A M I N O K W A S Y

Aminokwasy są podstawową jednostką strukturalną : peptydów (

do 100 aa

) i białek (

>100 aa

Budowa aminokwasów:
- Centralnie ułożony jest C α
- Kowalencyjnie związane są z węglem α grupa

COOH

, grupa

, atom

oraz charakte-

rystyczna dla aminokwasów grupa

stanowiąca łańcuch boczny aminokwasów.

- Tetraedrycznie ułożone 4 różne podstawniki wokół węgla α nadają aminokwasom charakter
związków optycznie czynnych. C α jest węglem chiralnym - daje izomery optyczne L i D.

Białka zbudowane są wyłącznie z L aminokwasów !!
Wyjątek - GLICYNA - bo nie posiada węgla chiralnego
Wyjątek - TREONINA i IZOLEUCYNA - 2 węgle asymetryczne , 2 centra chiralne
C α jest asymetryczny co powoduje, że aminokwasy są optycznie czynne a więc skręcają
płaszczyznę światła spolaryzowanego.

Jest 20 podstawowych aminokwasów budujących białka. Różnią się one między sobą :
- wielkością cząsteczki
- kształtem
- ładunkiem elektrycznym
- zdolnością do tworzenia wiązań wodorowych
- reaktywnością chemiczną

Podział aminokwasów

. W zależności od budowy łańcucha bocznego aminokwasu :

- aa z alifatycznym łańcuchem bocznym :

Gly , Ala , Val , Leu , Ile

- aa z łańcuchem bocznym zawierającym grupę hydroksylową :

Ser , Thr , Tyr

- aa z łańcuchem bocznym zawierającym atom siarki :

Cys , Met

- aa z łańcuchem bocznym zawierającym grupy kwaśne lub ich amidy :

Asp , Asn , Gln , Glu

- aa z łańcuchem bocznym zawierającym grupy zasadowe :

Arg , Lys , His

- aa z łańcuchem bocznym zawierającym pierścień aromatyczny :

His , Tyr , Phe , Trp

iminokwas :

Pro

W zależności od właściwości łańcucha bocznego :

- łańcuch boczny niepolarny ( hydrofobowy ):

Ala , Val , Leu , Pro , Ile , Met , Trp , Phe

- łańcuch boczny polarny , aa obojętne :

Gly , Ser , Gln , Asn , Thr , Tyr , Cys

- łańcuch boczny polarny , aa kwaśne ( w pH=7 łańcuch boczny ma ładunek ujemny ) :

aa monoaminodikarboksylowe : Asp , Glu

- łańcuch boczny polarny , aa zasadowe ( w pH=7 łańcuch boczny ma ładunek dodatni ) :

aa diaminomonokarboksylowe : His , Lys , Arg

Podział pod względem polarności :

- aa niepolarne ( hydrofobowe - awersja do wody , skłonność do grupowania się -

bardzo

ważna cecha slużąca stabilizacji struktury bialka zbudowanego z aa o przeważającym
hydrofobowym charakterze

) :

Ala , Val , Leu , Ile , Met , Phe , Trp , Pro

- aa polarne :

Gly , Asp , Asn , Glu , Gln , Arg , Lys , His , Cys , Ser , Thr , Tyr

Podział pod względem pochodzenia :

- aa egzogenne ( aa NIEZBĘDNE - dostarczane tylko z pokarmem, organizm nie potrafi ich

syntetyzować) :

Arg , His - tylko u dzieci !!

Val , Leu , Ile , Lys , Thr , Met , Phe , Trp

- aa endogenne ( aa NIENIEZBĘDNE - syntetyzowane przez organizm):

Ala , Gly , Asp , Asn ,

Glu , Gln , Cys , Pro , Ser , Tyr oraz hydroksyprolina i hydroksylizyna

Cystyna

A) pojawiają się rzadko w białkach :

5 - hydroksylizyna , 4 - hydroksyprolina

kolagen

- tyroksyna ( jodowana tyrozyna )

tyreoglobulina ( białko produkowane przez tarczycę)

- trijodotyronina - hormon tarczycy
- N - metyloarginina , N - acetylolizyna

białka histonowe w chromosomach

- fosfoseryna , fosfotreonina , fosfotyrozyna ( ufosforylowana gr. -OH )

w białkach

komórek regulatorowych i komórek wzrostu.

