JAKOŚCIOWE I ILOŚCIOWE METODY OZNACZANIA ANTYGENÓW OPARTE NA TWORZENIU IMMUNOPRECYPITATÓW

Tworzenie się immunoprecypitatów antygen-przeciwciało

Etap 1: tworzenie pojedynczych kompleksów Ag-Ab

Etap 2: kompleksy Ag-Ab agregują

Etap 3: utworzenie sieci makromolekularnej - nierozpuszczalnych kompleksów, które bardzo łatwo precypitują

Reakcje precypitacji wykonuje się w żelu agarozowym. Żel jest strukturą porowatą wypełnioną roztworem elektrolitu o odpowiednim składzie i pH i stanowi środowisko, w którym dochodzi do dyfuzji antygenu i przeciwciała. Przy równoważnej ilości reagentów powstaje nierozpuszczalny osad w postaci wyraźnej linii lub smugi precypitacyjnej, która pojawia się na granicy stref dyfuzyjnych antygenu i przeciwciała.

Kompleks Ag-Ab może powstać jedynie przy określonym stosunku ilościowym obydwu reagentów.

Krzywa precypitacji Heildelberga

W układzie, w którym stała ilość przeciwciała reaguje ze wzrastającą ilością rozpuszczalnego antygenu wyróżniamy 3 strefy:

1. Strefa nadmiaru przeciwciał

2. Strefa równowagi (ekwiwalencji) - cała pula przeciwciał obecnych w układzie jest wysycona antygenem i kompleksy ulegają precypitacji

3. Strefa nadmiaru antygenu (kompleksów rozpuszczalnych)

1. Podwójna dyfuzja według Ouchterlony'ego

Zarówno antygeny, jak i przeciwciała mają zdolność swobodnej dyfuzji w żelu agarozowym lub agarowym. Po naniesieniu ich do oddzielnych, okrągłych otworków o identycznej średnicy, położonych w standardowej odległości 1 cm, będą się rozchodzić w żelu promieniście we wszystkich kierunkach. W miejscu spotkania antygenu i specyficznego względem niego przeciwciała, gdy ich proporcje są optymalne, tworzą kompleksy antygen-przeciwciało, które następnie ulegają precypitacji i są widoczne w postaci białych, lekko opalizujących linii precypitacyjnych (łuków precypitacyjnych).

Test Ouchterlony'ego pozwala stwierdzić:

• czy przeciwciało jest swoiste w stosunku do analizowanego antygenu

• czy w roztworze znajduje się antygen zdolny do rekcji z przeciwciałem znanej specyficzności

• stopień podobieństwa antygenowego na podstawie położenia powstałych łuków precypitacyjnych

W reakcji podwójnej dyfuzji w żelu agarozowym w zależności od puli zastosowanych antygenów i przeciwciał można wyróżnić trzy typy reakcji:

1. Reakcja identyczności = gdy występuje układ takich samych antygenów rozpoznawanych przez specyficzne przeciwciało. Powstające łuki precypitacyjne zlewają się końcami i tworzą łuk w kształcie litery V, który jest wyrazem antygenowej zgodności. Oba antygeny zawierają identyczne epitopy. W reakcji identyczności dwa takie same antygeny dyfundują w agarze z tą samą prędkością. Jeżeli stężenia antygenów są różne może się utworzyć niesymetryczny łuk precypitacyjny.

2. Reakcja braku identyczności (braku zgodności) - zachodzi, gdy porównywane antygeny są całkowicie odmienne pod względem struktury antygenowej (posiadają odmienne epitopy) i nie maja wspólnych determinant, natomiast użyta surowica jest poliwalentna i zawiera przeciwciała specyficzne dla każdego z nich. Powstaje obraz linii precypitacyjnych, które krzyżują się, co potwierdza niezależność układów precypitacyjnych.

3. Reakcja częściowej identyczności (częściowej zgodności) - gdy porównywane antygeny są częściowo pokrewne pod względem struktury (zawierają częśiowo identyczne epitopy). Powstaje precypitat zakończony ostrogą po stronie antygenu zawierającego więcej determinant antygenowych rozpoznawanych przez użyte przeciwciało. Wielkość i położenie ostrogi wskazuje antygen zawierający więcej determinant rozpoznawanych przez przeciwciała.

Ilość linii precypitacyjnych jest zależna od ilości i rodzaju przeciwciał obecnych w surowicy odpornościowej oraz badanej substancji antygenowej. Odczyn precypitacyjny zachodzący w żelu pozwala na jednoczesną analizę wielu układów antygen-przeciwciało. W przypadku antygenów o zbliżonej masie cząsteczkowej linie precypitacyjne nachodzą na siebie i mogą się zlewać.

II. Ilościowa immunodyfuzja radialna (test Mancini)

Pozwala na oznaczenie stężenia antygenu w materiale biologicznym. Metodą radialnej immunodyfuzji oznacza się białka w płynach ustrojowych w tym również immunoglobulin, które w tym przypadku są traktowane jako antygeny. Immunoglobuliny są oznaczane w surowicy, moczu, płynie mózgowo-rdzeniowym.

Metoda opiera się na pomiarze pierścienia precypitacyjnego powstałego w agar ozie w wyniku reakcji między antygenem i i specyficznym w stosunku do niego przeciwciałem.

