Wolne rodniki i reaktywne formy tlenu
Wolny rodnik to cząsteczka mająca jeden lub więcej niesparowanych
elektronów na orbitalu walencyjnym, zdolna do samodzielnego istnienia.
Rodniki są w większości przypadków obojętne elektrycznie i bardzo
reaktywne. Szybko wchodzą w reakcje z innymi cząsteczkami – dążąc do
sparowania elektronów – w wyniku ich przyłączania lub oddawania.
Rodniki i reaktywne formy tlenu (RFT) stanowią duże zagrożenie dla
zdrowia, ponieważ atakują cząstki biologicznie czynne (białka, kwasy
tłuszczowe i nukleinowe), prowadzą do uszkodzenia komórek i tkanek,
a w konsekwencji do rozwoju wielu chorób oraz przyspieszenia procesów
starzenia i kancerogenezy. W organizmie żywym różne rodniki i pochodne
tlenowe powstają w wielu reakcjach zainicjowanych elektronową redukcją
tlenu. Przykładami reaktywnych form tlenu są: wolne rodniki – hydroksy-
lowy (HO•), wodoronadtlenkowy (HO
2
•), anionorodnik ponadtlenkowy
(O
2
–
•), tlenek azotu (NO•), dwutlenek azotu (NO
2
•); nadtlenki, np. nad-
tlenek wodoru (H
2
O
2
); tlen singletowy (
1
O
2
) oraz ozon (O
3
).
Najwięcej szkodliwych zmian powoduje rodnik hydroksylowy, bowiem
natychmiast reaguje on z każdą napotkaną cząsteczką organiczną. Reak-
cje te mogą mieć różne mechanizmy – oddania atomu [1], przyłączenia
rodnika [2] bądź addycji rodników [3] (zob. wzory [1-3], s. 34).
Przeciwutleniacze
Ograniczenie lub zahamowanie negatywnych przemian w żywności,
wywołanych przez RFT, może być wynikiem obecności antyoksydantów
(przeciwutleniaczy). Współcześnie termin „przeciwutleniacze żywności”
dotyczy substancji, które – obecne w niskim stężeniu, w porównaniu do
stężenia utlenianej substancji – znacząco opóźniają lub chronią przed
jej utlenieniem.
Z biologicznego punktu widzenia antyoksydanty można podzielić na:
– pierwszorzędowe – zapobiegające powstawaniu rodników tlenowych,
np.: dysmutaza ponadtlenkowa (unieczynniająca rodnik ponadtlenko-
wy), peroksydaza glutationowa, kwas moczowy, katalaza (unieczyn-
niająca nadtlenek wodoru);
– drugorzędowe – wychwytujące rodniki przed wejściem w reakcje łańcucho-
we prowadzące do destrukcji naturalnych układów organizmu oraz tworze-
nia nowych rodników. Do tej grupy należą: substancje wychwytujące tlen,
kwas askorbinowy, palmitynian askorbylu, glutation, związki chelatujące
metale, np. kwas cytrynowy, białka (transferyna, ceruloplazmina, hapto-
globina, hemopeksyna, laktoferryna i inne) oraz wtórne antyoksydanty,
np. α-tokoferol, β-karoten, aminokwasy oraz flawonoidy;
– trzeciorzędowe – reperujące uszkodzenia powodowane przez wolne
rodniki – lipazy, proteazy, enzymy reperujące DNA i transferazy.
W technologii żywności najważniejsze znaczenie odgrywają prze-
ciwutleniacze drugorzędowe. Mechanizm ich działania polega na
bezpośrednim wiązaniu się antyoksydanta (AH) z wolnymi rodnikami
(R•), odpowiedzialnymi za propagacje łańcuchowej reakcji rodnikowej.
W konsekwencji przeciwutleniacz przekształca się do mało reaktywnej
formy rodnikowej (A•) według reakcji [4-6].
Powstające rodniki (A•), reagując między sobą lub z innymi
rodnikami, dezaktywują się. Przeciwutleniacz (AH) może również
zregenerować się z formy rodnikowej (A•) w wyniku enzymatycznych
i nieenzymatycznych reakcji redoks [7-9].
Wydaje się, że w naturze jest wiele źródeł naturalnych antyoksydantów,
ich wykorzystanie jest jednak ograniczone. Najbogatsze w te związki są
rośliny, ich owoce, kwiaty, liście, nasiona, korzenie, kora i części zdrewniałe.
Wśród antyutleniaczy dostarczanych w diecie bardzo istotną i największą
grupę stanowią związki polifenolowe, często zwane też bioflawonoidami.
