Transgenic watermelon

rootstock resistant to

CGMMV (cucumber

green mottle mosaic

virus) infection

Received: 28 August 2004 / Revised: 22 February 2005 / Accepted: 23 February 2005 / Published

online: 14 June 2005

C _Springer-Verlag 2005

Sang Mi Park · Jung Suk Lee · Sung Jegal ·
Bo Young Jeon · Min Jung · Yoon Sik Park ·
Sang Lyul Han · Yoon Sup Shin · Nam Han Her ·
Jang Ha Lee · Mi Yeon Lee · Ki Hyun Ryu ·
Seung Gyun Yang · Chee Hark Harn

• Uprawa arbuza wymaga niezbędnego

zabiegu zwanego szczepieniem. Jest to
metoda uszlachetniania drzew owocowych,
roślin ozdobnych czy warzyw. Na podkładkę
odmiany nieszlachetnej szczepi się zraz
rośliny szlachetnej. Celem tej metody
wprowadzenie do odmiany szlachetnej lepiej
rozbudowanego, bardziej żywotnego i
wolnego od patogenów systemu
korzeniowego pochodącego z podkładki
odmiany nieszlachetnej.

• Na rynku występuje wiele cennych

odmian arbuza, których korzenie są mniej

żywotne i bardziej podatne na infekcje

wirusowe np. wirusa zielonej mozaiki

ogórka (CGMMV) i dlatego w celu

zmniejszenia strat wydajności uprawy

arbuza stosuję się podkładkę z arbuza

zwyczajnego (Citrullus lanatus), a

metodami inżynierii genetycznej

uzyskano podkładkę odporną na infekcję

CGMMV.

• Używając cDNA do podkładki arbuza

wprowadzono gen białka opłaszczającego
CGMMV (CGMMV-CP). Jest to białko strukturalne
budujące kapsyd wirusa. Pojawienie się tego
białka powoduje to, iż późniejsza infekcja tym
wirusem jest znacznie słabsza lub skutki choroby
pojawiają się z dużym opóźnieniem.

Metoda transformacji

rośliny i materiał roślinny

wybrany do transformacji

•

Do transformacji podkładki arbuza

zastosowano dwie metody: pierwsza z metod

to kokultura zregenerowanych w stronę

pędów liścieni w Agrobacterium tumefaciens.

Druga z metod również opierała się na

kokulturze zregenerowanych w stronę pędów

liścieni w Agrobacterium tumefaciens,

natomiast eksplantaty zostały dodatkowo

zranione prądem w celu ułatwienia

przeniknięcia wektora do komórki roślinej.

Transformacja Agrobacterium

tumefaciens

• Szczep LBA4404 został transformowany

używając wektora zawierającego gen CGMMV-
CP pod kontrolą promotora 35S, oraz gen
selekcyjny NPTII oporności na kanamycynę a
następnie przeniesiony do płynnej pożywki
YEP. Gdy stransformowane Agrobacterium
urosło do fazy logarytmicznej, zostało
zwirowane przez 10minut przy
3500obrotów/min. Uzyskany osad bakterii
został zawieszony w pożywce MS zawierającej
BAP w stężeniu 1mg/l.

Materiał roślinny wybrany do

transformacji

• Materiałem wykorzystanym do badania

były nasiona podkładki arbuza, które

zostały wysterylizowane przez 30sekund w

70% etanolu oraz w wybielaczuYuhanrox

25% przez 30minut. Tak wysterylizowane

nasiona zostały przeniesione do pożywki ½

MS. Następnie hodowano je w ciemności w

25°C aż do wykiełkowania. 3-dniowe

liścienie z uzyskanych siewek zostały

podzielone na 9 segmentów i użyte jako

eksplantaty do regeneracji i transformacji.

Transformacja segmentów

liścieni

• Eksplantaty zostały zanurzone w kulturze

stransformowanych bakterii na 30minut.

Następnie kokulturę umieszczono na 3dni

do pożywki MS uzupełnionej o 1mg/l BAP,

0,1mg/l IAA, acetosyringon który narusza

strukturę ściany komórkowej.

• Druga metoda była przeprowadzona

identycznie jak pierwsza, z dodatkowym

działaniem impulsów elektrycznych w celu

zranienia tkanki i ułatwienia przenikania

wektora do komórek roślinnych.

