Microsoft PowerPoint - Metody oznaczania markerów nowotworowych

2009-05-10

CHOROBY NOWOTWOROWE

• Nowotwór zaczyna się rozwijać, gdy:

– komórki zaczynają wymykać się spod kontroli

mechanizmów decydujących o jej podziałach i

lokalizacji

• W normalnych warunkach Æ

– równowaga pomiędzy tempem podziałów komórek

g p

ę y

a ubytkiem komórek

• Nowotwory

– zachwianie równowagi

(więcej komórek przybywa niż ginie)

– powstają w wyniku

neoplazji

(rozrostu) komórek,

– utrata kontroli nad proliferacją (wynika z

niestabilności genetycznej komórki)

KOMÓRKI NOWOTWOROWE

Komórki, które uległy transformacji nowotworowej.

•

zmiany w błonie komórkowej

– zwiększenie transportu metabolitów
– zwiększenie tworzenia pęcherzyków błonowych
– wzrost ruchliwości białek błonowych

•

zmiany adhezyjne:

– zmniejszenie adhezji powierzchniowej
– zmian w organizacji włókien aktynowych
– zanik struktur fibronektynowych

zanik struktur fibronektynowych

– nadprodukcja aktywatora plazminogenu

zmniejszenie zdolności do przylegania do siebie i do białek macierzy zewnątrzkomórkowej

•

zmiany we wzroście i podziałach komórki:

– spadek zapotrzebowania na czynniki wzrostowe
– nabycie zdolności do wzrostu w zawiesinie
– nabycie zdolności do nieograniczonej proliferacji (immortalizacja)

Większość zmian ma charakter ilościowy.

Dopiero nabycie zdolności do inwazji (naciekania) oraz kolonizacji tkanek
normalnie zajmowanych przez inne typy komorek (Æ

przerzuty

) powoduje,

że stają się one zagrożeniem dla całego organizmu.

Zdolność do nadmiernych, niekontrolowanych podziałów na

skutek:

–

autokrynnej regulacji wzrostu (produkcja własnych czynników

wzrostowych przez komórki nowotworowe)

–

ignorowaniu systemów kontrolujących namnażanie się komórkek

prawidłowych

–

rozregulowaniu procesu proliferacji (między innymi

"prowokowanie" komórki przez zmutowane białka będące

CECHY KOMÓREK NOWOTWOROWYCH

prowokowanie komórki przez zmutowane białka będące

produktami onkogenów do stałych podziałów)

Brak zahamowania kontaktowego

czyli charakterystycznego dla prawidłowych tkanek dystansu

pomiędzy komórkami.

Inwazyjność

czyli zdolność do atakowania sąsiadujących komórek

prawidłowych oraz zajmowania i przerastania ich terytoriów.

CECHY KOMÓREK NOWOTWOROWYCH

Immortalizacja (nie we wszystkich przypadkach)

czyli uzyskanie zdolności do nieograniczonego przeżywania i

wzrostu, "nieśmiertelność" komórek (związana między innymi z

brakiem reakcji na czynniki wywołujące apoptozę).

Brak różnicowania się funkcjonalnego

czyli komórka wskutek nadmiernej proliferacji oraz mutacji

czyli komórka wskutek nadmiernej proliferacji oraz mutacji,

które zaszły w DNA traci zdolność spełniania właściwych sobie

funkcji, zaczyna produkować białka nieprawidłowe lub też

prawidłowe, lecz w zdecydowanym nadmiarze.

Zdolność do tworzenia przerzutów (metastaz)

czyli odłączanie się od nowotworu, wchodzenie do naczyń

krwionośnych lub limfatycznych i krążenie w krwioobiegu, a

następnie atakowanie innych tkanek i zapoczątkowanie

nowych skupisk nowotworowych.

