4.03.2012

Wykład 14

W wyniku reakcji antygen-przeciwciało tworzy się kompleks immunologiczny, którego powstaniem możemy wykrywać reakcją precypitacji i aglutynacji.

Precypitacja - antygeny rozpuszczalne

• zachodzi po dodaniu do roztworu antygenów swoistych przeciwciał uwidaczniających się jako zmętnienie czy strąt (reakcja probówkowa)

• wytrącanie kompleksów zachodzi jedynie przy odpowiednim stosunku ilościowym obu składników reakcji = strefa równowagi (ekwiwalencji)

• ilościową ocenę powstałych kompleksów immunologicznych można zatem określić poprzez pomiar zmętnienia roztworu, w którym doprowadzono do reakcji antygen - przeciwciało, można tego dokonać metodą:

• turbidymetryczną - światło przechodzące

• nefelometryczną - światło rozproszone

W metodach zmętnieniowych przeszkadzają związki barwne (hemoglobina, mioglobina, bilirubina)

Jeżeli w metodzie nefelometrycznej jako źródło światła zastosowano laser (światło monochromatyczne) to bardzo poprawia się dokładność pomiarów. Możemy jednocześnie obserwować postępy zachodzących reakcji poprzez pomiar wielokrotny w małych odstępach czasu tzw. „rate nephelometry”.

Krzywa precypitacji jako funkcja ilości powstałych kompleksów immunologicznych i ilości antygenów przy stałej ilości przeciwciał. Powstające kompleksy są trwałe i jest ich najwięcej w punkcie ekwiwalencji.

Precypitacja w fazie stałej - w żelach, wykorzystywana jest najczęściej w probówkach, na płytkach szklanych lub plastikowych, pokrytych warstwą agaru lub agarozy (agar modyfikowany sztucznie dla ujednolicenia struktury wewnętrznej i uzyskania stałej elektroendoosmozy).

Oba składniki dyfundują ku sobie, tworząc w miejscu zetknięcia pierścienie precypitacyjne.

• 
  przy stałym [Ag] można określić orientacyjnie [Ab] lub

• przy stałym [Ab] można określić orientacyjnie [Ag]

Dokonuje się pomiaru odległości pierścienia od dna probówki, porównując ją z wynikami uzyskanymi dla roztworów o znanych stężeniach.

Immunoelektroforeza (niedobory immunologiczne, identyfikacja pasma M)

I etap:

Rozdział elektroforetyczny przeprowadzany na szklanych płytkach pokrytych żelem agarowym lub agarozą. Badaną próbkę umieszcza się w studzience wyciętej w podłożu i poddaje działaniu pola elektrycznego (1-2h)

II etap:

Immunodyfuzja rozdzielanych białek antygenowych i odpowiednich przeciwciał. W agarze wycina się rowek równoległy do kierunku migracji i do niego dodaje się surowicę odpornościową zawierającą przeciwciała przeciwko poszczególnym białkom. Płytkę inkubuje się w temperaturze pokojowej 24 h. Białka dyfundują swobodnie we wszystkich kierunkach, a w miejscu ich zetknięcia, w strefie ekwiwalencji, powstają dobrze widoczne linie precypitacyjne. Mają one zwykle kształt łuków skierowanych wypukłą stroną w kierunku rowka z surowicą odpornościową. Liczba linii precypitacyjnych zależy od złożoności danego materiału i od rodzaju zastosowanej surowicy odpornościowej.

Elektroimmunodyfuzja (składniki dopełniacza, Alb, Cer, AFP)

• ściśle określona, stała zawartość przeciwciał w podłożu

• stosowana do składowych dopełniacza, albumin, ceru plazminy, AFP

• na płytkę szklaną wylewa się agar zawierający przeciwciała skierowane przeciwko białku, którego stężenie chcemy ocenić

• do studzienek dodaje się badany płyn ustrojowy i poddaje elektroforezie

• równolegle wykonuje się krzywą kalibracyjną, poddając elektroforezie w tych samych warunkach dane białko w kolejnych znanych stężeniach

• wędrujące w polu białko tworzy z przeciwciałami z podłoża w strefie ekwiwalencji precypitat widoczny jako linie w kształcie stożka (rakietki)

• przy stałej zawartości przeciwciał w podłożu istnieje wprost proporcjonalna zależności między białkiem a jego migracją

• stężenie badanego białka odczytuje się z wykreślonej krzywej

• metoda ta nie nadaje się do ilościowej oceny immunoglobulin

Immunodyfuzja radialna

• metodą tą oznacza się poziom immunoglobulin głównie klasy M, G i E oraz stężenie składowych dopełniacza

• ściśle określona stała zawartość przeciwciał w podłożu o danej swoistości w odpowiednio dobranym stężeniu miesza się z płynnym agarem i wylewa na płytkę

• po zastygnięciu wycina się w nim studzienki i wypełnia roztworem badanego białka