Do żelu dodaje się przeciwciała poliklonalne, specyficzne wobec antygeny, którego stężenie chce się oznaczyć.

Antygeny dodane do otworków wyciętych w żelu z przeciwciałami dyfundują promieniście we wszystkich kierunkach. Szybkość dyfuzji w żelu zależy od jego gęstości i od masy cząsteczkowej antygenu. Odległość na jaką będą dyfundowały antygeny zależy od ich stężenia w badanym materiale i ilości przeciwciał w żelu. Antygeny wędrują do momentu osiągnięcia strefy równowagi i wtedy można obserwować powstawanie kręgów precypitacyjnych, których średnica jest proporcjonalna do stężenia antygenu.

Istnieją różnice w czasie dyfuzji dla poszczególnych antygenów i przeciwciał - wynikają one głównie z różnic masy cząsteczkowej i awidności przeciwciał:

- do oznaczania IgG potrzeba 24-48 godzin

- do oznaczania ₂-makroglobuliny 48-80 godzin

Oznaczenia powinno się wykonywać przy dwóch różnych rozcieńczeniach próby - po przeliczeniu uwzględniającym rozcieńczenie wynik powinien być identyczny.

Równolegle z badanymi próbami wykonuje się test z użyciem rozcieńczonego wzorca - w celu sporządzenia krzywej wzorcowej (3-5 punktowej), która jest wykresem zależności średnicy powstałego precypitatu od stężenia antygenu w próbach wzorcowych.

Metodą Mancini najczęściej oznacza się stężenie: albuminy, składowych dopełniacza, kwaśnej ₁-glikoproteiny, ₁-antychymotrypsyny, apolipoprotein, CRP, haptoglobiny, ceruloplazminy, transferryny, fibronektyny, lizozymu, immunoglobulin IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, podklas immunoglobulin: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, łańcuchów lekkich immunoglobulin kappa i lambda.

III. Elektroimmunodyfuzja (elektroforeza przeciwprądowa)

Przy zastosowanej w teście wartości pH oznaczane antygeny i używane do ich wykrycia specyficzne przeciwciała są obdarzone przeciwnym ładunkiem. Czułość elektroforezy przeciwprądowej jest 10-20 razy większa niż podwójnej immunodyfuzji.

Elektroimmunodyfuzję przeprowadza się w żelu agarozowym w buforze, którego pH musi znajdować się pomiędzy pI_Ag a pI_Ab - najczęściej stosowany jest bufor weronalowy o pH wynoszącym 7,5-8,0. Przy takim pH większość antygenów (np. białka surowicy) ma ładunek ujemny, natomiast większość przeciwciał ma ładunek dodatni. Antygeny umieszcza się w dołku po stronie elektrody ujemnej natomiast przeciwciała od strony elektrody dodatniej. Po podłączeniu napięcia antygeny i przeciwciała będą wędrować w kierunku przeciwnych elektrod i zbliżać się do siebie - w miejscu spotkania powstają kompleksy Ag-Ab, które precypitują w krótkim czasie po zakończeniu elektroforezy.

Elektroimmunodyfuzja radialna może być wykorzystana do badania, czy w danym materiale znajduje się poszukiwany antygen - na przykład przeciwciała przeciwjądrowe (w chorobach autoimmunologicznych).

METODY IMMUNOCHEMICZNE FAZY PŁYNNEJ

Metoda immunoturbidymetryczna i immunonefelometryczna

Roztwory antygenów i przeciwciał, będąc koloidami, powodują rozpraszanie wiązki światła. Jeśli w tej samej kuwecie umieścimy równocześnie antygen i komplementarne względem niego przeciwciało, powstające w roztworze kompleksy antygen - przeciwciało będą wykazywały zwiększone rozpraszanie wiązki światła, w porównaniu do wyjściowych roztworów zawierających tylko sam antygen lub przeciwciało.

Natężenie światła rozproszonego zależy wprost proporcjonalnie od stężenia cząstek substancji rozpraszającej oraz od wielkości tych cząstek. Zatem pomiary natężenia światła rozproszonego można wykorzystać do oznaczania stężenia antygenu w badanym roztworze. Zależność ta jest prawdziwa dla roztworów bardzo rozcieńczonych, ponieważ gdy stężenie cząsteczek w roztworze jest zbyt duże, cząstki znajdujące się najbliżej źródła światła będą powodowały całkowite rozproszenie wiązki światła, które nie dotrze do cząstek leżących głębiej. Zbyt duże stężenie cząstek koloidalnych w roztworze będzie powodowało powstawanie zbyt dużej liczby kompleksów, co z kolei doprowadzi do zafałszowania odczytu (do zaniżenia stężenia).

Na wartość natężenia promieniowania rozproszonego mają wpływ warunki otrzymywania koloidów oraz warunki, w których dochodzi do tworzenia kompleksów, m.in.: temperatura, siła jonowa, pH roztworu, sposób i kolejność dodawania odczynników, czas jaki upłynął od ich wprowadzenia, stężenie substancji tworzącej koloid.