Powszechne występowanie bioflawonoidów w świecie roślinnym sprawia,
że są w zasadzie nierozłącznymi składnikami pożywienia. Związki te,
oprócz hamowania reakcji powodowanych przez wolne rodniki, często
wzmagają funkcje innych antyoksydantów oraz działają na nie ochronnie
(np. na witaminy C i E).
Szczególnie bogate w polifenole są: zielona herbata, winogrona,
groch, pomidory oraz kapusta. Większość polifenoli jest rozmieszczona
na zewnętrznych częściach owoców.
Podział związków polifenolowych
Z punktu widzenia struktury podstawowego szkieletu węglowego
związki polifenolowe można podzielić na wiele grup. Do podstawo-
wych zalicza się:
dr inż. Tomasz Tarko, e-mail: ttarko@ar.krakow.pl
dr Aleksandra Duda-Chodak, e-mail: aduda-chodak@ar.krakow.pl
Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej
Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie
Streszczenie
Przeciwutleniacz to substancja, która, obecna w niskim stężeniu,
opóźnia bądź eliminuje reakcje utleniania. Ze względu na duże zróż-
nicowanie w budowie i funkcji tych związków istnieje wiele metod ich
oznaczania i identyfikacji. Większość badań opiera się na ocenie ak-
tywności antyoksydacyjnej, będącej sumą właściwości poszczególnych
składników zawartych w badanym materiale. Najczęściej wykorzystuje
się metody spektrofotometryczne i kolorymetryczne, ale także elektro-
chemiczne. Do identyfikacji związków o charakterze przeciwutleniają-
cym służą techniki chromatograficzne, głównie HPLC.
Summary
Antioxidant is a substance that in low concentration delays or
inhibits oxidation. There are many methods of antioxidants de-
termination and identification due to the diversification of their
structure and function. Majority of investigations are based on
evaluation of antioxidant activity, which equals the sum of the
particular components properties in a sample. Spectrophotome-
tric and colorimetric methods are used most often, as well as
electrochemical ones. The chromatographic techniques, mainly
HPLC, are used for identification of antioxidants.
Słowa kluczowe
rodniki, RFT, reaktywne formy tlenu, przeciwutleniacze, metody
oznaczania
Key words
radicals, ROS, reactive oxygen species, antioxidant, identification
methods
Metody oznaczania oraz identyfikacji
związków przeciwutleniających
laboratorium przemysłowe
Laboratorium |
3
/2007
32
1) fenolokwasy:
– kwasy fenylokarboksylowe – pochodne kwasu benzoesowego
o szkielecie węglowym C6-C1 (kwas protokatechowy i galusowy);
– kwasy fenylopropenowe – pochodne kwasu cynamonowego,
o szkielecie węglowym C6-C3 (kwas kawowy, kwasy kumarowe);
2) flawonoidy o szkielecie węglowym C6-C3-C6 (rys. 1., s. 34), np.:
– flawony – rutyna, luteolina, apigenina;
– flawonole – kempferol, kwercetyna;
– flawanony – hesperydyna, naringenina;
– flawanole – katechina, epikatechina;
– antocyjanidyny – malwidyna, pelargonidyna, cyjanidyna;
– chalkony – florydzyna, ksantohumnol, floretyna;
– izoflawony – genisteina, daidzeina, glyciteina.
Metody oznaczania przeciwutleniaczy
Duże zróżnicowanie w budowie, funkcji i pochodzeniu zarówno utle-
niaczy, jak i reaktywnych form tlenu wymusiło opracowanie licznych
metod badawczych. Nie jest bowiem możliwe analizowanie tym samym
sposobem tak różnych związków, jak enzymy, duże białka, niskoczą-
steczkowe przeciwutleniacze czy hormony. Z drugiej strony te rozmaite
antyoksydanty mogą oddziaływać w odmienny sposób, w zależności od
rodnika czy utleniacza, środowiska reakcji i obecności lub braku innych
substancji. Przeciwutleniacz „wyspecjalizowany” w zmiataniu tlenu sin-
gletowego może nie działać na rodniki peroksylowe i odwrotnie. Właśnie
z powodu tak licznych i różnorodnych mechanizmów, a także zmiennych
środowisk reakcji nie ma możliwości, by jedna metoda mogła dokładnie
opisywać wszystkie źródła rodników i/lub przeciwutleniaczy.
Większość badań opiera się na ocenie aktywności czy tzw. pojemności
antyoksydacyjnej, będącej sumą właściwości poszczególnych związków
zawartych w badanym materiale. Inne techniki oceniają przeciwutlenia-
cze ilościowo i/lub jakościowo, nie uwzględniając ich aktywności.
