25.02.2012

Wykład 13

Detektory stosowane w elektroforezie kapilarnej

1. Detektor UV-VIS

• najczęściej stosowany do wykrywania substancji organicznych, wykrywanie substancji polega na spektrofotometrycznym pomiarze absorpcji światła przy charakterystycznej dla analizowanej substancji długości fali

• absorpcja pośrednia - modyfikacja w celu uwidocznienia substancji nieorganicznych (nie absorbujących światła); do buforu wypełniającego kapilarę dodaje się jony chromianowe silnie absorbujące światło UV, grupujące się w strefy rozdzielone jony wypierają z roztworu jony chromianowe, powodując spadek absorbancji światła i powstawanie ujemnych maskimów absorpcji

Matryce diodowe

• aktywacja światła pozwala na pomiar absorpcji równocześnie przy kilku długościach fal; umożliwiają więc analizę widma UV-VIS rozdzielanych substancji

• Detektory fluorescencyjne (najczulsza technika detekcji)

• mierzą fluorescencję rozdzielanych substancji wzbudzaną przez źródło światła UV emitowanego przez laser

• Laserowa absorpcja termooptyczna

• kiedy przed okienkiem detektora wysyłającego wiązkę światła laserowego przechodzi substancja absorbująca światło lasera, bufor ulega ogrzaniu

• zmiana temperatury buforu wiąże się ze zmianą współczynnika załamania światła a wykrywanie przez dodatkowy układ optyczny zmian refrakcji pozwala na identyfikację rozdzielanych substancji

• Detektory elektrochemiczne

• Spektroskop masowy

• użycie w jednym systemie pomiarowym diodowego detektora matrycowego rejestrującego widmo substancji ze spektrografem masowym pozwala na szybkie identyfikowanie nieznanych substancji (zastosowane w oznaczeniach toksykologicznych i farmaceutycznych)

Ogniskowanie izoelektryczne

Na podłożu między anodą a katodą przez dodanie mieszaniny niskocząsteczkowej amfolitów zostaje utworzony gradient pH (kwaśny koniec przy anodzie, alkaliczny przy katodzie).

Różnorodne białka wędrują w polu elektrycznym do wartości równej ich pI, gdzie nie wykazują już żadnego ładunku elektrycznego i pozostają w spoczynku. Do barwienia stosuje się błękit Coomassie.

Immunofiksacja białek surowicy

Połączenie rozdziału elektroforetycznego z immunologiczną reakcją wykrywającą za pomocą swoistych przeciwciał.

• żel agarozowy

• bufor weronalowy pH 8,6

• 5 μl surowicy krwi

• 120 V, 20 minut

• utrwalanie za pomocą przeciwciał barwienie kwaśnym fioletem

• odbarwianie kwasem cytrynowym

Metody immunochemiczne

Obecnie to podstawowa technika analityczna stosowana do oceny ilościowej:

• białek, peptydów, markerów uszkodzenia tkanek, hormonów niebiałkowych (tarczycy, sterydowych)

• leków, witamin, oligonukleotydów.

Rozwój tych metod zmierza w kierunku:

1. Polepszenia analitycznej swoistości i czułości

2. Pełnej automatyzacji

3. Wykonania dużej ilości oznaczeń w krótkim czasie

Istota metody immunochemicznej

Reakcja podlegająca na wiązaniu jednej lub kilku konformacji cząsteczki antygenu (epitopu, determinanty) przez odpowiednie miejsce wiązania na cząsteczce przeciwciał (paratop, antydeterminant).

Antygeny

• własności antygenowe - zdolność wiązania z przeciwciałami

• wiele determinant antygenowych jest sekwencyjnie (min. 3-6) reszta przestrzenne - zespół 12-15 reszt aminokwasowych, które nie są obok siebie w sekwencji łańcucha polipeptydowego - pofałdowanie łańcuchów polipeptydowych

• własności immunogenne samodzielnie lub jako hapten w połączeniu z białkiem nośnikowym

• 
  reakcja zgodnie z prawem działania mas

• nadmiar jednego z substratów przesuwa równowagę w kierunku produktu

• konieczność użycia znaczników dla antygenu lub przeciwciała (odczynnika)

Typy przeciwciał

• poliklonalne (heterogenna mieszanina przeciwciał różnorodna powinowactwem wiązania, mających różną swoistość)

• otrzymane na drodze immunizacji zwierząt

• wysoko oczyszczonymi antygenami pochodzących z ludzkich nowotworów (przeciwciała dla klonów limfocytów B)

• rozpoznają one epitopy zarówna na immunogenie, jak i na różnych zanieczyszczeniach i białkach nośnikowych, które były podawane zwierzęciu równocześnie z immunogenem

• ponadto zawierają pewnego rodzaju „tło” przeciwciał, które były obecne we krwi zwierzęcia przed rozpoczęciem immunizacji

• każda kolejna immunizacja zwierzęcia wiąże się ze zmianami w powinowactwie przeciwciał do antygenów

• monoklonalne

• produkowanie in vitro

• fuzja uczulonych (komórek z linii hodowlanej nowotworowej) limfoblastów z komórkami szpiczaka mysiego

• uzyskanie nieśmiertelności i zdolności produkcji przeciwciał monoklonalnych.