ETAPY KANCEROGENEZY

1. EKSPOZYCJA NA CZYNNIKI

KANCEROGENNE Æ

PREINICJACJA

2. NAGROMADZENIE MUTACJI I

URUCHOMIENIE PROCESU

TRANSFORMACJI NOWOTWOROWEJ Æ

INICJACJA

3. SELEKCJA KLONALNA – NABYCIE

ZDOLNOŚCI DO TWORZENIA

PRZERZUTÓW Æ

PROGRESJA

PREINICJACJA

• Ekspozycja na czynniki kancerogenne:

– fizyczne: promieniowanie jonizujące, UV
– chemiczne: konserwanty, barwniki
– biologiczne: wirusy, bakterie, pasożyty

• Predyspozycje genetyczne tj.

sprawność metabolizowania kancerogenów polimorfizm genów

– sprawność metabolizowania kancerogenów, polimorfizm genów

kodujących mechanizmy naprawcze.

uszkodzenie DNA

aktywacja
punktów
kontrolnych

aktywacja programów
transkrypcyjnych

aktywacja programów
naprawczych

apoptoza

2009-05-10

INICJACJA

• Pojawienie się mutacji spontanicznej lub odziedziczonej

(gł. w jednym z mechanizmów naprawczych DNA):

– uszkodzenie genów kontrolujących podziały komórkowe np.

gen p53 (białko p53 reguluje przebieg apoptozy i cyklu

komórkowego

– niesprawne mechanizmy naprawcze
– blokada procesu apoptozy
– ucieczka przed mechanizmami układu immunologicznego

• Jedna mutacja nie jest wystarczająca do transformacji

nowotworowej, potrzebny tzw.

szlak mutacyjny.

PROGRESJA

• przekształcenie się komórki normalnej w

nowotworową

• rozrost (tworzenie guza)
• utworzenie dróg inwazji poprzez rozwój

naczyń krwionośnych (

angiogeneza

źródło składników odżywcze i wzrostowe)

• rozluźnienie struktury guza
• selekcja klonów komórek, których produkty

umożliwiają szybki rozrost i tworzenie

nacieków Æ utrata wł. adhezyjnych, wzrost

poziomu enzymów proteolitycznych

lizujących błonę podstawną

• przełamanie bariery białek macierzy

zewnątrzkomórkowej, uwalnianie komórek

z guza i przemieszczanie do innych tkanek

ANGIOGENEZA

Ag NOWOTWOROWE

U wielu osób z rozwijającym się nowotworem obserwuje się aktywność immunol.
przeciwko kom. nowotworowym

- Ab anty-komórki nowotworowe
- zdolność limfocytów chorego do odpowiedzi na Ag nowotworowe

1) Istnieją Ag nowotworowe

2) Uzasadnione są próby immunoterapii nowotworów

PROBLEM:

większość Ag nowotworowych
Æ

nie ma charakteru Ag swoistych (powstają spontanicznie)

czasem występuje w niewielkich ilościach na niektórych komórkach prawidłowych

TAA (Tumor Associated Antigens)

Cel badania Ag nowotworowych:

a) Wykrywanie
b) Monitorowanie
c) Leczenie

PODZIAŁ Ag NOWOTWOROWYCH

1) Ag powszechnie występujące

obecne na komórkach nowotworowych i różnych komórkach

prawidłowych
- fragmenty telomerazy

2) Ag różnicowania

- obecne na komórkach nowotworowych i prawidłowych komórkach, z
których wywodzi się nowotwór
- CAE, PSA, Ag czerniaka (gp100, MART-1)

3) Ag rakowo-jądrowe

- oprócz komórek nowotworowych występują na spermatocytach i
spermatogoniach

4) Ag swoiste dla nowotworu TSA (Tumor Specific Antiens))

- występują tylko na komórkach zmienionych nowotworowo

Nowotwory człowieka w większości nie zawierają TSA !!! wyjątki

Ag NOWOTWOROWE

• Brak lub niska swoistość Ag nowotworowych.

– nie wyklucza możliwości wykorzystania ich do wykrywania nowotworów

i monitorowania leczenia

• Niekiedy Ab przeciw Ag nowotworowym mogą indukować

zniszczenie komórek nowotworowych (duże stężenie Ag) i

d ić” k

ó ki

idł

(

i j

t ż i A )

„oszczędzić” komórki prawidłowe (mniejsze stężenie Ag).

• TAA występuje poza nowotworem tylko na nielicznych komórkach

prawidłowych (ich uszkodzenie podczas terapii nie spowoduje
poważnych efektów ubocznych) (komórki nowotworowe czerniaka a
bielactwo – niszczenie melanocytów).

• Niekiedy brak swoistych Ag może być atutem.