Wszystkie metody służące do oceny przeciwutleniaczy, zarówno ich
ilości, jak i aktywności, można podzielić na:
– chromatograficzne:
• na płaszczyznach – chromatografia cienkowarstwowa (TLC);
• na kolumnach – chromatografia cieczowa (HPLC) i gazowa (GC);
– spektrofotometryczne,
– kolorymetryczne,
– elektrochemiczne:
• woltamperometria cykliczna (CV);
• spektroelektrochemia;
– elektronowy rezonans paramagnetyczny (EPR).
Antyoksydanty mogą inaktywować wolne rodniki na dwa sposoby:
przez transfer atomu wodoru (HAT) lub pojedynczego elektronu (SET).
W związku z tym metody określające pojemność antyoksydacyjną
można też podzielić na odpowiednie dwie grupy:
1. Oparte na mechanizmie HAT (np. ORAC, TRAP) – mierzą zdolność
przeciwutleniacza (AH) do wygaszania rodników poprzez oddanie
wodoru [wzór 10]. Tego typu reakcje zachodzą szybko i zależą od
pH, rozpuszczalnika oraz obecności innych substancji redukujących,
np. metali, które mogą zawyżać wynik.
2. Oparte na mechanizmie SET (np. FRAP, CUPRAC) – wykrywają
zdolność antyoksydanta do przeniesienia e
–
i zredukowania rodnika
czy jonów metali [wzory 11-14].
Są to reakcje zachodzące powoli, zależne od pH i obecności jonów
metali.
Istnieją jednak metody, których nie można jednoznacznie zakwa-
lifikować do żadnej z powyższych grup (TEAC, DPPH, metoda
Folina-Ciocalteau).
33
laboratorium przemysłowe
Laboratorium |
3
/2007
33
Omówienie najważniejszych metod
Niezależnie od przyjętego podziału najczęściej wykorzystywane są metody
chromatograficzne i spektrofotometryczne. Szerokie zastosowanie w bada-
niach glikozydów flawonoidowych znalazła chromatografia. Jest to metoda
analizy chemicznej, polegająca na określeniu składu mieszaniny przez
rozdzielenie jej na składniki lub frakcje, dzięki ich różnemu zachowaniu
w dwufazowym układzie złożonym z fazy nieruchomej (stacjonarnej)
oraz ruchomej, która w określonym kierunku zmienia swoje położenie
względem tej pierwszej. Chromatografia pozwala nie tylko na stwierdzenie
obecności związku w próbce, lecz także na wnioskowanie o jego ilości.
Stosunkowo dobre zróżnicowanie glikozydów flawonoidowych ze względu
na rodzaj i liczbę cząsteczek cukru oraz ich lokalizację otrzymuje się,
używając w chromatografii cienkowarstwowej jako adsorbentu: poliamidu,
żelu krzemionkowego G lub tlenku glinu.
Zasadnicze znaczenie dla dobrego rozdziału ma dobór odpowiedniej
fazy ruchomej i adsorbenta. W skład fazy ruchomej wchodzą najczę-
ściej następujące rozpusz czalniki: woda, kwas octowy, n-butanol, octan
etylu, kwas mrówkowy, benzen, keton metyloetylowy, chloroform
oraz aceton. Rozdzielanie substancji na cienkich warstwach wykonuje
się niekiedy wielokrotnie, rozwijając chromatogram w tej samej lub
różnych fazach ruchomych. W celu rozpoznania związków stosuje się
wzorzec o znanej wartości czasu retencji (R
f
). Po dokonaniu rozdziału
na cienkiej warstwie można zlokalizowaną substancję wyeluować od-
powiednim rozpuszczalnikiem i oznaczyć ilościowo.
W wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) fazą ruchomą
jest ciecz, przepływająca pod wysokim ciśnieniem poprzez warstwę
złoża w kolumnie. Identyfikację i oznaczanie składników umożliwiają
detektory reagujące na zmiany zachodzące w składzie fazy ruchomej
podczas wymywania z kolumny składników mieszanin. Dobór rozpusz-
czalników zależy od właściwości badanego flawonoidu i stosowanego
układu detekcyjnego; czasem wykorzystuje się fazę ruchomą, o składzie
zmieniającym się podczas procesu chromatograficznego (elucja gra-
dientowa). Fazy ruchome w chromatografii cieczowej, w odróżnieniu
od gazowej, są ważnym elementem zmiennym, dostarczającym wielu
możliwości doboru najkorzystniejszych warunków rozdziału. Sposób
postępowania podczas identyfikacji jest zbliżony w obu przypadkach,
ale przy objętościach próbek większych niż 10 μl nie jest konieczne
stosowanie wzorców wewnętrznych, gdyż technika ich wprowadzania
na kolumnę pozwala na uzyskanie dostatecznej powtarzalności.
