Chemia kliniczna

2011/2012

dla studentów IV roku Analityki Medycznej

Agnieszka Sapa

Strona 1 z 3

Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej

METODYKA OZNACZANIA GLUKOZY

I. Materiał badany.

Rodzaj materiału zależy od celu badań:

a. Do diagnostyki cukrzycy oraz innych zaburzeń gospodarki węglowodanowej należy stosować

osocze krwi żylnej pobranej na EDTA lub szczawian (ew. heparynę) z dodatkiem inhibitora

glikolizy (fluorek sodu, jodooctan sodu, maleinimid, mannoza). Próbka powinna być

przechowywana do 30 minut w wodzie z lodem lub natychmiast odwirowana a osocze oddzielone.

Krwinki obecne w próbce zużywają glukozę w procesie glikolizy, powodując spadek 5 - 7 % /h.

Szczególnie istotne jest stosowanie inhibitorów, kiedy występuje wysoka leukocytoza lub

w próbkach neonatologicznych (wysoki hematokryt) oraz gdy pobieranie materiału nie odbywa się

w laboratorium. Najczęściej stosowanym inhibitorem jest fluorek sodu, w stężeniu 2,5 mg/ml

krwi. Hamuje on enolazę (9 enzym szlaku glikolizy) a jego działanie następuje po 1 - 3 godzinach

od pobrania krwi. Najlepsze połączenie to fluorek + mannoza, której działanie jest

natychmiastowe, ale krótkotrwałe (do 4 godzin).

b. Oznaczanie glukozy wykonywane jest również w innych typach próbek, jak: płyn mózgowo-

rdzeniowy, mocz, płyny z jam ciała (nie służy wtedy do diagnostyki cukrzycy!).

c. Do kontroli glikemii u pacjentów cukrzycowych często stosuje się krew włośniczkową, przy

czym badanie powinno się wykonywać przy pomocy wystandaryzowanego glukometru, który

powinien przeliczyć stężenie we krwi pełnej na stężenie glukozy w osoczu. Stężenie glukozy we

krwi pełnej jest niższe niż w osoczu o ok. 11 %, we krwi kapilarnej (włośniczkowej) jest zwykle

wyższe niż w żylnej. Przelicznik zależy od hematokrytu, dlatego oznaczanie we krwi pełnej nie

powinno być używane do diagnostyki cukrzycy, ma zastosowanie jedynie w kontroli glikemii

podczas leczenia cukrzycy.

II. Metody oznaczeń

1. Enzymatyczne – wykorzystują różne układy enzymów, spośród nich najczęściej stosowane

metody to:

a. metoda oksydazowa (GOD/POD) – jest jedną z najczęściej używanych metod, cechuje się dobrą

poprawnością i precyzją. Stosowana jest w wersji manualnej i automatycznej. Wykorzystywana

także w suchej chemii, w automatach, gdzie poszczególne składniki reakcji umieszczone są

wewnątrz wielowarstwowych slajdów (np. Vitros firmy Ortho) oraz w glukometrach, gdzie

reagenty umieszczone są na pasku testowym.

Zasada metody:

glukoza + O

2

kwas glukonowy + H

2

O

2

H

2

O

2

+ 4-aminoantypiryna + hydroksybenzoesan

chinonoimina + H

2

O

peroksydaza chrzanowa

oksydaza glukozy

Chemia kliniczna

2011/2012

dla studentów IV roku Analityki Medycznej

Agnieszka Sapa

Strona 2 z 3

Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej

Ilość powstającej barwnej pochodnej jest proporcjonalna do stężenia glukozy w próbce. Akceptorami

tlenu mogą być też 4-aminofenazon/fenol (klasyczna reakcja Trindera). Oksydaza glukozy jest

wysoce specyficzna dla β-D-glukozy, dlatego w środowisku reakcji obecny jest enzym mutarotaza,

gdyż ok. 36 % glukozy znajduje się w formie α. Reakcja wskaźnikowa jest podatna na wpływ

substancji o silnych właściwościach utleniających lub redukujących (m.in. kwas askorbinowy,

moczowy, bilirubina, hemoglobina, glutation, tetracyklina).

b. metoda heksokinazowa – na tej reakcji jest oparta referencyjna metoda oznaczania glukozy,

cechuje się bardzo dobrą poprawnością i wysoką precyzją. Jest swoista tylko dla glukozy, brak

jest interferencji substancji o właściwościach silnie redukujących lub utleniających. Stosowana

jako metoda kinetyczna i punktu końcowego, manualna lub automatyczna.