B) występują w postaci wolnej w tkankach zwierząt i roślin :

glicyna

inaktywuje

toksyny , łączy się z kwasami żółciowymi i jest wydalana do żółci , substrat do syntezy
puryn i hemu.
Cystyna i cysteina

biorą udział w reakcjach utleniania i redukcji

Kwas glutaminowy i asparaginowy

biorą udział w reakcjach transaminacji

( aminotransferaza alaninowa i aminotransferaza glutaminowa)

C) często są produktami pośrednimi przemiany materii . Ważne intermediaty cykli
komórkowych :

- ornityna , cytrulina z Arg ( cykl mocznikowy )

- homocysteina - odmetylowana Met
- homoseryna - z Ser
- β - alanina - z Asp, katabolizmu cytozyny i uracylu
- tauryna - z cysteiny

W tym miejscu należy także wspomnieć o bardzo ważnej grupie związków powstających z aa
po ich dekarboksylacji i pełniącą znaczącą rolę w organizmie człowieka :

Aminy biogenne :

Tyr

tyramina - hormon tkankowy , powoduje kurczenie się macicy

Tyr

DOPA

Trp

tryptamina - hormon tkankowy

His

histamina - hormon tkankowy - obniża ciśnienie krwi , powoduje wzrost wydzielania

m in soku żołądkowego. Jest mediatorem procesu zapalnego. Powoduje skurcz mięśni
gładkich , rozszerza naczynia włosowate.
Thr

propanoloamina - składnik Vit. B

Ornityna

putrescyna - składnik rybosomów , produkt metabolizmu bakterii

Lys

kadaweryna - składnik rybosomów , produkt metabolizmu bakterii

Asp

β - alanina - skadnik CoA , anseryny , karnozyny

Cys

cystoamina - składnik CoA

Trp

serotonina - powoduje skurcz mięśni gładkich naczyń krwionośnych , stymuluje OUN.

Niedobór serotoniny prowadzi do depresji
Glu

kwas γ - aminomasłowy ( GABA ) - neuroprzekaźnik w OUN

Ser

etanoloamina - składnik choliny

fosfolipidy

Właściwości chemiczne aminokwasów

1/ Zmiana stanu jonizacji aa w zależności od pH

COOH

COO-

pH = 1

pH = 7

pH = 11

Forma przeważająca jon obojnaczy forma przeważająca
jon dwubiegunowy

Równoczesna obecność w cząsteczkach aa grup - COOH i - NH

sprawia , że aa są
związkami amfoterycznymi , których charakter uzależniony jest od
stężenia jonów H

w roztworze. W roztworze wodnym aa tylko w

znikomej ilości ( 0,1% ) występują jako cząsteczki elektrycznie
nienaładowane , w ogromnej większości są jonami. Jony w
zależności od oddziaływania środowiska mogą mieć charakter
kwaśny lub zasadowy.
W środowisku kwaśnym aa przyłącza H

stając się kationem, w

polu elektrycznym wędruje do katody i zachowuje się jak kwas
bo grupa - COOH i NH

mogą oddysocjować proton. W

środowisku zasadowym aa oddysocjowuje H

i staje się anionem ,

polu elektrycznym wędruje do anody i zachowuje się jak zasada
bo grupa
- COO

i NH

może przyjmować proton.

Należy pamiętać , że w przypadku Asp , Glu , Lys , His , Arg , Tyr , Cys jonizacji ulega również
łańcuch boczny aa.
Jon obojnaczy jest amfoteryczny ponieważ może zarówno przyłączyć proton do grupy - COO

jak i go oddysocjować od grupy NH

Cząsteczka takiego jonu obojnaczego zachowuje się tak jak gdyby nie była naładowana , a więc
nie wędruje w polu elektrycznym gdyż sumaryczny ładunek takiej cząsteczki jest równy zero.