Chromatografia cieczowa znalazła zastosowanie w analizie jakościo-
wej i ilościowej flawonoidów. Techniką HPLC można identyfikować
monomery, dimery i trimery, natomiast oligomery nadal stanowią
wyzwanie dla analityków ze względu na trudności ze znalezieniem
odpowiednich parametrów rozdziału.
Do ilościowego oznaczania związków flawonoidowych najczęściej
wykorzystuje się techniki spektrofotometryczne i kolorymetryczne.
Metody spektrofotometryczne są przydatne do oznaczania czystych
substancji, natomiast metodami kolorymetrycznymi można oceniać
zawartość polifenoli w ekstraktach po wstępnym oczyszczeniu. Do tej
grupy należą m.in. metody:
– Christa-Műllera – w której zawartość flawonoidów oznacza się poprzez
pomiar natężenia zabarwienia powstałego w wyniku reakcji flawono-
idu z trójchlorkiem antymonu, tlenochlorkiem cyrkonu, octanem
uranylu, azotanem berylu, kwasem borowym lub chlorkiem glinu;
– Folina-Ciocalteau – gdzie polifenole tworzą barwny kompleks
z odczynnikiem Folina-Ciocalteau (mieszanina wolframianu sodu,
molibdenianu sodu i siarczanu litu w środowisku kwasu fosforowego
i solnego), dając zielononiebieską barwę; po utlenieniu kompleks
oznacza się spektrofotometrycznie przy długości fali 750 nm
lub 784 nm;
– opierające się na reakcjach wygaszania syntetycznych wolnych rodni-
ków (ABTS, DPPH, DMPD); barwny aktywny rodnik ulega redukcji
przez antyoksydanty, obecne w badanej próbce, do bezbarwnych
związków, co ilościowo mierzy się spektrofotometrem przy długości
fali 734, 515 i 505 nm odpowiednio dla ww. rodników;
– FRAP – polegająca na pomiarze zdolności do redukcji jonu żelazo-
wego 2,4,6-tripirydylo-s-triazyny (TPTZ); związek żelaza(III) w reakcji
z antyoksydantem daje barwny produkt, który oznacza się przy
długości fali 593 nm;
– TRAP – w której przeciwutleniacz redukuje rodnik ABAP;
– CUPRAC – w której jony miedzi(II) ulegają pod wpływem antyoksy-
dantów redukcji do jonów miedzi(I); analizę spektrofotometryczną
wykonuje się przy długości fali 450 nm;
– ORAC – oceniająca zdolność antyutleniacza do opóźniania fluorescen-
cji R-fikoerytryny, indukowanej przez AAPH; długość fali wzbudzającej
to 540 nm, a emisji – 570 nm.
Do oceny aktywności przeciwutleniającej służą także metody
elektrochemiczne. Wykorzystują one prąd, jaki powstaje w czasie
elektrochemicznej redukcji tlenu na elektrodzie. Przeciwutleniacze,
reagując z tlenem i jego pochodnymi, zmniejszają natężenie tego
Rys. 2. Reakcja powstawania barwnego adduktu kwasu tiobarbiturowego i MDA
Rys. 1. Budowa szkieletu podstawowego flawonoidów
Wzory
OH• + HR → H
2
O + R• [1]
OH• + R–CH=CH–R → R–CHOH–C•H–R [2]
OH• + R• → R–OH
[3]
AH + R• → RH + A• [4]
AH + RO• → ROH + A• [5]
AH + ROO• → ROOH + A• [6]
A• + A• → AA
[7]
A• + R• → RA
[8]
A• + RO• → ROA
[9]
AH + X• → A• + XH
[10]
X• + AH → X
–
+ AH•
+
[11]
AH•
+
↔ A• + H
3
O
+
[12]
X
–
+ H
3
O
+
→ XH + H
2
O [13]
Me(III) + AH → AH
+
+ Me(II)
[14]
R• + T → (R–T)•
[15]
H
2
O
A
C
B
O
1
2
3
4
8
5
7
6
3’
4’
5’
2’
HS
N
HO
N
N
OH
OH
N
S
H
OH
CH CH CH
N
OH
SH
N
HO
2
+
→
C
H
O
H
2
C
C
H
O
laboratorium przemysłowe
Laboratorium |
3
/2007
34
prądu. Istnieje kilka wariantów elektrochemicznego pomiaru aktyw-
ności antyoksydacyjnej. Najważniejsze z nich, cykliczna woltametria
(CV) i różnicowa woltametria pulsowa (DPV), pozwalają na pomiar
siły działania przeciwutleniaczy zawartych w badanych próbkach za
pomocą specjalnej szklanej elektrody węglowej. Zróżnicowanie pH
pozwala na selektywną ocenę samych flawonoidów (pH=7,5) lub
flawonoidów i kwasów fenolowych (pH=2,0). Zaletą tych metod jest
to, że nie wymagają żadnych dodatkowych odczynników. Szklana
elektroda węglowa jest najlepsza do tych celów, gdyż antyoksydanty
fenolowe utleniają się na niej przy podobnych potencjałach jak na
elektrodach metalicznych, jednak bez zakłóceń interferencyjnych
związanych z utlenianiem etanolu.
