Wykład 21 13.05.2013

Ca-125

• mucyno-podobny heterogenny kompleks glikoproteiny z licznymi bocznymi łańcuchami węglowodanowymi

• 2 determinanty Ag: epitopy reagujące odpowiednio z MoAb OC 125-podobnymi

• ekspresja Ag: w komórkach wyślielających jamy ciała płodu w PM 11- podobnymi komórek dojrzałego prawidłowego nabłonka opłucnej, osierdzia, otrzewnej, jajowodzie, błonie śluzowej szyjki i trzonu macicy

• brak ekspresji w komórkach prawidłowego dojrzałego jajnika

• obecność Ag w płynach z cyst, wysiękach z opłucnej, mleku matek, płynie owodniowym, nasiennym

• w surowicy kompleks z inną glikoproteiną (ciężar cząsteczkowy 400-2000 kDa)

• w warunkach fizjologicznych stężenie w osoczu <35 U/ ml u 99% zdrowych kobiet

< 65 U/ml u 99,8%

• <30 U/ml stężenie istotnie niższe u kobiet po menopauzie

• t1/2= 2-6 dni

• ↑ stężenia- menstruacja, I trymestr ciąży, gruźlica, marskość wątroby, nienowotworowe choroby narządu rodnego, endometriozy

PSA

• glikoproteina wytwarzana zasadniczo wyłącznie przez komórki nabłonkowe stercza zdolność jej produkcji zachowują komórki gruczolaka, raka stercza i jego przerzutów

• należy do grupy ludzkich kalikrein (hklK3), gen PSA zlokalizowany na dłuższym ramieniu chromosomu 19, znaczny stopień homologii w budowie cząsteczki z kalikreiną mięśniową (hklK1) oraz gruczołową (hklK2)

• 
  poziom PSA mRNA i PSA w komórkach kontrolowany jest przez androgeny

• t1/2= 2-3 dni

• w warunkach fizjologicznych komórki nabłonkowe stanowią ochronę zabezpieczającą ucieczce Ag do krążenia

• Płyn nasienny 0,3-3,0 ng/ml

• ↑ stężenia z wiekiem

• wartości odcinające

• Chen et al. <2,8 ng/ml

• Ercole et al. <4.0 ng/ml

• Brawer et al. - tylko 85% mężczyzn ma stężenie <4,0 ng/ml

• wartość odcinająca 4,0 ng/ml ustalono arbitralnie, jako rodzaj optymalnego bilansu pomiędzy czułością i swoistością diagnostyczną

• wartości graniczne dla wieku

• 40-49 lat do 2,5 ng/ml

• 50-59 lat do 3,5 ng/ml

• 60-69 lat do 4,5 ng/ml

• 70-79 lat do 6,5 ng/ml

• ↑ PSA w osoczu/ surowicy obserwowany jest w przypadku

• nadmiernej ilości komórek zdolnych do produkcji Ag

• nieszczelności bariery tkanka, komórki nabłonka kanalika nasiennego/krew

• zablokowanie światła kanalików gruczołu

• zmian przepuszczalności błon komórkowych

• zmian w wewnątrzkomórkowych strukturach

• stan zapalny gruczołu krokowego

• naciekania naczyń krwionośnych i limfatycznych

• ↑ stężenia markera z dużym prawdopodobieństwem świadczy o obecności nowotworu, równocześnie jednoznacznie określa lokalizację procesu chorobowego

• PSA nie jest markerem raka stercza- cechuje go swoistość narządowa w stosunku do tkanki gruczołu!!!