2/.

pH , w którym cząsteczka aa występuje w postaci jonu obojnaczego ( sumaryczny ładunek

cząsteczki = 0 ) nosi nazwę

PUNKTU IZOELEKTRYCZNEGO pI

Każdy aa ma charakterystyczny dla siebie pI np. :
- alanina = 6,02
- lizyna = 9,7
- arginina = 10,8
- kwas asparaginowy = 2,98
W przypadku aa (

tylko aa

) pI jest równy punktowi izojonowemu tj takiemu pH , przy którym

cząsteczka ma jednakową liczbe protonów uwolnionych z grupy - COOH i protonów
związanych z grupą - NH

3/.

Aa mają właściwości buforowe

4/.

Reakcje jakim ulegają aa :

a) reakcje polimeryzacji :

aa + aa < <- ->> dipeptyd + H

Wiązanie peptydowe , ( zaznaczono kolorem czerwonym ) jest wiązaniem
kowalencyjnym

b) Tworzenie kompleksów chelatowych z jonami metali ciężkich np. Cu

c) Reakcje charakterystyczne dla grupy - COOH :
- tworzenia amidów kwasowych
* z NH

>>> amid I rzędowy

* z aminą I rzędową >>> amid II rzędowy
* z aminą II rzędową >>> amid III rzędowy

- tworzenia estrów

- reakcja dekarboksylacji - na skutek stopniowego ogrzewania aa do około 200C wydziela się

i powstają aminy I rzędowe

- tworzenie chlorków kwasowych z mocnym kwasem np. HCl

d) Reakcje charakterystyczne dla grupy NH

- tworzenie zasady Schiffa w reakcji z aldehydem

- reakcja acylowania z bezwodnikiem kwasowym lub chlorkiem kwasowym - powstają

amidy kwasowe ( R. Schottena - Bowmanna ) - reakcja często służy do zabezpieczania
grupy aminowej.

- reakcja N - alkilowania - bezpośrednie działanie halogenkiem alkilowym na aa - powstają
monoalkilowe pochode aminokwasów.
Całkowite alkilowanie ( N,N,N - trialkilowe pochodne aa ) - w reakcji
aa + diazoalkan lub siarczan dialkilowy

REAKCJA TRANSAMINACJI

- odwracalna wymiana grupy aminowej między

amino

kwasem a

keto

kwasem

w wyniku , której powstaje nowy aminokwas i nowy ketokwas

kk1 aa2 aa1 kk2

- reakcja dezaminacji:

a. Chemiczne utlenianie ( podchloryn , Ag

O )

Aldehyd + NH

b. Przy użyciu oksydaz aminokwasowych z udziałem koenzymu FAD lub FMN

Ketokwas + NH

REAKCJE SŁUŻĄCE DO ILOŚCIOWEGO OZNACZANIA STĘŻENIA AMINOKWASÓW

- Aminokwasy ulegają reakcji z kwasem azotawym HNO

Aminokwasy w tej reakcji zachowują się jak aminy I rzędowe

hydroksykwas

!!!

w połowie pochodzi od HNO

a w połowie z wolnych grup -

aminokwasów ,

peptydów czy białek .

Ilość wydzielonego N

jest wprost proporcjonalna do ilości grup - NH

2 .

Reakcja ta jest

wykorzystywana w gazometrycznej metodzie oznaczania ilościowego α - aminokwasów metodą
Van Slyke’a.

Reakcja NINHYDRYNOWA

Aminokwas pod wpływem ninhydryny ulega utlenieniu poprzez α - iminokwas
do aldehydu o 1 atom C uboższego , NH

i CO

W wyniku kondensacji 2 cząsteczek ninhydryny ( utlenionej i zredukowanej ) z NH

powstaje

związek o fioletowym zabarwieniu , którego natężenie jest wprost proporcjonalne do zawartości
azotu α - aminowego aminokwasów. Jest to metoda spektrofotometryczna , w której mierzy się
natężenie barwy zależnej od stężenia powstałego kompleksu ninhydryny z NH

przy λ = 540 nm

( α - aminokwasy )

α - iminokwasy z ninhydryną dają produkt

żółty ( Pro , hydroksyPro ).