Podczas oznaczeń techniką nefelometryczną lub turbidymetrycznąoznaczając stężenie antygenu należy równocześnie wykonać krzywą kalibracyjną. Konieczne jest również stosowanie się do wykresu precypitacji Heidelbergera, charakterystycznego dla danego układu Ag-Ab - odczytu wyniku precypitacji dokonuje się tylko w liniowym zakresie precypitacji, przy nadmiarze przeciwciał. Pomiar stężenia w zakresie strefy ekwiwalencji i przy nadmiarze antygenu, gdzie zależność pomiędzy stężeniem antygenu a ilością powstałych kompleksów Ag-Ab nie ma charakteru liniowego, jest niemożliwy. W przypadku dużego stężenia antygenu w próbie utworzone kompleksy Ag-Ab ulegają częściowemu rozbiciu, w wyniku czego obserwuje się fałszywie małe wartości stężenia antygenu (tzw, efekt prostrefowy).

Metodami nefelometryczną i turbidymetryczną można oznaczać stężenie antygenów rozpuszczalnych w materiale biologicznym (w surowicy, moczu, płynie mózgowo-rdzeniowym, płynie owodniowym)

Rutynowo oznacza się stężenie:

Albuminy, składowych dopełniacza C3 i C4, haptoglobiny, ceruloplazminy, transferryny, immunoglobulin IgG, IgM, IgA, łańcuchów lekkich immunoglobulin, _-mikroglobuliny, apolipoprotein.

W metodach o zwiększonej czułości (dzięki użyciu kuleczek karboksylowanego lateksu, do których mogą być umocowane są antygeny lub przeciwciała) oznacza się między innymi stężenia takich antygenów jak białko C-reaktywne, ferrytyna, czynnik reumatoidalny (RF) klasy IgG i IgM, antystreptolizyny O (ASO).

Czułość technik z karboksylowanymi cząsteczkami lateksu jest porównywalna z czułością metod z użyciem znaczników (enzymów, pierwiastków promieniotwórczych).

METODY IMMUNOELEKTROFORETYCZNE

Większość odmian immunoelektroforezy przebiega w 2 etapach:

1. Elektroforezy żelowej - roztwór antygenu lub mieszaniny antygenów nanosi się do studzienek w żelu agarozowym i umieszcza się w polu elektrycznym (rozdział w zależności od ich ruchliwości elektroforetycznej)

2. Immunoprecypitacji - obecnoć antygenów jest wykrywana za pomocą specyficznych przeciwciał - tworzą się nierozpuszczalne immunoprecypitaty. Etap ten może być realizowany podczas:

• swobodnej immunodyfuzji obydwu reagentów (immunoelektroforeza prosta)

• w miejscu położenia antygenu w żelu w wyniku immunoprecypitacji przez przeciwciało in situ (immunofiksacja)

• wymuszonej wędrówki antygenu w polu elektrycznym przez żel zawierający przeciwciała (immunoelektroforeza rakietowa, immunoelektroforeza dwuwymiarowa)

I. Immunoelektroforeza prosta (IEP)

Elektroforeza antygenów w żelu agarozowym, a następnie swobodna immunodyfuzja antygenów rozdzielonych podczas EF i przeciwciał dodawanych w etapie drugim (do rowka w żelu biegnącego równolegle do kierunku rozdziału elektroforetycznego). Antygeny tworzą precypitaty ze specyficznymi, komplementarnymi przeciwciałami (skierowanymi wybiórczo przeciwko poszczególnym białkom). W miejscu spotkania antygenu i przeciwciała tworzą się łuki precypitacyjne. Każda linia precypitacyjna powstaje niezależnie, w wyniku indywidualnej reakcji komplementarnej pary antygen-przeciwciało.

Ocena uzyskanego preparatu opiera się na porównaniu położenia i kształtu łuków precypitacyjnych utworzonych przez analizowane białka z odpowiadającymi im łukami w płynie wzorcowym (np. surowicy zdrowego człowieka) powstałymi podczas tego samego badania i w tych samych warunkach.

Przy ocenie bierze się pod uwagę zmiany jakościowe i ilościowe, które mogą być wyrażone przez:

- obecność lub brak linii precypitacyjnej

- szerokość, kształt, położenie łuku, ostrość linii

- intensywnośc barwy precypitatu

- zmiany w ruchliwości elektroforetycznej linii precypitacyjnej

- pojawianie się łuków dodatkowych

Zastosowanie immunoelektroforezy prostej:

- wykrywanie zaburzeń w biosyntezie białek

- wykrywanie dysproteinemii

- potwierdzenie paraproteinemii

- identyfikacja białka monoklonalnego

II. Immunofiksacja (IFE)

Metoda, w której po elektroforezie antygenów w żelu agarozowym następuje ich immunoprecypitacja in situ. Metoda ta służy do:

- identyfikacji i charakterystyki białek płynów ustrojowych (wykrywanie dysprotein)

- identyfikacja i charakterystyka patologicznych immunoglobulin w surowicy, moczu,

płynie mózgowo-rdzeniowym np. białka monoklonalnego w szpiczaku mnogim

Wykonanie:

- nałożenie analizowanej próbki (surowicy, moczu) w odpowiednich rozcieńczeniach i

identycznej ilości w kilku (najczęściej 6) miejscach startowych

- podczas elektroforezy następuje rozdział białek na frakcje - uzyskuje się identyczny

rozdział na wszystkich ścieżkach

- jedna z dróg rozdziału stanowi rozdział referencyjny dla danego pacjenta (utrwala się go i barwi)

- powierzchnie pozostałych ścieżek pokrywa się roztworami swoistych przeciwciał

- przeciwciała dyfundują w głąb żelu i tworzą immunoprecypitaty z odpowiadającymi im antygenami (pod warunkiem, że antygen jest obecny i reakcja zachodzi w proporcjach ekwimolarnych

- po wypłukaniu nadmiaru reagentów (przeciwciał, białek) żel się suszy i barwi (barwienie ujawnia tylko te białka, które uległy immunofiksacji na skutek immobilizacji w żelu przez swoiste przeciwciało dowodząc, lub nie obecności antygenu

III. Immunoelektroforeza rakietowa według Laurella

Połączenie dwóch technik: radialnej immunodyfuzji i elektroforezy. Jest to metoda ilościowa pozwalająca na bezpośrednie oznaczenie stężenia antygenu białkowego w badanym materiale biologicznym. Antygen przemieszcza się w żelu zawierającym unieruchomione przeciwciała - stężenie antygenu określa się na podstawie wysokości szczytów precypitacyjnych powstałych wtedy, gdy antygen zostanie w całości związany przez przeciwciała.

Do dołków wyciętych z jednej strony płytki nanosi się roztwory antygenów badanych, wzorcowych i kontrolnej (pH układu wynosi 8,0-8,6). Po umieszczeniu płytki w polu elektrycznym antygeny wędrują do anody wiążąc się po drodze z przeciwciałami znajdującymi się w żelu. Po zakończeniu elektroforezy obserwuje się powstawanie kompleksów antygen-przeciwciało (w strefie równowagi) w postaci rakiet. Wysokość i pole powierzchni pod powstałą rakietą są wprost proporcjonalne do stężenia antygenu w próbie.

Immunoelektroforeza rakietowa nie jest stosowana do oznaczania immunoglobulin ponieważ nie wędrują lub wędrują bardzo słabo w warunkach oznaczenia = ich punkty izoelektryczne są zbliżone lub równe pH użytego buforu.

IV. Immunoelektroforeza dwuwymiarowa (immunoelektroforeza krzyżowa)

Modyfikacja metody rakietowej. Składa się z dwóch etapów: elektroforezy w żelu agarozowym, a następnie elektroforezy rozdzielonych składników w pierwszym etapie w żelu II wymiaru, zawierającym specyficzne przeciwciała.

Wykonanie:

- rozdział elektroforetyczny mieszaniny antygenów w żelu agarozowym (elektroforeza

I wymiaru)

- po jej zakończeniu żel tnie się na paski odpowiadajże ścieżkom z rozdzielonymi

białkami

- paski żelu przenosi się i układa pod kątem 90° na brzegu drugiej płytki

- na niewypełnioną paskami powierzchnię płytki wylewamy żel agarozę zawierającą specyficzne przeciwciała

- białka próby badanej ponownie poddaje się elektroforezie (w warunkach EF przeciwciała nie poruszają się w polu elektrycznym) - jest to elektroforeza II wymiaru (jej kierunek jest prostopadły do kierunku EF I wymiaru)

- antygeny wędrują w żelu i wiążą się z przeciwciałami - tworzą się linie immunoprecypitacyjne (każde biało tworzy precypitat oddzielnie)

- płytkę płucze się, suszy i barwi

Zastosowanie:

- wykrywanie dysproteinemii

- charakterystyka antygenów

IMMUNOENZYMATYCZNE TESTY FAZY STAŁEJ (ELISA)

Testy ELISA pozwalają na wykrywanie antygenu i określenie jego stężenia w warunkach, gdy stężenie antygenu w materiale biologicznym jest zbyt małe, aby możliwe było powstanie precypitatu w reakcji z przeciwciałem. Mogą być także stosowane do oznaczania jednowartościowych haptenów, które nie maja w ogóle zdolności tworzenia precypitatów z przeciwciałami. Zwiększenie czułości oznaczeń związane jest z unieruchomieniem (immobilizacją) antygenu na stałym podłożu („faza stała”) i zastosowaniem do detekcji znakowanych przeciwciał. Znakowanie = połączenie przeciwciała z substancją, której ilość lub aktywność można zmierzyć. Pierwsze techniki fazy stałej wykorzystywały przeciwciała znakowane pierwiastkiem promieniotwórczym, głównie izotopem jodu ¹²⁵J i trytem ³H. Potem wprowadzono znaczniki enzymatyczne - początkowo o mniejszej czułości od testów radioimmunologicznych. Obecnie stosowane systemy amplifikacyjne oraz stosowanie chemiluminescencyjnych i fluorescencyjnych substratów zapewniają bardzo wysoką czułość tych reakcji. Obecnie do znakowania ligandów detekcyjnych używa się przede wszystkim enzymów: fosfatazy alkalicznej i peroksydazy chrzanowej, a także fluorochromów, biotyny i koloidów złota.