Do technik oceniających zawartość związków przeciwutleniających nale-
ży zaliczyć również wszystkie oznaczenia poszczególnych antyoksydantów,
a więc metody analizy witaminy C, tokoferoli, antocyjanów itd.
Wyżej wymienione metody służą do analizy ilościowej lub jako-
ściowej przeciwutleniaczy oraz oceny ich aktywności. Odmienne
podejście do problemu reprezentuje spektroskopia elektronowego
rezonansu paramagnetycznego (EPR). Pozwala ona na wykrycie
związków posiadających niesparowane elektrony (paramagnetyków),
czyli będących wolnymi rodnikami. Zjawisko pochłaniania energii
promieniowania mikrofalowego o odpowiedniej częstotliwości po
raz pierwszy zaobserwował w 1944 roku Zawojski. Badanie polega
na wprowadzeniu próbki w zmienne pole magnetyczne, po czym
niesparowane elektrony orientują się równolegle lub antyrównolegle
względem kierunku pola (rozszczepienie poziomów energetycznych
to tzw. efekt Zeemana) i następuje absorpcja doprowadzonego pro-
mieniowania o częstości pasującej do różnicy energii tych orientacji.
Warunki pomiaru można różnicować poprzez zmianę indukcji pola
magnetycznego, natomiast jego częstotliwość pozostaje stała. Badania
przeprowadza się zazwyczaj w temperaturze ciekłego azotu 77 K, gdyż
przedłuża to czas życia wolnych rodników. Pochłonięcie energii może
zostać zmierzone, odpowiednio przekształcone przez układ odbiorczy
spektrometru elektronowego rezonansu paramagnetycznego i wyświe-
tlone na ekranie bądź zapisane przez układ rejestrujący. Otrzymywane
widma są porównywane ze wzorcem zewnętrznym, którym najczęściej
jest DPPH, i analizowane przez programy komputerowe. Metoda
EPR ma szereg zalet wobec innych spektroskopii promieniowania
elektromagnetycznego:
– jest to metoda specyficzna dla wolnych rodników; inne substancje
nie mają żadnego udziału w rejestrowanym sygnale;
– energia stosowanych do napromieniania próbki mikrofal jest
niewielka, zatem i możliwość powstania uszkodzeń analizowanej
próbki przez sam pomiar jest znikoma;
– objętość badanej próbki to zaledwie około 200 μl;
– możliwe są pomiary próbek nieprzezroczystych;
– sygnał wolnych rodników w tle jest znikomy, pozwala to w sposób
niezaburzony obserwować konkretne substancje wolnorodnikowe.
Poważnym utrudnieniem obserwacji bezpośredniej wolnych
rodników może być ich bardzo krótki czas życia. Aby ominąć ten
problem, stosowane są tzw. pułapki spinowe (T). Są to związki dia-
magnetyczne, które dzięki obecności wiązań typu –N=O z łatwością
wchodzą w reakcję z nietrwałym rodnikiem, tworząc trwałe addukty
spinowe [wzór 15].
Funkcje pułapek spinowych mogą spełniać duże połączenia orga-
niczne typu nitrozozwiązków lub nitronów, np. 2,4,6-tri-tert-butyloni-
trobenzen, a także kompleksy nieorganiczne (Fe
2+
(DETC)
2
).
Oprócz wyżej wymienionych metod istnieje jeszcze wiele innych, ale
zwykle nie są one wykorzystywane do badań żywności. Do pomiaru
35
laboratorium przemysłowe
Laboratorium |
3
/2007
35
zdolności zmiatania wolnych rodników czystych związków che-
micznych lub do oceny pojemności antyoksydacyjnej osocza
czy innych płynów ustrojowych służy między innymi badanie
peroksydacji lipidów. Ocenia się wydajność hamowania tego
procesu przez antyutleniacze. Istnieje wiele wariantów tej metody;
najczęściej stosuje się reakcję aldehydu malonowego (MDA) z kwa-
sem tiobarbiturowym. Produkt tej reakcji (rys. 2, s. 34) to addukt
o charakterystycznym różowym zabarwieniu, który oznacza się
spektrofotometrycznie.