Reakcja ta jest również podstawą do oznaczenia stężenia aa metodą gazometryczną , w której
oblicza się ilość wydzielonego CO

lub NH

Reakcję ninhydrynową dają również peptydy , białka , sole amonowe , aminocukry i amoniak.
Przy oznaczaniu aa tą metodą należy je wykluczyć.

Reakcje charakterystyczne dla poszczególnych aa :

- Reakcja Adamkiewicza - Hopkinsa - dla tryptofanu ( na pierścień indolowy ).
Z kwasem glioksalowym w środowisku bezwodnym, po podwarstwieniu stężonym H

granicy faz powstaje

fioletowy pierścień

2 cząsteczki Trp kondensują z kwasem glioksalowym związek o

fioletowym zabarwieniu

- Próba Millona - na grupę fenylową ( Tyr )
Tyr + metaliczna Hg rozpuszczona w stężonym HNO

ΔT

W podwyższonej temperaturze

Powstają rtęciowe sole nitrowanej tyrozyny (

czerwone zabarwienie

- Reakcja ksantoproteinowa - pierścień aromatyczny ( Phe , Tyr , Trp )

Phe , Tyr , Trp + stężony HNO

ΔT

Nitrowe pochodne aa o

pomarańczowym zabarwieniu

- Reakcja Sakaguchi - dla Arg. W środowisku 10% roztworu NaOH + 1%
etanolowy roztwór
α - naftolu + NaBrO

(podbromin sodu)

Czerwone zabarwienie kompleksów

( Arg z α-naftolem).

- Reakcja cystynowa - dla cysteiny i cystyny (-SH )
Z ( CH

COO)

Pb w środowisku silnie alkaliczny 30% NaOH po kilkunastu

minutach
ogrzewania powstaje czarny osad. Ogrzewanie z ługiem daje hydrolizę co
powoduje , że siarka
z cystyny i cysteiny ulega uwolnieniu w postaci jonów S

, które z Pb

dają

czarny osad PbS.

Metionina nie daje tej reakcji

- dla cysteiny z nitroprusydkiem sodu w środowisku rozcieńczonego NH

•H

powstają

czerwono zabarwione związki.

- dla cysteiny z 1,2 - naftochinolo - 4 - sulfonianem sodowym + podsiarczyn
sodowy - powstają

czerwone związki

( r. Sullimana )

- reakcja Pauly’ego - dla Tyr i His
Tyr lub His

(w roztworze alkalicznym)

+ kwas dibenzenosulfonowy - powstają

czerwone

pochodne

- reakcja Erlicha - dla Trp
Trp + p - dimetyloaminobenzaldehyd + 12M HCl powstaje

niebieskie

zabarwienie

Metody rozdziału mieszaniny aminokwasów :

- chromatografia - czyli rozdział aa między fazę nieruchomą ( stacjonarną ) i

fazę ruchomą
faza nieruchoma - ciecz , ciało stałe
faza ruchoma - ciecz , gaz
- chromatografia cienkowarstwowa na adsorbentach takich jak : sproszkowana
celuloza ,
żel
krzemionkowy
- chromatografia bibułowa
- chromatografia kolumnowa ( kolumna wypełniona ziarnami adsorbenta )
- chromatografia jonowymienna ( anionowymienna gdy ziarna kolumny są (+) )
( kationowymienna gdy ziarna kolumny są
(- ) )
- chromatografia gazowa
- HPLC
- elektroforeza

P E P T Y D Y

- Są związkami złożonymi z 2 lub więcej aa ( do 100 aa ) połączonymi wiązaniami peptydowymi

tworząc łańcuch peptydowy.
- Aa w łańcuchu peptydowym nazywamy resztami aminokwasowymi.
- Wiązanie peptydowe :

d i p e p t y
d

Wiązanie amidowe jest wiązaniem sztywnym. Brak jest rotacji wzdłuż wiązania
peptydowego gdyż
wiązanie to wykazuje częściowo charakter wiązania podwójnego.