Substraty reakcji enzymatycznej stosowane w testach immunochemicznych:

Enzym	Metoda	Związek	Odczyt () / barwa
Fosfataza alkaliczna	ELISA	p-nitrofenylofosforan sodowy (pNPP)	410 nm
		Bloting	5-bromo-4-chloro-indolilofosforan + błękit nitrotetrazoliowy (BCIP/NBT)	Barwa fioletowa
	Peroksydaza chrzanowa	ELISA	o-fenylodiamina (OFD) + H2O2	495 nm
				Tetrametylobenzydyna (TMB) + H2O2	650 nm bez przerywania reakcji lub 450 nm po przerwaniu reakcji H2SO4
			Bloting	Diaminobenzydyna (DAB) + H2O2	Barwa brązowa
				-chloronaftol + H2O2	Barwa fioletowa

HETEROGENNE I HOMOGENNE METODY OZNACZEŃ WYSOKO- I NISKOCZĄSTECZKOWYCH LIGANDÓW

Metody jednoetapowe (homogenne) są to metody, w których antygen, przeciwciało wychwytujące (AbI) i przeciwciało znakowane (AbII) są dodawane równocześnie do mieszaniny inkubacyjnej. W tych metodach nie ma potrzeby przemywania kompleksu antygen-AbI przed dodaniem AbII, bowiem charakterystyka metody pozwala śledzić sygnał na podstawie dalszej reakcji, np. enzymatycznej. Te metody są proste w wykonaniu i szybkie, ale niosą za sobą niebezpieczeństwo częstszych interferencji pochodzących od różnych substancji obecnych w surowicy. Interferujące substancje mogą bowiem wiązać się z AbI, a przez to fałszywie zawyżać wyniki lub też z AbII, i wówczas fałszywie zaniżać wyniki. Mogą też reagować z obydwoma przeciwciałami i wtedy wynik stężenia oznaczanego antygenu jest często niemożliwy do interpretacji.

Metody dwuetapowe (heterogenne) są to metody, w których po przeprowadzeniu reakcji antygen-przeciwciało wychwytujące (AbI), kompleks AgAbI jest przemywany - zatem wszystkie cząsteczki chemiczne, które nie związały się z AbI, są usuwane. Wtedy dopiero dodaje się drugie przeciwciało (AbII), które bez żadnych przeszkód może wiązać się z drugą domeną antygenu dając „kanapkę” AbIAgAbII^*. Takie postępowanie zmniejsza możliwość występowania interferencji.

WYKRYWANIE ANTYGENÓW: IMMUNOBLOTING I DOTING

Bloting (Western bloting, immunobloting) - przeniesienie elektroferogramu białek lub kwasów nukleinowych na powierzchnię membrany wiążącej.

Doting (dot-bloting) - immobilizacja białek (antygenów lub przeciwciał) na membranie wiążącej, nie poprzedzona rozdziałem elektroforetycznym.

Pierwszym etapem blotingu jest elektroforeza w żelu poliakrylamidowym. Usieciowanie żelu uniemożliwia immunodetekcję in situ, jaką stosuje się w immunofiksacji, gdyż przeciwciała nie będą dyfundowały do wnętrza żelu. Aby możliwa była identyfikacja białka za pomocą specyficznych przeciwciał, należy białka wydobyć z żelu i im mobilizować na powierzchni membrany wiążącej nie naruszając uzyskanego w elektroforezie położenia pasm. W immunodetekcji stosuje się przeciwciała do identyfikacji docelowych, analizowanych białek pośród ich heterogennej mieszaniny. Przeciwciało może być znakowane bezpośrednio. Bardziej uniwersalny i czuły system detekcji opiera się na zastosowaniu dwóch kolejnych przeciwciał, z których pierwsze rozpoznaje antygen i jednocześnie jest antygenem dla drugiego (secondary), znakowanego. Przeciwciała znakuje się enzymem, radioizotopem lub innym znacznikiem.

Zastosowanie blotingu:

- testy potwierdzenia (powtórny test w celu potwierdzenia seropozytywności) w

chorobach infekcyjnych (np. HIV, WZW-C)

- diagnostyka wrodzonych niedoborów glikozylacji

Testy immunochromatograficzne

W niektórych sytuacjach patologicznych wystarczającym wskaźnikiem diagnostycznym może być pojawienie się określonego czynnika (markera) biochemicznego w płynie ustrojowym. Do stwierdzenia jego obecności lub braku służą testy immunochromatograficzne w formie kasetek zawierających paski testowe lub samych pasków.

Testy immunochromatograficzne łączą specyficzną detekcję antygenów bądź przeciwciał z przemieszczaniem się próbki materiału biologicznego wzdłuż porowatego nośnika. W czasie wędrówki tworzy się kompleks antygenu ze znakowanym przeciwciałem, który wędrując dalej zostanie unieruchomiony w odpowiedniej pozycji paska testowego przez przyłączenie do naniesionych w tym miejscu na nitrocelulozę przeciwciał wychwytujących. Nadmiar znakowanych przeciwciał będzie się wiązał do antygenu immobilizowanego na nitrocelulozie w formie pasma kontrolnego.