Ag obecny na komórkach czerniaka i limfocytach B.

2009-05-10

W rozpoznawaniu Ag nowotworowych uczestniczą:

limfocyty T CD4+ (Ag złuszczane z kom.) i CD8+ (im bardziej
złośliwy nowotwór, tym mniejsza ekspresja MHC kl. I na pow.
kom. nowotworowej)\

Ag NOWOTWOROWE

)

CD19-CD22 wyst. na pow. chłoniaków z limfocytów B,
alfafetoproteina (AFP) – rak wątroby i jądra (prawidłowa
wątroba, pęcherzyk żółciowy, przewód pokarmowy)
PSA (Prostate Specific Antigen) – Ag swoisty dla
gruczołu krokowego

limfocyty T i Ab np. zespół Ag karcynoembrionalnych CEA

rak jelita grubego, trzustki, żołądka
rzadziej płuc, sutka, trzonu macicy

PODZIAŁ Ag NOWOTWOROWYCH

•• Ag indukowane przez onkogeny

Ag indukowane przez onkogeny

- onkogenne DNA i RNA wirusów

kodują powierzchniowe i jądrowe Ag wirusowe, które ulegają
ekspresji w komórce lub na jej powierzchni zmieniając ją
nowotworowo. Ag takie występują we wszystkich komórkach
zakażonych przez te same wirusy. Np. wykazano zależność
pomiędzy zakażeniem wirusem Hepatitis B a nowotworami wątroby

pomiędzy zakażeniem wirusem Hepatitis B a nowotworami wątroby.

•• Ag indukowane przez substancje chemiczne

Ag indukowane przez substancje chemiczne

- związki chemiczne

indukują przypadkowe mutacje DNA, co może prowadzić do indukcji
ekspresji Ag nowotworowych.

ODPOWIEDŹ PRZECIWNOWOTWOROWA

Mechanizmy efektorowe odpowiedzi
immunologicznej:
• aktywność komórek NK
• cytotoksyczność komórek zależna od

Ab (ADCC)

• cytotoksyczność Ab zależna od

dopełniacza (kompleks Ag-Ab Æ

aktywacja dopełniacza Æ liza komórki)

• cytotoksyczność limfocytów CTL

• cytotoksyczość pobudzonych makrofagów i neutrofilów

• aktywność cytokin wydzielanych przez makrofagi i limfocyty T

helper

TERAPIA NOWOTWORÓW

• Leczenie chirurgiczne
• Chemioterapia
• Radioteprapia
• Immunoterapia - uzupełnia ww. metody leczenia:

–– czynna

czynna

- efekt leczniczy uzyskuje się poprzez wzmożenie reaktywności układu

immunologicznego pacjenta. Obejmuje:

d i k

h l b i h A

t i

i ki

• podanie kom. nowotworowych lub ich Ag w postaci szczepionki

czynna terapia swoista

• aktywację mechanizmów immunologicznych za pomocą preparatów

immunostymulujących

czynna terapia nieswoista.

(Efekt jest wynikiem bezpośredniego działania cytokin na kom. nowotworowe)

–– bierna

bierna

- podawanie mAb przeciwko Ag nowotworowym, stosuje się Ab

zmodyfikowane np. enzymami w celu zwiększenia ich skuteczności.

–– adoptywna

adoptywna

- podanie dożylne lub miejscowe kom. immunologicznych pacjenta

aktywowanych Ag nowotworowymi poza organizmem gospodarza.

–– pośrednia

pośrednia

- blokowanie czynników wzrostu lub angiogenezy.

SZCZEPIONKI

PRZECIWNOWOTWOROWE

• Powinny wykazywać działanie lecznicze, nie profilaktyczne.
• Najbardziej przydatne w leczeniu nowotworów zdolnych do indukcji

odp. immunologicznej o dobrze określonych i swoistych Ag np.
czerniak.