Możliwość rotacji wzdłuż wiązania Cα - C

karboksylowy

i N - Cα .

Wiązanie peptydowe jest częściowo spolaryzowane N

δ+

- C

δ-

Atom H rupy -NH- jest zawsze w pozycji trans w stosunku do atomu O
grupy =C=O ( jest to
korzystne energetycznie ).

Nomenklatura peptydów :

- dipeptyd
- tripeptyd
- tetrapeptyd
- oktapeptyd itd..
2 - 10 aa to oligopeptydy
do 100 aa - polipeptydy
> 100 aa - makropeptydy ( białka )

Nomenklatura peptydów polega na podaniu kolejności reszt aa wchodzących w skład peptydu lub
białka ( sekwencji w łańcuchu ) od N końca do C końca.
N - koniec - to ten gdzie występuje reszta aa z wolną grupą -NH

- początek łańcucha

C - koniec - to ten gdzie występuje reszta aa z wolną grupą -COOH - koniec łańcucha

Nomenklaturę peptydów tworzy się w ten sposób , że aa którego grupa -COOH wchodzi w reakcję
z grupą NH

kolejnego aa (lub innaczej , którego grupa -COOH tworzy wiązanie peptydowe )

otrzymuje końcówkę -ylo lub -ilo
Przykład:
Gly-Ala

glicyloalani
na

Ala-Leu-Tyr

alanyloleucylotyrozyna

Zasada oznaczania reszt aa trzema
pierwszymi literami pochodzącymi od
nazwy danego aa

!!!

Sekwencja aa w peptydzie lub białku jest jednakowa z sekwencją nukleotydów

w DNA kodującym dane białko lub peptyd.

Właściwości peptydów :

- Peptydy mają tylko strukturę I rzędową . Brak struktury II , III czy IV
rzędowej - charakterysty-
cznej dla białek.
- Nie ulegają sedymentacji w czasie ultrawirowania.
- Nie występują w postaci koloidów
- Nie dają efektu Tyndala
- Nie ulegają denaturacji bo brak jest struktury II , III czy IV rzędowej
- Nie wywierają ciśnienia osmotycznego
- Nie ulegają wysalaniu i wsalaniu
- Dializują
- Wędrują w polu elektrycznym dzięki cząstkowemu ładunkowi elektrycznemu
- Z powodu obecności wiązania peptydowego, peptydy pochłaniają światło
nadfioletowe przy
max λ=230 nm a z powodu obecności Tyr i Trp przy λ=280 nm
- Peptydy są związkami amfoterycznymi
- Każdy peptyd ma charakterystyczny dla siebie punkt izoelektryczny
- mają właściwości buforowe w odpowiednim przedziale pH

Reakcje , którym ulegają peptydy - patrz białka !!

Naturalne peptydy czynne biologicznie :

I Naturalne krótkie peptydy - oligopeptydy
- karnozyna ( β - alanylo - L - histydyna ) - występuje w mięśniach
- anseryna ( β - alanylo - 1 - metylo - L - histydyna ) jak wyżej

β - alanina wchodzi w skład kwasu pantotenowego ( Vit B

), który

z kolei jest
składnikiem CoA

- glutation ( γ - glutamylo - cysteinylo - glicyna ) - jest koenzymem wielu

enzymów katalizujących
procesy red-ox. Jest nośnikiem biorącym udział w transporcie aa.
- hormony tkankowe :