• ↑ mierny a interpretacja kliniczna

• 
  stężenie regulowane przez androgeny

• sezonowa zmienność osobnicza 16-24%

• ejakulacja przyczyną przejściowego ↑ stężenia

• jazda na rowerze

• badanie przezodbytnicze stercza może być przyczyną miernego ↑ stężenia Ag

• transrektalne USG może powodować 2x ↑ stężenia PSA

• biopsja stercza może powodować nawet 60x ↑stężenia PSA

• komórki niskozróżnicowane raka mogą nie posiadać zdolności syntezy Ag

Formy molekularne PSA w surowicy

1. 
   Ag wolny (fPSA)- forma dwułańcuchiwa o krzyżowych wiązaniach siarczkowych przypuszczalnie pozbawiona aktywności enzymatycznej- immunorekatywny (5-40% całości)

2. Kompleks z białkami ciążowymi o budowie analogicznej do A₂M (śladowej ilości)

3. kompleks z α1-antytrypsyną ( jedynie przy wysokich stężeniach PSA)

4. kompleks z inhibitorami białka C (śladowe ilości) - immunoreaktywny

5. kompleks z α2-makroglobuliną (PSA A₂M) w proporcji molalnej 1:1 stanowi ok 60% uwolnionego do krążenia Ag.

• T1/2= 2-4 min (cząsteczka inhibitora opłaszcza cząsteczkę Ag blokując dostęp do jego epitopów)

6. kompleks z α1-chymotrypsyną (PSA- ACT) w proporcji molalnej 1:1 (cząsteczka serpiny wiążąc się z cząsteczką Ag pozostawia dostęp do niektórych jego determinant)

• główna forma immunoreaktywna w PSA w surowicy!!!

tPSA

• 635 reszt AA

• zawartość węglowodanów16,7%

• t1/2= 72h

• niektóre epitopy pozostają dostępne dla Ab ( 7 domen)

fPSA

• t1/2= 1-2h

• wszystkie epitopy dostępne dla Ab (epitopy 1 domena wyłącznie na cząsteczce wolnego Ag)

• 237 reszt AA

• zawartość węglowodanów 8,3%

Zasada metody tPSA (VIDA)

• zakres pomiarowy 0,04-100 mg/ml

• podstawowym badaniem jest immunoenzymatyczna metoda kanapkowa przebiegająca 2etapowo z końcowym odczytem chemiluminescencji

• I etap - znajdujące się w próbce Ag specyficzne dla prostaty łączą się z MoAb opłasczonymi na cząsteczkach magnetycznych

• II etap- fosfataza alkaliczna związana z MoAb łączy się z kompleksem Ag/Ab tworząc kanapkę

• podczas ostatniego etapu podłoże które ma styczność z koniugatem fosfatazy alkalicznej

• tPSA <4,0 ng/ml niskie ryzyko raka stercza

• 2,6-4,0 ng/ml 22% raków- głównie postać ograniczona do gruczołu

• 2,0-3,9ng/ml 19% raków- głównie postać ograniczona do gruczołu

• tPSA 4-10 ng/ml

• szara strefa diagnostyczna

• 20-40% raków stercza ( przy ujemnym DRE: 12-32%)- około 63% postać ograniczona do gruczołu

• tPSA <10 ng/ml

• 50% raków stercza- tylko u 25% postać ograniczona do gruczołu

Zasada metody fPSA (VIDAS)

• zakres pomiarowy do 40 ng/ml

• podstawą badania jest immunoenzymatyczna metoda kanapkowa przebiegającaa Iietapowo z końcowym odczytem fluorescencji ELFA

• wchodzące w skład zestawu pipetki są nośnikami fazy stałej i służą jako pipety podczas badań. Wszystkie odczynniki potrzebne do badania są gotowe do użycia i zawarte w szczelnie zamkniętych paskach testowych

• wszystkie etapy badania są wykonywane automatycznie przez aparat

• próbka jest cyklicznie podciągana przez SPR i wypuszczana

• Producent umożliwia Ab przytwierdzonym do wewnętrznej ścianki pipetki SPR wychwyt wolnej frakcji specyficznego Ag prostaty obecnego w próbce. Niezwiązane składniki eliminowane są podczas etapu płukania. Następnie Ab wyznakowane alkaliczną fosfatazą inkubowane wewnątrz pipetki SPR przyłączają specyficzny Ag prostaty. Niezwiązany konjugat eliminowany jest podczas etapu płukania. Podczas ostatniego etapu substrat ( fosforan-4-metyloumbeliferylu) jest dynamicznie inkubowany wewnątrz pipetki SPR