Testy immunochromatograficzne - przykłady testów:

- ciążowy

- do wykrywania hormonów białkowych

- do wykrywania antygenów niektórych pasożytów lub bakterii w kale

- do wykrywania krwi utajonej w kale

Doting

Pasek testowy z naniesionymi antygenami jest inkubowany z surowicą lub innym płynem ustrojowym, a następnie z przeciwciałem detekcyjnym znakowanym enzymem. Reakcję enzymatyczną wizualizuje się za pomocą typowych substratów tworzących nierozpuszczalne produkty reakcji. Można także wykorzystywać przeciwciała znakowane złotem koloidalnym.

Zastosowanie dotingu:

- testy do identyfikacji alergenów wziewnych, na które uczulony jest pacjent

- testy stosowane w diagnostyce chorób autoimmunologicznych

METODY Z ZASTOSOWANIEM BIOSENSORÓW (RECEPTOROWE)

Bioczujniki (biosensory) to sensory chemiczne składające się z dwóch zasadniczych elementów:

• warstwy receptorowej w postaci materiału biologicznego

• przetwornika elektrycznego lub optycznego

 

Schemat ideowy biosensora.

 

Warstwa receptorowa służy do “rozpoznawania" oznaczanego związku, a przetwornik do “przetłumaczenia" sygnału biologicznego na parametr mierzalny fizycznie oraz do obróbki tego parametru. W części receptorowej sensora informacja chemiczna jest przekształcana w formę energii, która może być mierzona przez przetwornik. Reakcja analitu z częścią biologiczną przetwornika generuje w nim sygnał, który może być łatwo zmierzony, wzmocniony i zanotowany. Receptorem mogą być enzymy, najczęściej w postaci unieruchomionej, mikroorganizmy lub przeciwciała.

Przetworniki to zwykle potencjometryczne lub amperometryczne elektrody jonoselektywne, tranzystory, termistory, piezokryształy, systemy optyczne.

Głównym zadaniem przetwornika jest konwersja mierzonego parametru na sygnał: elektryczny, optyczny lub akustyczny.

Biosensory wykorzystują podstawową cechę materiału biologicz­nego jako warstwy detekcyjnej - selektywność, to znaczy zdolność do reagowania na jeden określony związek w obecności innych. Selektywność biosensora zależy ściśle od użytego materiału biologicznego. Połączenie chemicznie selektywnej warstwy z fizyczną częścią sensora jest bardzo ważne i ma znaczący wpływ na selektywność całego sensora. Jego sygnał może być przetwarzany na wiele sposobów z różnym stopniem skomplikowania, przedstawiany w formie analogowej, odejmowany od sygnału odniesienia, przetwarzany na sygnał cyfrowy i następnie przetwarzany metodami statystycznymi.

Wiele substancji, ważnych z punktu widzenia chemii klinicznej, jak: glukoza, mleczan, czy etanol, może być oznaczana amperomet­rycznie za pomocą biosensorów wykorzystujących tlenowe elektrody jako przetworniki i enzymy typu oksydaz immobilizowane w membranie. Niestety, nie są dostępne oksydazy dla wszystkich, ważnych klinicznie substancji, jak: moczan czy kreatynina. Lukę tę zapełniają biosensory z enzymami typu dea­minaza, jakkolwiek podjęto dopiero pierwsze próby opracowania amperomet­rycznego biosensora czułego na amoniak.

METODY WYTRĄCENIOWE

Wysalanie białek - proces polegający na „odwadnianiu” cząsteczek białek i wytrącaniu ich z roztworu w postaci osadu

stosuje się sole o większym niż białka powinowactwie do wody

sączenie lub wirowanie wytrąconych białek

usunięcie wysalającej soli (np. dializa)

Wysalanie:

• stosuje się siarczan amonu, siarczan magnezu, siarczan sodu

• zwykle w temperaturze 4°C

• pH bliskie wartości punktu izoelektrycznego danego białka

Frakcjonowanie białek osocza krwi siarczanem amonu

• albuminy (ok. 60%) - wysalają się przy całkowitym nasyceniu roztworu (NH₄)₂SO₄

• globuliny (ok. 33%) - wysalają się przy 50% nasyceniu roztworu (NH₄)₂SO₄

• fibrynogen (ok. 3-4%) - wytrąca się przy 20% nasyceniu roztworu (NH₄)₂SO₄

Odczyny białkowe - badania biochemiczne płynu mózgowo-rdzeniowego (PMR)

1. Odczyn Pandy'ego - fenol znajdujący się w odczynniku Pandy'ego denaturuje białka, powodując ich wytrącanie. Odczynnik ten wytrąca zarówno albuminy jak i globuliny, o ile znajdują się w zwiększonej ilości w PMR.

2. Odczyn globulinowy Nonne-Apelta - przy 50% nasyceniu siarczanem amonu wytrącają się globuliny, natomiast albuminy pozostają w roztworze.

3. Odczyn koloidowy (krzywa koloidowa Langego) - białka, a szczególnie globuliny, mają zdolność wytrącania koloidu. Barwa koloidu złota zależy od stopnia jego rozdrobnienia. Globuliny występujące w zwiększonej ilości powodują agregację cząstek koloidu i zmianę jego zabarwienia (od fioletowego do niebieskiego lub całkowitego odbarwienia). Albuminy chronią koloid złota przed wytrącaniem przez globuliny. Metoda ta daje ogólną informację o stosunku albumin do globulin.