Miejsce biostynezy
plazma krwi

Bradykinina

( 9 nanopeptyd ) - rozkurcz mięśni gładkich i  ciśnienia

Kalidyna

( 10 - reszt aa ) - naczyniorozszerzająco i  ciśnienia

Angiotensyna II

( 8 reszt aa ) - skurcz m gł nacz krwion i  ciśnienia

!! Cykliczne peptydy

Miejsce biosyntezy:
-

podwzgórze

Miejsce gromadzenia i
wydzielania :
-

tylny płat przysadki

Oksytocyna

( 9 r aa) - skurcz mięśni macicy u kobiet w ciąży i

wydzielanie mleka

Wazopresyna

( 9 r aa) -  ciśnienia krwi i  wydalania H

O przez

nerkę - hormon antydiuretyczny

Miejsce biosyntezy
-

podwzgórze

Tyreoliberyna TRF

( 3 r aa ) - uwalnia tyreotropinę z

przedniego płata przysadki

Gonadoliberyna LHRF

FSHRF

( 10 r aa ) - pobudza syntezę i

wydzielanie LH i FSH

Somatoliberyna GHRF

( 10 r aa ) - pobudza syntezę i wydzielanie

Somatotropiny GH

Niektóre antybiotyki :

Gramicydyna S

- ( 10 r aa )

Aktynomycyna

Walinomycyna

( 6 r aa + 6 hydroksykwasów )

Penicylina

( 2 r aa - Val i Cys + reszta kwasowa )

II Naturalne długie peptydy - polipeptydy

- Miejsce biosyntezy -

przedni płat przysadki :

ACTH

- adrenokortykotropina ( 39 r aa ) - pobudza nadnercza do uwalniania glikokortykoidów

TSH

- tyreotropina ( α - 96 r aa i β - 113 r aa ) - pobudza tarczycę do uwalniania trijodotyroniny i

tyroksyny

FSH

- hormon folikulotropowy , folitropina (α , β ) - odpowiada za tworzenie i wydzielanie

steroidów płciowych. U kobiet jest odpowiedzialny za dojrzewanie pęcherzyków
Graffa. U mężczyzn wpływa na cewkę nasienną w jądrach.

- hormon luteinizujący , lutropina (α , β ) - odpowiada za tworzenie i wydzielanie steroidów

płciowych. U kobiet wywołuje owulację i tworzenie ciałka żółtego w jajnikach.
U mężczyzn - pobudza wydzielanie komórek śródmiąższowych ( Leydiga ) w jądrach.

- somatotropina ( 190 aa ) hormon wzrostu ( BIAŁKO !! )

PRL

- prolaktyna (198 aa ) - pobudza wydzielanie mleka ( BIAŁKO !! )

Miejsce biosyntezy -

środkowy płat przysadki

MSH

- melanotropina ( 13 i 18 r aa ) - reguluje metabolizm pigmentu

Miejsce biosyntezy -

podwzgórze :

- Wcześniej wymienione liberyny - krótkie peptydy
- CRF -

kortykoliberyna ( 41 aa ) - pobudza syntezę i wydzielanie ACTH

- GH-IH -

somatostatyna (14 aa )

- PRL-IH -

prolaktostatyna ( dopamina)

Miejsce biosyntezy -

tarczyca :

- Kalcytonina -

( 32 aa ) -  poziom Ca

w surowicy, hamuje resorpcję Ca

z kości i

kanalików nerkowych.

Miejsce biosyntezy -

przytarczyce :

- PTH -

( 84 r aa ) -  Ca

w surowicy (  resorpcji z kości ,  wchłaniania w jelitach ,

 wydalania z moczem )

Miejsce biosyntezy -

trzustka :

- komórki wyspowe kwasochłonne  -

Glukagon

- ( 29 aa ) powoduje  glukozy we krwi

 glikogenolizy ,  lipolizy

- komórki wyspowe zasadochłonne -

Insulina

- ( 51 aa ) powoduje  glukozy we krwi

 syntezy kwasów tłuszczowych i TG

Miejsce biosyntezy -

śluzówka żołądka :

- Gastryna

( 17 aa ) - pobudza wydzielanie HCl

Miejsce biosyntezy-

śluzówka jelit :

- Sekretyna

( 27 aa ) - pobudza syntezę i wydzielanie

enzymów trawiennych.
Trucizny :

Ammanityna i Falloidyna

- toksyny muchomora sromotnikowego.