• enzym substratu katalizuje hydrolizę substratu do fluoryzującego produktu (4-metyloumeliferylu), następnie mierzona przy 450nm

• Natężenie fluorescencji jest wprost proporcjonalne do stężenia fPSA obecnego w próbce

• pipetka SPR- wnętrze w czasie produkcji opłaszczone jest mysimi MoIg skierowanymi przeciw wolnej frakcji specyficznego Ag prostaty. Każdy SPR jest oznaczony kodem „fPSA”

• pasek testowy- składa się z 10 zakrytych folią studzienek, zawierająca kod paskowy. Pierwsza studzienka jest otwarta, do niej pipetuje się określoną objętość substancji badanej.

Przygotowanie próbki- możemy otrzymywać błędne wyniki

• przedanalityczne zalecenia

• prawidłowe pobranie z obligatoryjną homogenizacją próbki (delikatne obracanie) natychmiast po pobraniu próbki

• odczekanie 3h

• próbki powinny być otrzymywane w pozycji pionowej od momentu pobrania do momentu wirowania

• analityczne zalecenia

• zastosowanie warunków wirowania-

• prędkość, czas, temperatura, próbki po rozmrożeniu homogenizowaći oczyścić przez wirowanie 10min/2000g

• przed rozpoczęciem analizy najlepiej jeszcze raz odwirować próbki

• sprawdzić czy na powierzchni próbki nie ma bąbelków. Jeśli tak to należy je usunąć

• pobrać próbkę spod warstwy lipidowej i przenieść ją do innego naczynia

• surowice oczyszczone mogą być przechowywane w temperaturze 2-8st C/24h potem musi zostać zamrożona w -25/-6stC (max 2 miesiące). Przed przystąpieniem do oznaczenia próbkę należy wymieszać i odwirować

• Interferencje związane z próbką

• pomimo braku znaczącego wpływu na badanie hemolizy (300 umol/l), lipemii (3omg/ml), bilirubinemii (do 670 umol/l) zaleca się by nie używać próbek mocno zhemolizowanych, lipemicznych czy z hiperbilirubinemią. Do badania należy pobrać nową próbkę.

Udział wolnego PSA- wskaźnik poszerzający wartość diagnostyczną

Rak jelita grubego- objawia się krwią w kale, zaparciami, krwawieniami z odbytu oraz bólem w dolnej części brzucha. Najczęściej w okrężnicy lub odbytnicy. Drugi pod względem zachorowalności nowotwór złośliwy w Europie

Badanie przesiewowe

• test na krew utajoną w kale

• kolonoskopia- weryfikacja dodatniego wyniku testu

• relatywnie często przerzuty drogą naczyń krwionośnych i chłonnych do wątroby, płuc, jajników, nadnerczy, mózgu i kości

Przyczyny

• wrzodziejące zapalenie okrężnicy

• łagodne gruczolaki jelit (polipy) około 10 lat

• ubogoresztkowa dieta (brak warzyw, nadmiar tłuszczów, czerwonego mięsa)

• wiek- 90% diagnozowanych >50r.ż., szczyt zachorowań >60r.ż.

• Predyspozycje:

• rodzinny rak okrężnicy lub odbytu

• rodzinny zespół polipowatości

• przewlekłe zapalenie, choroba jelit

Objawy

• pojawiają się dopiero gdy choroba osiąga bardziej zaawansowaną fazę

• krew w stolcu

• krwawienia z odbytu

• nagła i nie dająca się wytłumaczyć zmiana rytmu i liczby wypróżnień

• zaparcia spowodowane zwężeniem jelita (polipy do wnętrza)

• zmiana kształtu stolca

• anemia, osłabienie sprawności, chudnięcie, wzrost podatności na zmęczenie, gorączki