• białko dyfunduje ze studzienki do agaru i tworzy z przeciwciałami z podłoża kompleksy immunologiczne

• w pobliżu studzienek gdzie stężenie antygenu jest duże tworzą się kompleksy rozpuszczalne

• w miarę jak antygen dyfunduje coraz dalej, jego stężenie maleje i w strefie ekwiwalencji tworzą się nierozpuszczalne kompleksy (pierścieniowe strefy precypitacji)

• średnica tych pierścieni przy stałym stężeniu przeciwciał jest wprost proporcjonalna do stężenia antygenu

• stężenie badanego białka wylicza się na podstawie wykonanej równolegle krzywej kalibracji

Wady

• nie uzyskujemy rozdziału o dobrej rozdzielczości, jeżeli jest zbyt niskie stężenie antygenu

• rozdział zależy od masy cząsteczkowej i od stanu przeciwciał (monomery unikają szybciej do podłoża, zaś dimery wolniej)

• jeżeli prowadzimy oznaczenia dimerów to wzorcami muszą być również dimery

• odczyt następuje po 24 godzinach a maksimum po 48 godzinach (IgM oraz α-2-makroglobulina osiągają swój pI z maksimum rozdziałowym w 48 h)

Oznaczanie pośredniej ilości utworzonych kompleksów z zastosowaniem znaczników

Ogólną zasadą metod immunologicznych z zastosowaniem znaczników jest „wyznakowanie” jednego ze składników reakcji antygen-przeciwciało. Biorąc pod uwagę znacznik, metody dzielimy na:

1. fluorymetryczne (FIA), gdzie znacznikami są fluorochromy, czyli barwniki fluoryzujące w świetle o krótkiej długości fali

2. radioimmunologiczne (RIA), gdzie znacznikami są pierwiastki promieniotwórcze

3. immunoenzymatyczne (EIA), gdzie znacznikami są enzymy

4. chemiluminescencyjne , gdzie znacznikami są substancje organiczne.

Metody te charakteryzują się bardzo wysoką czułością.

	Znacznik	B/F separacja	Detekcja sygnału	Czułość analityczna
zmętnieniowa	brak	nie	turbidymetria, nefelometria	10 μg/ml
RIA	I^125, H^3	+	promieniowanie γ	5 ng/ml
EIA	enzymy	+	spektrofotometria, fluorymetria	1 pg/ml
FIA	fluorofory	+	pomiar światła	5 pg/ml
CMIA	chemiluminofory	+	pomiar światła	5 pg/ml

Biorąc pod uwagę rodzaj użytego znacznika metody te dzielimy na:

• metody fluorometryczne (FIA), znacznikami są fluochochromy czy barwniki fluoryzujące w świetle o krótkiej długości fali

• radioimmunologiczne- o krótkiej długości fali pierwiastki promieniotwórcze

• enzymatycznej- o krótkiej długości fali enzymy

• luminogeniczne- znacznikami są określone substancje organiczne

Wysoka czułość!!!

FIA

• w metodzie fluorymetrycznej znacznikami są fluorochromy: izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) emitujący światło zielone lub izotiocyjanian rodaminy B (RITC) emitujący światło czerwone

• najczęściej znakuje się przeciwciała, rzadziej antygeny

• znakowanie przeciwciał fluorochromem prowadzi się w środowisku zasadowym w temperaturze 4^oC

• wyznakowane przeciwciała należy następnie scharakteryzować, tzn. określić ich stężenie i optymalne dla danej reakcji rozcieńczenie

• emisja fluorescencji jest wzbudzana wiązką światła o małej długości fali przy zastosowaniu filtrów przepuszczających promieniowanie indukujące fluorescencję i filtrów usuwających promieniowanie niepożądane

• reakcja może być prowadzona zarówno w środowisku płynnym (tzw. metody homogenne), jak i w środowisku stałym (tzw. metody heterogenne)

• w metodzie homogennej:

• badany materiał inkubuje się z przeciwciałami wyznakowanymi fluorochroimnem

• następnie mierzy się za pomocą fluorymetru stopień wygaszania fluorescencji w stosunku do fluorescencji wyjściowej

• im wyższe stężenie poszukiwanego antygenu, tym większe wygaszanie fluorescencji

• 
  w metodzie heterogennej:

• jeden ze składników reakcji jest związany z fazą stałą (powierzchnią płytki polistyrenowej, probówki polistyrenowej, czy kulki poliakrylamidowej)

• po reakcji odpłukuje się supernatant i mierzy fluorescencję kompleksu antygen-przeciwciało związanego z fazą stałą

• metoda ta charakteryzuje się wyższą czułością niż metoda homogenna

• metody heterogenne można prowadzić w różnych odmianach, dlatego dzielimy je na metody kompetycyjne i niekompetycyjne.