B I A Ł K A

- To związki organiczne o dużej masie cząsteczkowej , zbudowane głównie z

aa połączonych

wiązaniami peptydowymi.

- Białka zbudowane są z 1 lub kilku łańcuchów peptydowych :

- 1 łańcuch



białko monomeryczne ( cytochrom C , mioglobina , rybonukleaza )

- kilka łańcuchów



białko polimeryczne:

- homopolimeryczne ( takie same łańcuchy ) np.

heksokinaza ( α

)

- heteropolimeryczne ( różne łańcuchy ) np. Hb ( α

)

--- Podział białek ---

1/. Na podstawie kształtu cząsteczki białka (stosunek osiowy - czyli stosunek

długości do szerokości)

białka globularne

- stosunek osiowy < 10 ( 3 - 4 ), łańcuchy polipeptydowe

ściśle pofałdowane i

zwinięte np. albuminy i globuliny osocza , większość enzymów

białka włókienkowe ( fibrylarne )

- stosunek osiowy > 10 , łańcuchy

polipeptydowe zwinięte

śrubowo lub w helisy , połączone krzyżowo wiązaniami kowalencyjnymi lub

wodorowymi np.

- β-keratyna

- α-keratyna

- kolagen

2/.

Klasyfikacja białek na podstawie ich rozpuszczalności

- Albuminy - R w H

O i roztworach soli

- Globuliny - słabo R w H

O ale dobrze w roztworach soli

- Prolaminy - R w 70 - 80% etanolu. NR w H

O i etanolu absolutnym. Bogate w Arg

- Histony - R w roztworach soli i kwasów nieorganicznych

- Skleroproteiny - NR w H

O ani w roztworach soli. Bogate w Gly , Ala , Pro

3/.

Klasyfikacja białek na podstawie budowy chemicznej

- białka proste ( homoproteiny ) składają się niemal wyłącznie z aa

- białka złożone (heteroproteiny) zawierają integralną część niebiałkową -

grupę prostetyczną

mocniej lub słabiej związaną z częścią białkową np. :

- glikoproteiny - fibronektyna , IgG

- fosfoproteiny - ufosforylowana Ser , Thr , Tyr - kazeina , fosforylaza glikogenowa

- lipoproteiny - LDL , HDL

- nukleoproteiny - chromosom , rybosom

- metaloproteiny - ferrytyna ( Fe

) , transferyna ( Fe

), dehydrogenaza alkoholowa ( Zn

oksydaza cytochromowa ( Cu i Fe )

- chromoproteiny ( hem ) - Hb , cytochrom C , katalaza , mioglobina

- flawoproteiny ( FAD , FMN ) - dehydrogenaza bursztynianowa

4/.

Podział ze względu na rolę białka w organizmie

5/.

Podział ze względu na pochodzenie białka :

roślinne , zwierzęce , bakteryjne , wirusowe

6/. Podział białek ze względu na wartość odżywczą :

- białko pełnowartościowe - zawiera wszystkie aa niezbędne

- białko niepełnowartościowe - brak przynajmniej jednego aa niezbędnego

W budowie białka wyróżnia się 4 zasadnicze poziomy organizacji łańcucha polipeptydowego:

struktura I rzędowa



sekwencja aa w łańcuchu polipeptydowym.

- struktura II rzędowa



przestrzenne ułożenie reszt aa sąsiadujących ze sobą w sekwencji

liniowej ( wiązania wodorowe , jonowe , disiarczkowe , oddziaływania

hydrofobowe , wiązania van der Walsa , estrowe , O , N - glikozydowe).

- struktura III rzędowa



określa powiązania przestrzenne i wzajemne ułożenie reszt aa

oddalonych od siebie w sekwencji liniowej oraz lokalizację mostków

disiarczkowych. Określa przestrzenne ułożenie łancucha polipeptydowego.

- struktura IV rzędowa



w białkach zbudowanych z więcej niż jednego łańcucha

polipeptydowego. Określa wzajemne ułożenie przestrzenne podjednostek

i rodzaj ich kontaktu ( Hb , kolagen , wirus polio , Rynowirus 14 ).