Mimo powszechnego stosowania tej metody nie można jej uznać
za najlepszą. Jest bardzo czuła, ale wysoce niespecyficzna. Z kwasem
tiobarbiturowym addukty tworzą także: bilirubina, kwas sjalowy,
produkty degradacji cukrowców i inne aldehydy.
Poza oznaczaniem zahamowania peroksydacji lipidów przez przeciw-
utleniacze ocenia się także produkty utleniania białek i nukleotydów
oraz uszkodzenia kwasów nukleinowych, prowadzące do mutacji.
Czynniki wpływające
na zafałszowania wyników
Mimo że większość z opisanych metod nie jest trudna, interpreta-
cja wyników bywa skomplikowana. Technika DPPH ma względnie
duże ograniczenia stosowania. Przy jego użyciu można oznaczyć
tylko związki hydrofobowe w przeciwieństwie do metody z zasto-
sowaniem rodnika ABTS, która oznacza zarówno związki hydro-
fobowe, jak i hydrofilowe. Ponadto istnieje wiele antyoksydantów
reagujących szybko z rodnikami propylowymi, ale wolno bądź
wcale z DPPH.
Czynnikiem, który najbardziej wpływa na zafałszowania w me-
todzie Folina-Ciocalteau, jest mieszanie się substancji, szczególnie
cukrów, aromatycznych amin, dwutlenku siarki, kwasu askorbino-
wego i kwasów organicznych. Dlatego należy wprowadzać korekty.
Dodatkowo zarówno niefenolowe substancje organiczne (adenina,
adenozyna, alanina, anilina, kwas aminobenzoesowy, kwas askorbi-
nowy, benzaldehyd, kreatynina, cysteina, cytozyna, dimetyloalanina,
EDTA, fruktoza, guanina, glicyna, histamina, histydyna, uracyl, kwas
olejowy, tryptofan, białka, sacharoza), jak i nieorganiczne (hydrazy-
na, siarczan amonu, siarczan manganu, fosforan sodu), reagujące
z odczynnikiem Folina, dają w efekcie zawyżony wynik końcowy
aktywności przeciwutleniającej.
Niektóre metody opierają się na założeniu, że reakcje redoks zacho-
dzą w przeciągu od 4 do 6 minut. W rzeczywistości nie zawsze tak się
dzieje. Szybko reagujące fenole, które wiążą żelazo i rozbijają niższe
związki, najlepiej analizować w krótkim czasie (ok. 4 min). Jednakże
niektóre polifenole reagują wolniej i potrzebują dłuższego czasu reakcji
dla wykrycia (ok. 30 min). Źle dobrany czas reakcji sprawia zatem, że
wyniki są obarczone błędem.
Nie wszystkimi metodami można oznaczyć te same przeciwutle-
niacze. Metoda FRAP nie mierzy np. glutationu. Wykrywa się go za
pomocą oznaczenia TRAP, opierającego się na fazie opóźnienia, zakła-
dając, że wszystkie przeciwutleniacze ją wykazują i że jej długość jest
proporcjonalna do aktywności przeciwutleniającej. Jednak nie wszystkie
antyoksydanty posiadają oczywistą fazę opóźnienia. Ponadto wartość
otrzymana na podstawie samej fazy obniża rzeczywisty wynik.
Podsumowanie
Duże zróżnicowanie w budowie i reaktywności rodników oraz
mechanizmów ich inaktywacji wymusiło opracowanie wielu metod
oznaczania i identyfikacji związków o charakterze przeciwutleniającym.
Do najczęściej stosowanych zalicza się techniki spektrofotometryczne,
oceniające sumaryczny potencjał antyoksydacyjny substancji. Można
tutaj wymienić metody wygaszania rodników ABTS, DPPH oraz
CUPRAC i ORAC. Do ilościowego oznaczania polifenoli wykorzy-
stuje się metodę Folina-Ciocalteau, a w celu identyfikacji – techniki
chromatograficzne (głównie HPLC).
Piśmiennictwo
1. Apak R., Güclü K.G., Özyürek M., Karademir S.E.: Novel total antioxi-
dant capacity index for dietary polyphenols and vitamins C and E, using their
cupric iron reducing capability in the presence of neocuproine: CUPRAC method.
“J. Argic. Food Chem.”, 2004, 52, 7970-7981.
2. Barr D., Heiss A., Kamlowski A., Maier D., Erstlig J., Maling H.: Shelf
life analysis of beer using the bruker automated lagtime EPR system. “Spectros.”,
2001, 16, 16-19.