RIA

• polegają na wykrywaniu reakcji antygen-przeciwciało poprzez pomiar promieniowania izotopów promieniotwórczych związanych z jedną ze składowych reakcji

• możliwa jest ocena reakcji poprzez:

• pomiar radioaktywności powstałego kompleksu lub

• pomiar radioaktywności supernatantu pozostałego po oddzieleniu utworzonego kompleksu

• najczęściej znakuje się przeciwciała stosując I¹²⁵

• metody RIA można prowadzić w dwóch wariantach

• oba składniki w fazie płynnej

• jeden ze składników jest związany z fazą stałą (ścianą probówki lub mikropłytki)

• techniki te wykorzystuje się powszechnie do oznaczania stężeń:

• prawie wszystkich hormonów

• białek towarzyszących nowotworom (CEA, AFP)

• swoistych przeciwciał klasy IgE

• witamin i leków

• wykrywania obecności autoprzeciwciał.

EIA

• znacznikiem jednego z reagentów jest enzym

• oznaczany jest barwny produkt reakcji przeprowadzonej przez ten enzym

• techniki EIA charakteryzują się wysoką czułością

• produkt reakcji ulega amplifikacji, bowiem 1 cząsteczka enzymu może katalizować powstanie wielu cząsteczek produktów

• metody te stosowane są również dużo częściej niż RIA z racji szkodliwości pierwiastków promieniotwórczych

• enzymy stosowane w metodzie EIA muszą spełniać pewne warunki:

• muszą być rozpuszczalne

• stabilne

• łatwo łączyć się z białkiem

• wiązanie to powinno być trwałe

• substraty dla tych enzymów muszą być łatwo dostępne a produkt reakcji enzymatycznej - barwny

EMIT	EIA	ELISA
Metody homogenne	Serologia chorób zakaźnych	Metody heterogenne
Immunichemia: hormony markery nowotworowe alergologia wskaźniki dezintegracji komórek serca β2-mikroglobulina pap Fe	Wykrywanie Ab toksoplazma IgG,M różyczka IgG,M świnka IgG odra IgG ospa wietrzna i półpasiec IgG cytomegalia IgG,M borelioza ( IgG,M w sur) AIDS WZW H.pylori Wykrywanie Ag	Hemostaza: produkty rozpadu fibryny i fibrynogenu (FDP, DD2) TML digoksyna teofilina antybiotyki cytostatyki

Enzymy wykorzystywane w metodzie EIA
Enzym	Źródło	Substrat
peroksydaza (OPD)	korzeń chrzanu	O-fenylodwuamina + H2O2
fosfataza alkaliczna (PAL)	jelita zwierzęce	P-nitrofenol
β-D-galaktozydaza	Escherichia coli	P-nitrofenylogalaktozyd
oksydaza glukozowa	Aspergillus	O-dwuanizydyna
dehydrogenaza jabłczanowa	mitochondria serc świni	kwas jabłkowy
β-amylaza	ziemniaki	skrobia

Sposoby przyłączania znaczników enzymatycznych do komponent immunologicznych

1. Kowalencyjne wiązanie za pomocą aldehydu glut arowego (typ zasady Schiffa)

2. Wiązanie immunologiczne

3. Swoiste połączenie awidyny i biotyny

Metody luminogeniczne

Luminescencja - zjawisko promieniowania elektromagnetycznego z zakresu światła widzialnego w wyniku przejścia promienistego między dwoma stanami energetycznymi atomu lub cząsteczki.

W zależności od natury stanów kwantowych, między którymi zachodzi przejście promieniste, rozróżnia się dwa typy fluorescencji:

1. fluorescencja - zjawisko trwające wyłącznie podczas działania czynnika wzbudzającego

2. fosforescencja - zjawisko trwające również przez jakiś czas po ustąpieniu działania czynnika wzbudzającego

W zależności od sposobu wzbudzania świecenia rozróżniamy:

• chemiluminescencja - wytworzona w zakresie niektórych reakcji chemicznych

• elektrochemiluminescencja - świecenie pod wpływem stałego lub zmiennego pola elektrycznego

Substancje zdolne do luminescencji nazywane są luminoforami - związkami które emitują światło o λ=400-700 nm wzbudzone w wyniku reakcji chemicznej mierzone w czasie (Δt)

• luminal

• izoluminol związki które emitują świtało λ=400-700nm wzbudzone w wyniku

• estry akrydyny reakcji chemicznej mierzonej w czasie

• lucyferyna.

• Zaleca się podawanie na wyniku nazwy producena odczynników

• laboratorium jest zobowiązane do poinformowania o zmianie metody oznaczeń klinicystów oraz podania ewentualnego wpływu na wyniki

Elektrochemiluminescencja

• reakcja zachodzi na elektrodzie platynowej w obecności tripropylaminy

• tripropylamina po inicjacji impulsem elektrycznym przyłącza się do kompleksu znakującego dając luminescencję

• pomiaru dokonuje się w luminoforach (10^-29g)

---