´

Test kompatybilny z większością substancji interferujących w 

metodach Lowrego i BCA

2009-12-01

7

´

Nieliniowa krzywa kalibracyjna 

M

ETODA

B

RADFORDA

´

Współczynnik absorpcji ściśle zależy 

od rodzaju mierzonego białka (przede 

wszystkim od zawartości takich 

aminokwasów jak lizyna i arginina w 

białku), bardzo ważny dobór 

d

i d i j  k

j  k lib

j j

odpowiedniej krzywej kalibracyjnej

´

Ważny czas prowadzenia reakcji –

kompleks barwnik – białko jest 

stabilny przez około 1 godzinę

2009-12-01

8

A

BSORBANCJA W NADFIOLECIE

´

Pomiar absorbancji roztworu białka przy długości fali 280 nm

´

Używana do oszacowania stężenia białka, lub do detekcji np. 

przez detektor HPLC

´

Światło absorbowane jest przede wszystkim przez 

aromatyczne aminokwasy obecne w białku (tyrozyna, 

tryptofan) 

´

Metoda najmniej czuła ze wszystkich wcześniej 

wymienionych 

wymienionych 

´

Znaczna ilość substancji interferujących (np. kwasy 

nukleinowe)

M

ETODA

N

EFELOMETRYCZNA

´

Zasada metody: wykorzystuje efekt Tyndalla – zjawisko 

´

Zasada metody: wykorzystuje efekt Tyndalla  zjawisko 
rozpraszania się światła na cząstkach fazy rozproszonej.

´

Jest metodą analityczną polegającą na pomiarze natężenia 
światła rozproszonego przez zawiesinę pod kątem różnym od 
180 stopni w stosunku do warstwy padającej (najczęściej pod 
kątem 90 lub 45 stopni). 

´

Pomiar natężenia światła rozproszonego może być 

´

Pomiar natężenia światła rozproszonego może być 
wykorzystywany do oznaczania stężenia, a także do określania 
stopnia rozdrobnienia koloidów, gdyż natężenie światła 
rozproszonego zależy od wielkości cząstek substancji 
rozpraszającej. 

2009-12-01

9

M

ETODA

N

EFELOMETRYCZNA

´

Najpopularniejszy analizator – BEHRING Nephelometer II 
(immunonefelometria)

´

Szeroki panel oznaczanych białek: 

(albumina, prealbumina, CRP (hs CRP), transferyna, immunoglobuliny, 

transferyna, ceruloplazmina, haptoglobina, składniki dopełniacza, SAA, 
cystatyna C,beta2 mikroglobulina, alfa1 maktoglobulina, łańcuchy lekkie 
immunoglobulin – kappa, lambda)

´

Wykorzystywany materiał – surowica/ osocze, mocz, PMR

´

Nie nadaje się do oznaczeń w roztworach wstępnie mętnych 
(lipemia)

Krzywa Heidelberga

M

ETODA

N

EFELOMETRYCZNA

2009-12-01

10

´

Zasada metody:

I

0

M

ETODA

T

URBIDYMETRYCZNA

I nefelometria

I nefelometria

I turbidymetria

9

Metoda zmętnieniowa: z użyciem kwasu TCA (trichlorooctowego), 

kwasu sulfosalicylowego, chlorku benzetonium (NaOH) 
9

Zastosowanie: pomiar białka całkowitego w moczu, PMR 

(analizator Hitachi – Roche Diagnostics)
9

Liniowość w zakresie 2 – 200 mg/dl