Zasada metody:

glukoza + ATP

glukozo-6-fosforan + ADP

glukozo-6-fosforan + NADP

+

6-fosfoglukonian + NADPH + H

+

Jest to metoda spektrofotometryczna (tzw. test Warburga). Wzrost absorbancji przy długości fali

340 nm jest wprost proporcjonalny do stężenia glukozy w próbce.

c. metoda z dehydrogenazą glukozy – jest oparta na reakcji wysoce specyficznej dla glukozy,

niewrażliwa na interferencje, wyniki są bardzo zbliżone do uzyskiwanych metodą

heksokinazową. Mimo to nie jest powszechnie stosowana.

Zasada metody:

glukoza + NAD

+

dehydrogenaza glukozy

D-glukono-δ-lakton + NADH + H

+

Wzrost absorbancji przy 340 nm jest wprost proporcjonalny do stężenia glukozy w próbce (test

optyczny Warburga). W środowisku reakcji obecna jest mutarotaza.

d. metoda z użyciem polarograficznej elektrody tlenowej – jest to metoda wykorzystywana

w niektórych automatach.

Zasada metody:

Opiera się na reakcji katalizowanej przez oksydazę glukozy (patrz pkt. a), przy czym mierzone jest

polarograficznie zużycie tlenu w środowisku reakcji. W celu eliminacji wpływu tlenu tworzącego się

de novo z łatwo rozpadającego się H

2

O

2

konieczne jest zastosowanie jednej z następujących reakcji:

H

2

O

2

+ C

2

H

5

OH

katalaza

CH

3

CHO + 2 H

2

O

lub

H

2

O

2

+ 2H

+

+ 2I

-

molibdenian

I

2

+ 2 H

2

O

dehydrogenaza glukozo-6-fosforanu

heksokinaza

Chemia kliniczna

2011/2012

dla studentów IV roku Analityki Medycznej

Agnieszka Sapa

Strona 3 z 3

Katedra Analityki Medycznej
Zakład Chemii Klinicznej

e. czujniki glukozy – wszczepiane podskórnie biosensory :-)

f. GlucoWatch – pomiar glukozy poprzez jej elektroosmozę przez skórę :-)

2. Redukcyjne – oparte na redukcyjnych właściwościach cukrów, które pod względem budowy

chemicznej są aldozami lub ketozami i w środowisku zasadowym można przeprowadzić z ich

udziałem reakcje utleniania-redukcji, addycji i kondensacji. Metody te są nieswoiste dla glukozy,

reagują wszystkie związki redukujące obecne we krwi np. glutation, inne cukry proste. Obecnie

mają znaczenie historyczne.

3. Kondensacyjne – w środowisku silnie kwaśnym heksozy i pentozy ulegają odwodnieniu i tworzą

odpowiednio hydroksymetylenofurfural i furfural, które następnie można sprzęgać z różnymi

aromatycznymi pochodnymi (np. o-toluidyną), tworzą się barwne produkty. Cukry złożone

również biorą udział w reakcji. Metody te są bardziej swoiste niż redukcyjne, gdyż w reakcji

biorą udział tylko cukry ale wciąż nie są swoiste dla glukozy. Obecnie metody te nie są

stosowane.

III. Wg zaleceń Międzynarodowej Federacji Chemii Klinicznej (IFCC) metody do oznaczania

glukozy stosowane w laboratoriach powinny spełniać następujące kryteria:

1. Nieprecyzyjność



3,3 %

2. Obciążenie



2,5 %

3. Błąd całkowity



7,9 %

Zalecana literatura:

- Burtis C. A., Ashwood E. R., Bruns D. E., Sawyer B.G.: Tietz Fundamentals of Clinical Chemistry. 6

th

ed. Saunders

Elsevier Inc., St. Louis, USA, 2008.

- Guder W.G., Narayanan S., Wisser H., Zawta B.: Próbki od pacjenta do laboratorium. Wpływ zmienności

przedanalitycznej na jakość wyników badań laboratoryjnych. Wydanie I polskie (red. M. Woźniak). Medpharm,

Wrocław, 2009.

- Kaplan L. A., Pesce A. J.: Clinical chemistry. Theory, analysis, and correlation. 2

nd

ed. Mosby Co., St. Louis, USA, 1989.

- Definition and diagnosis of diabetes mellitus and intermediate hyperglycemia – report of a WHO/IDF consultation.

World Health Organization 2006.

-

Zalecenia kliniczne dotyczące postępowania u chorych na cukrzycę 2010,

Diabetologia Praktyczna, 2010, 11, supl. A.