3. Bartosz G.: Druga twarz tlenu. Wolne rodniki w przyrodzie. PWN, Warszawa
2003.
4. Beckman K.B., Ames B.N.: The free radical theory of aging matures. „Physiol.
Rev.”, 1998, 78 (2), 547-581.
5. Bergamini C.M., Gambetti S., Dondi A., Cervellati C.: Oxygen, reactive oxygen
species and tissue damage. “Curr. Pharm. Des.”, 2004, 10(14), 1611-1626.
6. Blasco A.J., Gonzàlez M.C., Escarpa A.: Electrochemical approach for discrimi-
nating and measuring predominant flavonoids and phenolic acids using differential
pulse voltammetry: towards an electrochemical index of natural antioxidants. “Anal.
Chim. Acta”, 2004, 511, 71-81.
7. Brezova V., Polkova M., Staska A.: The influence of additives on beer stability
investigated by EPR spectroscopy. “Spectros.”, 2002, 58, 1279-1291.
8. Bronner W., Beecher G.R.: Methods for determining the content of catechins in
tea infusions by high-performance liquid chromatography. “J. Chromatogr. A”,
1998, 805, 137-142.
9. Chinnici F., Gaiani A., Natali N., Riponi C., Galassi S.: Improved HPLC
determination of phenolic compounds in cv. golden delicious apples using a mono-
lithic column. “J. Agric. Food Chem.”, 2004, 52, 3-7.
10. Cook N.C., Samman S.: Flavonoids-Chemistry, metabolism, cardioprotective
effects, and dietary sources. “J. Nutr. Biochem.”, 1996, 7, 66-76.
11. Drużyńska B., Klepacka M.: Właściwości przeciwutleniające preparatów polifenoli
otrzymanych z okrywy nasiennej fasoli czarnej, różowej i białej. „Żywność”, 2004,
4(41), 67-77.
12. Halliwell B.: Antioxidant characterization. Methodology and mechanism. “Bio-
chem. Pharmacol.”, 1995, 49 (10), 1341-1348.
13. Handelman G.J., Cao G., Walter M.F., Nightingale Z.D., Paul G.L., Prior
R.L., Blumberg J.B.: Antioxidant capacity of oat (Avena sativa L.) extracts. 1.
Inhibition of low-density lipoprotein oxidation and oxygen radical absorbance
capacity. “J. Agric. Food Chem.”, 1999, 47, 4888-4893.
Skróty użyte w tekście
AAPH – dwuhydrochlorek 2,2’-azobis-2-amidynopropanu
ABAP – hydrochlorek 2,2’-azobis-2-amidynopropanu
ABTS – kwas 2,2’-azyno-bis-3-etylobenzotiazolowy
CUPRAC – ang. Copper Reducing Antioxidant Capacity
CV – ang. Cyclic Voltammetry – woltametria cykliczna
DMPD – N,N-dimetylo-p-fenylenodiamina
DPPH – 2,2-difenylo-1-pikrylohydrazyl
DPV – ang. Differential Pulse Voltammetry – różnicowa woltametria pulsowa
EPR – ang. Elektron Paramagnetic Resonance – elektronowy rezonans
paramagnetyczny
FRAP – ang. Ferric Reducing Antioxidant Power
GC – ang. Gas Chromatography – chromatografia gazowa
HAT – ang. Hydrogen Atom Transfer – transfer atomu wodoru
HPLC – ang. High Performance Liquid Chromatography – wysokosprawna
chromatografia cieczowa
MDA – aldehyd dimalonowy; 2-(1,3-benzodioksol-5-yl)-1-metyloetyloamina
ORAC – ang. Oxygen Radical Absorbance Capacity
RFT – reaktywne formy tlenu
SET – ang. Single Electron Transfer – transfer pojedynczego elektronu
TRAP – ang. Total Radical-trapping Antioxidant Parameter
laboratorium przemysłowe
Laboratorium |
3
/2007
36
14. Horubała A.: Pojemność przeciwutleniająca i jej zmiany w procesach przetwarza-
nia owoców i warzyw. „Przem. Ferm. Owoc.-Warz.”, 1999, 3, 30-32.
15. Huang D., Ou B., Prior R.L.: The chemistry behind antioxidant capacity assays.
“J. Agric. Food Chem.”, 2005, 53, 1841-1856.
16. Ignatov S., Shishniashavili D., Ge B., Scheller F.W., Lisdat F.: Amperometric
biosensor based on a functionalized gold electrode for the detection of antioxidants.
“Biosens. Bioelectron.”, 2002, 17, 191-199.