METODY OZNACZANIA BIAŁKA CAŁKOWITEGO

1. Metody oznaczania białka całkowitego w surowicy

1. Metoda biuretowa

Wiązania peptydowe obecne w białkach reagują z jonami Cu⁺² w roztworze alkalicznym tworząc barwny produkt, którego absorbancję mierzy się spektrofotometrycznie przy długości fali 546 nm. Winian sodowo-potasowy obecny w odczynniku biuretowym, jest czynnikiem kompleksującym, utrzymującym miedź w roztworze, która w środowisku zasadowym mogłaby się wytrącać w postaci wodorotlenku miedziowego. Intensywność powstałego zabarwienia jest wprost proporcjonalna do ilości wiązań peptydowych i w związku z tym do stężenia oznaczanego białka. Aminokwasy i dipeptydy nie reagują z odczynnikiem biuretowym, natomiast tripeptydy, oligopeptydy i polipeptydy reagują dając zabarwienie od różowego do czerwono-fioletowego.

Substancja wzorcowa

Surowica jest mieszaniną różnych białek, w związku z tym wzorcem pierwotnym białka całkowitego jest surowica, w której oznaczono stężenie białka za pomocą metody Kjeldahla (metoda referencyjna), stosując przy tym współczynnik przeliczeniowy ze stężenia azotu białkowego na stężenie białka, wynoszący 6,54.

Surowice lekko zhemolizowane, żółtaczkowe i lipemiczne wymagają wykonania próby ślepej zmętnieniowej. W przypadku silnej hemolizy próbka nie nadaje się do analizy (odczynnik biuretowy reaguje z hemoglobiną).

Wartości prawidłowe i zmienność fizjologiczna

• stężenie białka całkowitego u dorosłych, zdrowych ludzi mieści się w granicach 60-80 g/L (6,0 - 8,0 g/dL)

• stężenie białka całkowitego w surowicy jest mniejsze o 2-5 g/L niż w osoczu krwi, co jest spowodowane ubytkiem fibrynogenu

• różnica tętniczo-żylna: zawartość białka całkowitego jest większa we krwi żylnej o 2-5 g/L w porównaniu z krwią tętniczą

• stężenie białka całkowitego jest większe w pozycji stojącej niż leżącej i większe w dzień niż w nocy o ok. 15%, co jest związane z ucieczką wody z łożyska naczyniowego w pozycji stojącej. Stężenie białka całkowitego dodatkowo zwiększa się po wysiłku.

• zmienność sezonowa - stężenie białka całkowitego jest większe zimą niż latem

• zmienność związana z wiekiem - w okresie niemowlęcym stężenie białka całkowitego jest mniejsze o ok. 14 g/L niż u człowieka dorosłego, a następnie rónomiernie zwiększa się w miarę rozwoju organizmu. Po osiągnięciu maksimum pomiędzy 20 a 30 rokiem życia obserwuje się stopniowe zmniejszenie stężenia albuminy i białka całkowitego w surowicy

• różnica związana z płcią jest niewielka - u mężczyzn stężęnie białka całkowitego jest większe o 1-2 g/L

Czułość metody biuretowej: 1,7 g/L (0,17 g/dL)

Liniowość: do 150 g/L (15 g/dL) w analizatorach biochemicznych

do 120 g/L (12 g/dL) dla metody manualnej

2. Bezpośrednia metoda spektrofotometryczna

Absorpcja promieniowania elektromagnetycznego w zakresie UV przy 200-225 oraz 270 do 290 nm może być wykorzystywana do oznaczania zawartości białka próbach biologicznych. Absorpcja promieniowania przy 280 nm zależy od zawartości aminokwasów aromatycznych w cząsteczkach białek, głównie pierścieni aromatycznych tyrozyny i tryptofanu w pH 8,0. Dokładność i specyficzność tej metody są obniżone ze względu na to, że poszczególne białka różnią się zawartością tyrozyny i tryptofanu. Ponadto aminokwasy te obecne w postaci wolnej w badanych płynach ustrojowych, a także kwas moczowy i bilirubina także absorbują promieniowanie przy 280 nm.

Wiązanie peptydowe są także odpowiedzialne za absorpcję promieniowania w ultrafiolecie (70% przy 205-210 nm). Specyficzna absorpcja promieniowania przez białka w zakresie od 200 do 225 nm jest 10-30 razy większa niż przy 280 nm.

