Metody oznaczania białek:

Metody ilościowego oznaczania białek:

• Metoda Kjeldahla- oznaczanie azotu białkowego

• Metoda pomiaru absorbancji w UV

• Metoda biuretowa

• Metoda mikrobiuretowa

• Metoda Lowrey`ego

• Metoda Bradforda

• Metoda z kwasem bis-cynchoninowym (BCA)

Metoda Kjeldahla- oznaczanie azotu:

Zasada:

Zawartość azotu w różnych białkach jest względnie stała i wynosi ok. 16%.

Znając odsetek azotu w badanej próbie, można obliczyć, ile zawiera

białka.

Etapy:

1. Przeprowadzenie azotu grup aminowych białek w jony amonowe przez mineralizację w stężonym kwasie siarkowym.

2. Oddestylowanie uzyskanego z grup amonowych amoniaku

3. Oznaczenie amoniaku. Istnieją różne metody oznaczania: np. metodą miareczkowania, metodą kolorymetryczną z odczynnikiem Nesslera (K2HGI4)

Metoda kolorymetryczna z odczynnikiem Nesslera

Reakcja z amoniakiem zachodzi wg równania:

Żółtozielony roztwór jodku rtęciowo-potasowego przechodzi w czerwony jodek amidooksyrtęciowy. Pomiar absorbancji 490-510 nm

Zalety: duża specyficzność da wszystkich białek

Wady: duża pracochłonność

Metoda pomiaru absorbancji w UV

Zasada:

Białka, dzięki obecności w swoim składzie aminokwasów aromatycznych (tyrozyna, tryptofan) wykazują zdolność absorpcji światła o długości fali 280 nm

Zalety:

• Proste i szybkie oznaczenie

• Oszczędność materiału

Wady:

• Mała specyficzność

• Metoda nadaje się do oznaczania stężenia oczyszczonego białka (na podstawie znanego wsp. absorpcji)

• Obecność kwasów nukleinowych w badanym materiale przeszkadza w oznaczeniu (max absorbcji 260 nm)

Metoda biuretowa

• Oznaczanie natężenia barwy powstałej w wyniku utworzenia związków kompleksowych białek z jonami miedzi (II) w środowisku zasadowym

• Intensywność barwy w reakcji biuretowej jest proporcjonalna do liczby wiązao peptydowych

Zalety:

• Wysoka specyficzność dla wszystkich białek – absorbancja nie zależy od rodzaju oznaczanego białka tylko od jego stężenia w próbie

• Prostota wykonania

Wady:

• Niska czułość ((a=0,4 (g/l)-1xcm-1))

Metoda mikrobiuretowa

Modyfikacja metody biuretowej

• Mechanizm podobny, ale zastosowana długość fali 310 nm zwiększa ok 10 x jej czułość

• Każdą próbę wykonuje się w dwóch szeregach: biały (B) i

niebieski (N)

• Szereg biały zawiera roztwór białka + 30% NaOH, szereg niebieski roztwór białka + CuSO4 w 30% NaOH

• Właściwą absorbancję do obliczeń otrzymuje się z różnicy N-B.

Zalety: wysoka specyficzność w stosunku do wszystkich białek

Wady: duże zużycie roztworu białka (dwa szeregi)

Metoda Lowry’ego

ZASADA:

W metodzie tej wykorzystuje się 2 odrębne reakcje:

Reakcję aminokwasów z odczynnikiem Folina:

Tyrozyna,tryptofan,cysteina oraz przypuszczalnie histydyna występujące w bialkach redukują jony Mo6+/W6+ zawarte w odczynniku Folina-Ciocalteau do niższych tlenków.

Reakcję biuretową:

Jony miedzi(II) tworzą kompleksowe połaczenia z wiązaniami peptydowymi,uczestniczą

również w redukcji odczynnika Folina,przez co zwiększa się czułość reakcji.

Końcowa barwa jest wynikiem tych dwóch reakcji

Metoda Lowry i wsp.

Zalety:

• bardzo wysoka czułość reakcji (ok. 70 x wyższa niż w metodzie biuretowej)

• względna prostota wykonania

Wady:

• wrażliwość na obecne w próbach substancje interferujące

– fenole, zasady purynowe i pirymidynowe, odczynniki

sulfhydrylowe oraz detergenty (zwiększają natężenie barwy)

– inne związki jak ZnSO4, siarczan amonu w stężeniach powyżej

0,1%, 1% etanol i eter obniżają intensywność barwy

• mała specyficzność wobec różnych białek

Metoda Bradforda

W metodzie wykorzystuje się zdolność wiązania barwnika błękitu brylantowego - Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB G250) z grupami aminowymi białek

• Wiązanie ma charakter oddziaływań elektrostatycznych

• CBB G-250 w środowisku kwaśnym ma brunatne zabarwienie, które po reakcji z białkami zmienia się na błękitne

• Wiąże się z tym zmiana maksimum absorpcji z 465 nm na 595 nm

• Natężenie barwy jest proporcjonalne do zawartości białka w roztworze

Zalety:

• prostota i szybkośd oznaczenia

• duża czułośd porównywalna z metodą Lowry

• oznaczenia można wykonywad w obecności powszechnie stosowanych buforów, EDTA, związków

tiolowych, sacharozy, glicerolu

Wady:

• mała specyficznośd wobec różnych białek

• detergenty (SDS ,Triton X-100) dają dodatkowy interferujący kolor

Metoda z kwasem bis-cynchoninowym (BCA)

• W alkalicznym środowisku niektóre składniki białek (tyrozyna, tryptofan, cysteina, cystyna) redukują jony Cu2+ do Cu1+

• Cu1+ tworzą barwny kompleksowy związek z kwasem biscynchoninowym

(BCA)

Zalety:

• wysoka czułośd reakcji (porównywalna z metodą Lowry)

• mniejsza zmiennośd dla różnych białek w porównaniu z metodą Lowry

• względna prostota wykonania

Wady:

• metoda stosuje się do prawa L-B w wąskim zakresie stężeo (do 100 ug białka w próbie)

• silna interferencję powodują

– cukry redukujące

– związki redukujące (merkaptoetanol, ditiotreitol)

– związki chelatujące jony miedzi

Wpółczynnik absorpcji:

A = k x l x c

k – współczynnik absorpcji - ma charakterystyczną stałą wartość dla każdej substancji przy danej dł. fali

Miano i wartość liczbowa k zależą od jednostek stężenia:

• molowy współczynnik absorpcji (mol/l) (liczbowo = absorbancja 1M r-ru)

• właściwy współczynnik absorpcji (g/l) (liczbowo a = absorbancja r-ru o stężeniu 1g/l)

• Współczynnik absorpcji A1% (g/100 ml)

• Absorpcja właściwa Awł (1 g/ml)

Czułośd metody - najmniejsza ilośd substancji (białka), którą można oznaczyd w roztworze kolorymetrowanym

Porównanie czułości metod oznaczania białka właściwy współczynnik absorpcji jest dogodnym wskaźnikiem porównywania czułości metod. Wyraża absorbancję roztworu

kolorymetrowanego o stężeniu 1 g/l (1 mg/ml)

Im > jest wartość (a), czyli im > intensywność zabarwienia w danej metodzie

wykazuje roztwór białka o stężeniu 1 mg/ml kolorymetrowanego, tym bardziej

czuła jest metoda