• Mogą zawierać:

– odpowiednio przygotowane - zabite napromieniowane - komórki

odpowiednio przygotowane zabite, napromieniowane komórki
nowotworowe auto- i allogeniczne lub ich Ag podawane łącznie z
adiwantami (BCG, zw. glinu) lub cytokinami (IL-2, IL-12)

– zmodyfikowane metodami inżynierii genetycznej kom. nowotworowe, do

których DNA wprowadzono określone geny: IL-2, IL-4, IL-7, TNF, IFN-

lub geny dla cząsteczki kostymulującej CD80 niezbędnej w procesie
prezentacji Ag

– drobnoustroje wewnątrzkomórkowe np. adenowirusy lub Listeria

monocytogenes

z wprowadzonymi genami dla Ag nowotworowych Æ

skuteczna prezentacja

– komórki dendrytyczne (KD), które jako cząsteczki APC są niezbędne do

inicjacji odp. Immunologicznej.

SZCZEPIONKI

PRZECIWNOWOTWOROWE

• Skuteczność szczepionek jest stosunkowo niska,

– ponieważ w czasie od momentu pobrania komórek nowotworowych od

pacjenta do momentu podania szczepionki, nowotwór rozwija się i ulega

zmianom, więc nie są to już te same komórki użyte do szczepionki.

•• Szczepionka profilaktyczna

Szczepionka profilaktyczna

– podawana osobom z grup ryzyka.
– źródłem komórek nowotworowych mogą być hodowle komórek o dobrze

sprecyzowanych Ag lub komórki nowotworowe rodziny.

– wzbudzenie odpowiedzi immunologicznej skutkuje wytworzeniem

limfocytów pamięci immunologicznej.

– w chwili rozwoju nowotworu od razu są gotowe mechanizmy odporności

przeciwnowotworowej, które nie doprowadzą do różnicowania komórek i

zniszczą je zanim ulegną modyfikacjom.

2009-05-10

guz usunięty
chirurgicznie

otrzymuje się
pojedyńcze
komórki rakowe

wprowadzenie
genu dla
cytokin

poddaje się je
promieniowaniu X
(zahamowanie
proliferacji)

wprowadzenie
komórek do
organizmu
pacjenta

rozpoznanie
Ag przez KD

p j
(podskórne lub
dożylne)

eliminacja komórek
nowotworowych

swoiste
limfocyty,
których
aktywność jest
skierowana
przeciwko
komórkom guza

aktywacja
limfocytów T/B

Przeciwciała

monoklonalne

monoklonalne mAb

mAb

• poddane modyfikacjom:

– połączone z toksynami np. dyfterotoksyna
– połączone z lekami cytotoksycznymi
– połączone z enzymami przekształcającymi leki p-nowotworowe z formy

p ą

ją y

nieaktywnej (prolek) w aktywną (lek)

– znakowane radioizotopami np. jod 131
– Ab o podwójnej swoistości Æ 1 ramię jest skierowane do Ag

nowotworowego, a 2 ramię ma zdolność rozpoznawania CD3 limfocyta
Æ

aktywacja komórek efektorowych

DIAGNOSTYKA NOWOTWORÓW

Ma na celu:

– określenie pochodzenia nowotworu
– oznaczenie etapu różnicowania komórki zdrowej
– określenie progresji nowotworu u chorego
– poszukiwanie przerzutów i ich umiejscowienia

– poszukiwanie przerzutów i ich umiejscowienia

Cancer-killing vaccinia virus (a smallpox relative, in green)
spreading through 3-D cultured tumor cells (red).
Image: Courtesy of Stephen Thorne

DIAGNOSTYKA NOWOTWORÓW

Metody:

• mikroskopia świetlna, elektronowa
• immunofenotypowanie

– badanie antygenów przy zastosowaniu specyficznych przeciwciał
– metoda ELISA
– metoda cytometrii przepływowej
– metoda radioimmunologiczna

• cytogenetyka

• biologia molekularna

– PCR Æ umożliwia in vitro amplifikację wybranych sekwencji DNA przy

użyciu polimerazy DNA i syntetycznych oligonukleotydów (tzw. starterów)

komplementarnych do końców wybranych sekwencji DNA

– RT - PCR (reverse transcription PCR) Æ modyfikacja reakcji PCR do

wykrywania i analizy cząsteczek RNA

• analiza biochemiczna

•

serum is incubated in wells which have been coated with purified Ab

ELISA Technique

Negative control

Sample-low concentration

Sample-high concentration

•After washing to remove unbound serum constituents

•An enzyme-labelled 2

Ab anti Ag (from patient serum) is added

Negative control

Sample-low concentration

Sample-high concentration

2009-05-10

• Enzyme-labelled Ab is visualised by addition on a chromogenic
enzyme substrate

• colour development is proportial to the concentration of Ab in the
test serum – measured spectrophotometrically

Negative control

Sample-low concentration

Sample-high concentration

Immunofluorescence

UV light

Fluorescence – emision of light of one
color while a substance is irradiated
with light of different color.