REGENERACJA + SELEKCJA

Organogeneza bezpośrednia

1. Organogeneza w stronę pędów.

Pożywka- zmodyfikowana MS( MS-B5 + 3%

sacharozy + 0,8% agaru, pH 5,8)

Hormony- 1.0 mg/l BAP + 0.1 mg/l IAA
Antybiotyki- 40 mg/l kanamycyna/ 7,5 mg/l

hygromycyna, 200 mg/l ,,lilacilline”, 500 mg/l
cefotaksym

Czas trwania- 4-5 tygodni

2. Organogeneza w stronę korzeni

Pożywka- zmodyfikowana MS( MS-B5 + 3%

sacharozy + 0,8% agaru, pH 5,8)

Hormony- brak
Antybiotyki- 20 mg/l kanamycyna, 200 mg/l

,,lilacilline”,

Czas trwania- 5-6 tygodni

Opis fenotypu

• Rośliny stransformowane nie odbiegają

fenotypowo od zdrowych
niestransformowanych roślin, nie ma różnicy
w procesach rozwojowych. Transformanty
hodowane na pożywce selekcyjnej z
kanamycyną lub hygromycyną oraz rośliny
niestransformowane owocowały i dawały
nasiona bez zauważalnych różnic.

Również

użyte dwa różne szczepy A. tumefaciens
(LBA4404 i EHA105) nie miały wpływu na
fenotyp transformantów.

Sprawdzenie integracji i

ekspresji wprowadzonego

genu

• Obecność transgenu w roślinie

stransformowanej została
sprawdzona następującymi
metodami: analiza PCR, oraz
Southern blot. Ekspresję transgenu
na poziomie mRNA zbadano metodą
Northern blot, natomiast na poziomie
białka metodą Western blot.

PCR

DNA wyizolowane z transformowanych podkładek

arbuza poddano łańcuchowej reakcji

polimeryzacji. Do PCR zostały użyte startery o

następujących sekwencjach:

5_- TCCGATCACACCTAGCAAAC-3_ oraz 5_-

GACCAGACTACCGAAAACG-3_. Składnikami do

PCR były: 0,65µM każdego ze starterów, 299 µM

dNTP, 1U/ µM polimerazy Taq w 50mM KCl,

1,5mM MgCl2 oraz 10mM Tris-HCl pH 8,3. Reakcja

została przeprowadzona w 35 cyklach,

temperaturach: 94°C, 55°C, 72°C, odpowiednio

do etapów reakcji (denaturacja DNA, przyłączenie

starterów, wydłużanie nici)

Southern blot

• DNA wyizolowane z

transformowanych podkładek arbuza
trawiono enzymem XbaI i
frakcjonowano na 0,8% żelu
agarozowym.

Northern blot

• Pozytywne(posiadające transkrypt)

produkty z PCR poddano analizie

Badanie oporności roślin T1 na

CGMMV

• W celu zbadania oporności transgenicznego arbuza na

infekcję CGMMV doprowadzono do samozapylenia rośliny
T0 106 i uzyskano 140 roślin T1. Czterotygodniowe siewki
poddano dwukrotnej inokulacji wirusem CGMMV z
dwutygodniowym odstępem

Wnioski

-Arbuz jest jedną z najtrudniejszych roślin do transformacji za

pomocą Agrobacterium.
- Do transformacji użyto dwóch metod: zwykła kokultura(z

kanamycyną jako antybiotyk selekcyjny) i metoda kokultury ze

zranioną prądem tkanką. (z hygromycyną jako antybiotyk

selekcyjny). Wydajność transformacji wynosiła odpowiednio 0,1%

oraz 0,3%. Okazało się, że obie metody transformacji

charakteryzuje się bardzo niską wydajnością. Wydajność jest

większa w przypadku drugiej metody, co może być powodem

dodatkowego ranienia impulsem elektrycznym eksplantatów,

dzięki czemu więcej bakteryjnego DNA mogło być

przetransportowanych do komorek. Aklimatyzacja również okazała

się niełatwym zadaniem, wiele stransformowanych roślin nie

przetrwało tego procesu. Ponadto niższą wydajność aklimatyzacji

obserwujemy w przypadku roślin potraktowanych prądem, który

mógł uszkodzić bądź naruszyć strukturę komórek eksplantatu.

-

Badania wykazały że nie ma korelacji pomiędzy

opornością a obecnością transktryptu i białka.
Autorzy puplikacji proponują trzy możliwe
mechanizmy które tłumaczą powyższe
zjawisko. Po pierwsze, gen który został
wklejony i podlega transkrypcji zostaje
potranskrypcyjnie wyciszony. Po drugie białko
CP które zapobiega replikacji RNA wirusa, nie
podlega ekspresji w pokoleniu T1. Po trzecie,
na poziom oporności może mieć wpływ
zmienność somaklonalna.

Dziękujemy za uwagę!

• Sandra Kupczyk
• Roman Majewski