Czułość metody bezpośredniej:

- pomiar przy 205-210 nm 0,1 g/L

- pomiar przy 280 nm 1,2 g/L

3. Metoda Lowry'ego (Folina-Ciocalteu)

Metoda ta opiera się na dwóch reakcjach: reakcji białka z jonami Cu⁺² oraz z kwasami fosforowolframowym i fosforomolibdenowym, znajdującymi się w stosowanym odczynniku Folina-Ciocalteu. Barwa jest wynikiem reakcji pomiędzy wiązaniami peptydowymi i jonami Cu⁺² oraz reakcji redukcji kwasów fosforowolframowego i fosforomolibdenowego przez zawartte w białkach aminokwasy aromatyczne, tyrozynę i tryptofan. Obydwie reakcje przebiegają w środowisku zasadowym. Intensywność zabarwienia zależy przede wszystkim od rodzaju oznaczanego białka, co wynika z różnej procentowej zawartości tych aminokwasów w różnych białkach. Czułość metody Lowry'ego jest duża - stężenie wykrywanego białka wynosi od 0,01 do 0,5 mg/mL. Swoistość jest ograniczona - takie związki jak: wolna tyrozyna i tryptofan, kwas moczowy, pochodne puryny i pirymidyny dają dodatnią reakcję z odczynnikiem Folina-Ciocalteu, powodując zawyżenie uzyskanych wyników. Z kolei takie związki jak etanol i sacharoza wpływają na obniżenie wyników.

Czułość metody: 0,01 g/L (0,1 g/dL)

4. Metoda refraktometryczna

Metoda refraktometryczna jest alternatywną do analiz chemicznych metodą oznaczania białka całkowitego wówczas gdy konieczne jest szybkie oszacowanie jego zawartości w surowicy. Polega na oznaczeniu zawartości białka na podstawie wartości współczynnika załamania światła. Gdy stężenie białka całkowitego jest niższe od 3,5 g/dL wyniki uzyskane metodą refraktometryczna są nieprawidłowe. W przypadku stężeń powyżej 11 g/dL należy surowicę rozcieńczyć wodą destylowaną.

Czułość metody: 10-110 g/L (1-11 g/dL)

II. Metody oznaczania białka w moczu i płynie mózgowo-rdzeniowym

Metoda Extona

Jest to metoda turbidymetryczna. Służy do oznaczania białka całkowitego w moczu i płynie mózgowo-rdzeniowym.

Białko wytrąca się roztworem kwasu sulfosalicylowego z siarczanem sodowym - powstaje zmętnienie proporcjonalne do ilości białka.

METODY OZNACZANIA BIAŁEK SPECYFICZNYCH OSOCZA KRWI I PŁYNÓW USTROJOWYCH

Metoda kolorymetryczna oznaczania albuminy

Albumina tworzy z zielenią bromokrezolową (BCG), środowisku kwaśnym barwny kompleks. Wielkość absorbancji mierzonej przy 630 nm jest proporcjonalna do stężenia albuminy w badanej próbie.

Czułość metody: 1 g/L

Liniowość: do 70 g/L (7,0 g/dL)

Metoda kolorymetryczna oznaczania fibrynogenu

Fibrynogen wykrzepiony z rozcieńczonego osocza za pomocą trombiny, przepłukuje się małymi porcjami 0,9%NaCl i H₂O destylowanej, a następnie rozpuszcza się w silnie alkalicznym środowisku (10% NaOH). Uwolniona podczas alkalicznej hydrolizy tyrozyna daje z odczynnikiem Folina - Ciocalteau niebieskozielone zabarwienie. Stosując odpowiedni przelicznik można określić z zawartości tyrozyny zawartość fibrynogenu w osoczu (zawartość Fb w mg/dL = zawartość tyrozyny w mikrogramach x 12)

Wykrywanie białka Bence-Jonesa

Wykrywa się je przez ogrzanie probówki zawierającej mocz do temperatury 50°C. Następuje wytrącanie białka, a przy dalszym wzroście temperatury - rozpuszczenie strątu.

ODCZYN BIERNACKIEGO (OB)

Szybkość opadania krwinek czerwonych - we krwi pobranej na antykoagulant (cytrynian sodu; v/v 1:4) krwinki czerwone opadają wskutek większego ciężaru właściwego (1,095 g/cm³) niż osocze (1,027 g/cm³).

Szybkość OB jest wypadkową składu osocza i właściwości erytrocytów - jego zwiększenie powodują:

- zwiększenie stężenia fibrynogenu i innych białek ostrej fazy

- zmniejszenie stężenia albumin

- niedokrwistości (mało erytrocytów, mniejsza objętość erytrocytów)

Niektóre przyczyny zmian szybkości opadania krwinek czerwonych:

Stan chorobowy	Zmiana OB	Przyczyny
Ostre stany zapalne	↑	Fibrynogen ↑, albumina ↓
Przewlekłe zakażenia	↑	Immunoglobuliny ↑
Kolagenozy	↑	Fibrynogen ↑, Immunoglobuliny ↑
Marskość wątroby	↑	Immunoglobuliny ↑, albumina ↓
Zespół nerczycowy	↑	Albumina ↓
Ciąża, połóg	↑	Fibrynogen ↑
Gammapatie monoklonalne	↑	Immunoglobuliny ↑
Nowotwory	↑	Fibrynogen ↑, albumina ↓, erytrocyty ↓
Urazy, martwica tkanek	↑	Fibrynogen ↑, albumina ↓
Niedokrwistość	↑	Erytrocyty ↓
Noworodki	↓	Erytrocyty ↑
Czerwienica	↓	Erytrocyty ↑
Nadkrwistości objawowe	↓	Erytrocyty ↑
Anemia sierpowata	↓	Nieprawidłowe erytrocyty
Krioglobulinemia	↓	Nieprawidłowe immunoglobuliny monoklonalne

1

---