Obecnie produkowane są zestawy odczynników zawierających mieszaniny przeciwciał mono lub przeciwciał rekombinowanych.


Cechy przeciwciał

1. Zdolność swoistego wiązania praktycznie nieograniczonej liczby naturalnych i syntetycznych związków chemicznych, komórek i wirusów. Wzajemna interakcja między aminokwasami, z których zbudowany jest antygen, daje możliwość pofałdowania peptydów i białek, a przez to tworzone są nowe antygeny.

2. Wyższa swoistość w stosunku do substancji wiązanej, pozwala na oznaczanie w rutynowych warunkach stężeń rzędu 10^-12 mol/l (10^-21 mol/l)

3. Wyższa energia niekowalencyjnego wiązania pomiędzy przeciwciałami a antygenami, która pozwala na przeprowadzenie procesu analitycznego.

Rozdział metodą immunochemiczną

Nomenklatura i podział metod immunochemicznych są niejednokrotnie mylące, bowiem tyle samo jest podobieństw co i różnic pomiędzy istotnymi grupami metod.

Podział Goslinga

1. Metody służące do oznaczeń antygenów lub haptenów, w których jako jeden z reagentów stosuje się znakowany anten, są to metody z ograniczonym stężeniem immunoglobulin czyli kompetencyjne np. RIA

2. Metody ze znakowanymi przeciwciałami i z ograniczoną ilością odczynnika (kompetycyjne) np. chemiluminescencja

3. Metody służące do bezpośredniego pomiaru ilości kompleksu immunologicznego, np. strąceniowej, nefelometria, turbidymetria

4. Metody w których wszystkie odczynniki są w nadmiarze, z jednym reagentem znakowanym np. sandwich assay

5. Jakościowe metody do oznaczania swoistych przeciwciał przy użyciu rozcieńczonej surowicy testowej dodanej do nadmiaru antygenu unieruchomionego w fazie stałej

6. Metody w których zmianę aktywności znacznika obserwuje się po związaniu przeciwciała z antygenem (metody homogenne)

Inny podział

1. W zależności od użytych etapów i faz: homogenne, heterogenne

2. Który składnik reakcji jest znakowany: antygen czy przeciwciało

3. Stężenie przeciwciał stosowanych w danej metodzie

1. „nadmiar” przeciwciał → ∞

2. „niedobór” przeciwciał → 0

4. Sposób w jaki monitorujemy powstawanie kompleksu antygen-przeciwciało

Metody niekompetycyjne - pomiaru dokonuje się w oparciu o zajęte przez antygen miejsca wiążące na przeciwciałach.

Metody kompetycyjne - pomiaru dokonuje się w oparciu o niezajęte przez antygen miejsca wiążące na przeciwciałach.

Metody immunochemiczne z znakowanym przeciwciałem jednoetapowe (homogenne)

Mogą być przeprowadzone w formacie kompetycyjnym lub niekompetycyjnym, w zależności czy mierzymy sygnał związany z miejscami wolnymi czy zajętymi, zaś utworzenie kompleksu antygen-przeciwciało warunkuje uzyskanie lub utratę aktywności znacznika np. enzymy - turbidymetria, nefelometria, EMIT, CEDIA, FPIA, TRACE.

Metody kompetencyjne z ograniczoną ilością odczynnika


przeciwciała →0 w celu uzyskania maksymalnej czułości

W miarę wzrostu stężenia antygenu poszukiwanego, zmniejsza się liczba miejsc niezajętych na cząsteczkach przeciwciał, a tym samym osłabia się wielkość sygnału, bowiem coraz mniejsza liczba miejsc wiążących pozostaje dla antygenu znakowanego.


Metody niekompetycyjne z nieograniczoną ilością odczynnika (kanapka)

Metody te opierają się o zastosowanie dwóch przeciwciał skierowanych przeciw różnym epitopom na antygenie.

1. Przeciwciała wychwytujące, nieoznakowane, na fazie stałej

2. Przeciwciała znakowane

[Ag szukany] = przyłączonych przeciwciał znakowanych = siła natężenia sygnału pomiarowego

Metody immunochemicznie

1. Ocena bezpośrednia ilości kompleksów

• reakcja antygen - przeciwciało w fazie płynnej (immunoturbidymetria, immunonefelometria)

• reakcja antygen - przeciwciało w fazie stałej (immunoelektroforeza, immunodyfuzja radialna, elektroimmunodyfuzja)

• Oznaczanie pośrednie ilości utworzonych kompleksów z zastosowaniem znaczników

• metody radioimmunologiczne (RIA)

• metody immunoenzymatyczne (EIA)

• metody immunofluorymetryczne (FIA)

• metody chemiluminescencyjne (CLA)

• metody elektrochemiluminescencyjne (ECLIA)

---