PCR, RT

PCR, RT -- PCR

PCR

• analiza DNA lub RNA tkanki guza
• diagnoza
• prognoza
• zapewnia wykrywanie:

• śladowych ilości materiału guza (1 komórki nowotworowej)

śladowych ilości materiału guza (1 komórki nowotworowej)

• ekspresji genów związanych z nowotworem
• rearanżacji genów immunoglobulin
• amplifikacji onkogenów, np. myc - N
• mutacji genu supresorowego p53

• wysoka czułość metody

• bardzo czuła i bardzo szybka diagnoza
• monitorowanie choroby
• wykrywanie choroby resztkowej przy remisji cytomorfologicznej

Zasada działania reakcji PCR

Krok 1 - Denaturacja (94°C)
W wyniku ogrzewania dochodzi do rozplecenia podwójnej helisy DNA.

Zasada działania reakcji PCR

Krok 2 – Przyłączanie starterów (60°C)
Dodanie jednoniciowych primerów które łączą się z DNA którego

poszukujemy (primery łączą się z jednoniciowym DNA ze względu na
komplementarność).

2009-05-10

Zasada działania reakcji PCR

Krok 3 – Wydłużanie DNA (72°C )
Dodajemy pojedyncze nukleotydy i enzym (polimerazę

Taq polymerase

Stosujemy polimerazę bakteryjną, ponieważ temperatura reakcji jest

wysoka, a optymalna temperatura dla ludzkiej polimerazy to około

37°C.

Elektroforeza w żelu agarozowym

Niektóre badane markery biologiczne:

Badane markery

Badana tkanka lub płyn Co

oznacza

obecność

markera?

PSA

krew

Rak prostaty

Addukt aflatoksyna B1-
DNA

Mocz, wątroba

Zwiększone ryzyko raka
wątroby

Addukt PHA-DNA

Krew, płuca, łożysko

Zwiększone ryzyko raka
płuc

Mutacje w genie p53

Pierś, wątroba, płuco

Podwyższone ryzyko
zachorowania na różne
nowotwory

Brak genu S- transferazy
glutatnionowej

Krew

Podwyższone ryzyko
raka płuc i pęcherza

Mutacja genu BRCA1

Krew

Znacznie podwyższone
ryzyko rak piersi i jajnika

•

BRCA 1, BRCA2

Diagnostyka mutacji genów BRCA1 i BRCA2 odpowiadających za podatność na dziedziczne
nowotwory piersi i jajników.

•

HPV

–

Diagnostyka wirusa powodującego zakażenie brodawczakiem ludzkim. Badamy obecność 9 typów wirusa.

–

Jest to wirus onkogenny (wysokiego i średniego ryzyka) powodujący raka szyjki macicy lub zmiany
przednowotworowe, polipy, kłykciny.

•

HTGR

Diagnostyka ryzyka nowotworowego :

– przy terapii hormonalnej oraz po stosowaniu hormonalnych środków antykoncepcyjnych

– badanie obejmuje mutacje genów kodujących białka odpowiedzialne za nadwrażliwość

na estrogeny

określając tym samym ryzyko zapadnięcia na nowotwory wskutek działania hormonów

płciowych

– badanie to powinna przejść każda kobieta decydująca się na przyjmowanie hormonów

płciowych

– na niekorzystny efekt mutacji szczególnie wpływa zażywanie hormonów przez kobiety

przed 35 rokiem życia (antykoncepcja hormonalna), zwiększając 10-krotnie ryzyko
zapadnięcia na nowotwory do ok. 90%

– uszkodzenia (mutacje) tych genów mogą być przyczyną skłonności do tworzenia się wielu

nowotworów, takich jak

np.: rak tarczycy, rak piersi, rak okrężnicy, czerniaki, rak jajników, rak jelita

grubego.