• bóle w dole brzucha, nudności, wymioty, trudności w przełykaniu

Brak przydatności w badaniach przesiewowych: czułość 36%, swoistość 87%

Leczenie:

• chirurgiczne

• radioterapia

• chemioterapia

• różne schematy leczenia skojarzonego

Stężenie CEA w surowicy zależne od

• zaawansowania

• stopnia zróżnicowania

• ploidii DNA

• w niezłośliwych zmianach stężenia <10ng/ml

• u chorych objawowych stężenie >25-50 ng/ml- wysokie prawdopodobieństwo nowotworu

• ekspresja w komórkach

Rak jajnika- nowotwór złośliwy głównie u kobiet, w okresie około i pomenopauzalnym. Wywodzi się z komórek nabłonka pokrywającego jajnik. Początkowo bezobjawowo, zwykle objawy pojawiają się, gdy guz przekracza 7cm.

Objawy:

• ból w podbrzuszu

• zwiększenie obwodu brzucha

• objawy ucisku na narządy sąsiednie- drogi moczowe, układ pokarmowy, krwawienia z pochwy

Niespecyficzne objawy

• utrzymujące się dłuższy czas problemy ze strony układu pokarmowego

• męczenie, ogólne osłabienie, złe samopoczucie, brak apetytu

• ból przy oddawaniu moczu, parcie na pęcherz

Diagnostyka

• badanie ginekologiczne

• USG 3D i 4D (obejrzenie przekrojów guza pod różnymi kątami i ocena czy zmiana jest łagodna czy nowotworowa)

• badanie histopatologiczne

• Ca-125 i CA-19.9 (markery biochemiczne)

• mutacje genów BRCA1 i BRCA2

• optymalizacja efektywności przez przyjęcie dla CA-125 wartości odcinającej 30 U/ml

CA-125 -monitowanie

• po leczeniu w założeniu radykalnym ↓ stężenia do normy

• po leczeniu operacyjnym (↓ masy guza) i następnej chemioterapii biologiczny okres półtrwania wynosi 20dni. Normalizacja następująca do 90 dni od rozpoczęcia leczenia są wykładnikami dobrej reakcji na leczenie i dobrym wskaźnikiem diagnostycznym

• zgodność w 87% pomiędzy zmianami stężenia Ag a przebiegiem choroby

• >35 U/ml po zakończeniu terapii Igo rzutu- dodatnia wartość predykcyjna, 95% dla potwierdzenia obecności resztkowego nowotworu

• <35 U/ml po zakończeniu terapii Igo rzutu- nie wyklucza u 50% chorych obecności nowotworu

Rak szyjki macicy

• stanowi 25-30% nowotworów narządu rodnego

• HPV, zakażenie chlamydiami, HIV, CMV, EBV, przewlekłe bakteryjne zapalenia pochwy

• liczne ciąże i porody, zwłaszcza w młodym wieku

• 75% stanowią raki płaskonabłonkowe, pozostałe to gruczolakoraki, postacie mieszane, raki niezróżnicowane

• większość kobiet ze zmianami przedrakowymi nie ma charakterystycznych objawów (jedynie wstępujące objawy mogą być związane z zapaleniem szyjki macicy)

Rak szyjki na podłoży zmian przedrakowych rozwija się od 3-10lat

Objawy niespecyficzne:

• krwiste upławy o nieprzyjemnym zapachu

• krwawienia międzymiesiaczkowe

• krwawienia kontaktowe i po stosunku

Diagnostyka

• cytologia

• SCC-Ag - marker z wyboru

• zawartość Ag w cytozolu komórek raka szyjki macicy 300-1500x większa aniżeli w prawidowych komórkach nabłonka gruczołowego

• ekspresja zależna od zróżnicowania- najwyższa w dobrze zróżnicowanych nowotworach

• brak przydatności w badaniach przesiewowych i rozpoznawaniu nowotworów, ewentualnie diagnostyka różnicowa

6

---