17. Kalt W. Forney C.F., Martin A., Prior R.L.: Antioxidant Capacity, Vitamin
C, Phenolics and Anthocyjanins after Fresh Storage of Small Fruits. “J. Agric.
Food Chem.”, 1999, 47, 4638-4644.
18. Korotkova E.I., Karbainov A.Y., Shevchuk A.V.: Study of antioxidant properties
by voltammetry. “J. Electroanal. Chem.”, 2002, 518, 56-60.
19. Lu Y., Foo L.Y.: Identification and quantification of major polyphenols in apple
pomace. “Food Chem.”, 1997, 59 (2), 187-194.
20. Maniak B., Targoński Z.: Przeciwutleniacze naturalne występujące w żywności.
„Przem. Ferm. Owoc.-Warz.”, 1996, 4, 7-10.
21. Miller N.J., Rice-Evans C.A., Davies M.J., Gopinathan V., Milner A.:
A novel method for measuring the antioxidant capacity. “Clin. Sci.”, 1993, 84,
407-412.
22. Natsume M., Osakabe N., Yamagishi M., Takizawa T., Nakamura T., Miy-
atake H., Hatano T., Yoshida T.: Analyses of polyphenols in cacao liguor, cocoa,
and chocolate by normal-phase and reversed-phase HPLC. “Biosci. Biotechnol.
Biochem.”, 2000, 12, 2581-2587.
23. Noruma T., Kikuchi M., Kawakami Y.: Proton-donative antioxidant activity of
fucoxanthin with 1,1’-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). “Biochem. Mol. Biol.
Int.”, 1997, 42, 2561-2572.
24. Peterson G.L.: Review of the Folin phenol protein quantitation method of Lowery.
“Anal. Biochem.”, 1979, 18, 142-146.
25. Podsędek A., Wilska-Jeszka J., Anders B., Markowski J.: Compositional
characterisation of saome apple varieties. “Euro. Food Res. Technol.”, 2000,
210, 268-272.
26. Pokorny J.: Natural antioxidants for food use. “Trends Food Sci. Technol.”,
1991, 9, 223-227.
27. Prior R.L., Wu X., Schaich K.: Standardized methods for determination of
antioxidant capacity and phenolics in food dietary supplements. “J. Agric. Food
Chem.”, 2005, 53, 4290-4302.
28. Pulido R., Bravo L., Saura-Calixto F.: Antioxidant activity of dietary polyphenols
as determined by a modified ferric reducing/antioxidant power assay. “J. Agric.
Food Chem.”, 2000, 48, 3396-3402.
29. Robards K., Prenzler P.D., Tucker G., Swatsitang P., Glover W.: Phenolic
compounds and their role in oxidative processes in fruits. “Food Chem.”, 1999,
66, 401-436.
30. Salagoity-Auguste M.H., Bertrand A.: Analysis of low molecular weight
components by high performance liquid chromatography. “J. Sci. Food Agric.”,
1984, 35, 1241-1247.
31. Sanchez-Moreno C.: Review: Methods used to evaluate the free radical scavenging activity
in foods and biological systems. “Food Sci. Tech. Int.”, 2002, 8 (3), 121-137.
32. Schieber A., Keller P., Carl E.: Determination of phenolic acids and flavonids
of apple and pear by high-performance liquid chromatography. “J. Chromatogr.
A”, 2001, 910, 265-273.
33. Schlesier K., Harwat V., Bitsch R.: Assessment of antioxidant activity by using
different in vitro methods. “Free Radical Res.”, 2002, 36, 2, 177-187.
34. Schulz H., Albroscheit G.: Chromatography. 1988.
35. Sikorski E. (red.): Chemia żywności: skład, przemiany i właściwości żywności.
WNT, Warszawa 2000.
36. Stevanato R., Fabris S., Momo F.: New enzymatic method for the determination
of total phenolic content in tea and wine. “J. Agric. Food Chem.”, 2004, 52,
6287-6293.
37. Szczypka M.: Wolne rodniki i obrona antyoksydacyjna – udział czynników
dietetycznych. „Przem. Spoż.”, 1997, 4, 16-18.
38. Wayner D.D., Burton G.W., Ingold K.U., Barclay L.R.C., Locke S.J.: The
relative contribution of vitamin E, urate, ascorbate and proteins to the total peroxyl
radical-trapping antioxidant activity of human blood plasma. “Biochim. Biophys.
Acta”, 1987, 924, 408-419.
39. Wayner D.D.M., Burton K.U., Locke S.: Quantitative measurement of the total
peroxyl radical-trapping antioxidant capability. “FEBS Lett.”, 1985, 187, 33-37.
37
laboratorium przemysłowe
Laboratorium |
3
/2007
37