Rola białek , funkcje :

- enzymatyczna -

prawie wszystkie enzymy są białkami , zwiększają szybkość reakcji o około

1 mln razy . Istnieje kilka tysięcy enzymów, z których każdy katalizuje

swoistą dla siebie reakcję chemiczną np.: trypsyna , pepsyna , rybonukleaza ,

dehydrogenaza alkoholowa , katalaza , fosfofruktokinaza.

- budulcowa :

α - keratyna - włosy , rogi , paznokcie

kolagen

elastyna - białko tkanki łącznej , odpowiedzialnym za zdolność tkanek do

rozciągania i powrotu do uprzedniego kształtu. Nie jest tak

rozpowszechniona jak kolagen , ale występujje w dużych ilościach w

tkankach , które wymagają takich właściwości fizycznych , a więc np.:

w płucach , dużych tętnicach i niektórych więzadłach sprężystych

białka błonowe - białka strukturalne

- magazynowa :

ceruloplazmina - białko magazynujące Cu

ferrytyna - białko magazynujące Fe

mioglobina - magazynuje O

w mięśniach

- transportowa :

Hb - transport O

we krwi

transferyna - transport Fe

albumina - transport np. leków

- regulacyjna :

hormony : peptydowe (omówione wcześniej), białkowe np. GH , PRL (omów wcześniej)

białka represorowe - hamują transkrypcję genów

- ochronna :

immunoglobuliny - układ odpornościowy

trombina , fibrynogen - ochrona przed utratą krwi

- ruch :

aktyna , miozyna - mięśnie

tubulina - białko mikrotubul biorące udział w podziałach komórkowych

- rola buforowa :

we krwi - albuminy

- wytwarzanie i przekazywanie impulsów nerwowych :

białka receptorowe - rodopsyna ( białko fotoreceptorowe występujące w siatkówce oka ).

*** Właściwości białek ***

mają charakter związków wielkocząsteczkowych, co powoduje , że białka nie dializują , a

roztwory białek wykazują właściwości - cechy koloidów

wywierają ciśnienie koloido - osmotyczne

mają zdolność wiązania jonów

wędrują w polu elektrycznym dzięki ładunkowi elektrycznemu cząsteczki. Szybkość

poruszania się w polu elektrycznym zależy od wielkości ładunku elektrycznego , oraz od

rozmiarów i kształtu cząsteczki

większość białek dobrze rozpuszcza się w H

O , niektóre w trozcieńczonych roztworach

soli , kwasów i zasad. O rozpuszczalności decyduje przede wszystkim ich zdolność do

hydratacji , budowa chemiczna , obecność soli w środowisku i pH środowiska

białka ulegają wysalaniu pod wpływem silnych elektrolitów np. soli Stężenie soli potrzebne

do wysolenia zależy od właściwości białka i pH środowiska. Wysalacze : (NH

)

, MgSO

aceton , etanol ( ale działając krótko ). Wysalanie jest procesem odwracalnym bo nie powoduje

denaturacji białka.

- Wsalanie jest procesem odwrotnym do wysalania , którego dokonuje się przez stopniowe

rozcieńczanie roztworu białek.

- Białka ulegają denaturacji .

Zniszczeniu ulega IV , III , lub II rzędowa struktura białka , I rzędowa struktura pozostaje

niezmieniona - a więc zmianie ulega konformacja łańcucha polipeptydowego. Białko traci

swoje właściwości. Rozrywane są wiązania wodorowe , jonowe , hydrofobowe , disiarczkowe ,

van der Walsa.

DENATURACJĘ POWODUJĄ :

Czynniki fizyczne : ogrzewanie , wysalanie , ultradźwięki , promieniowanie , wstrząsanie

wodnych roztworów białek w atmosferze powietrza.

Czynniki chemiczne : kwasy , zasady , jony metali ciężkich , chlorowodorek guanidyny ,

mocznik , detergenty , fenol , chloroform , rozpuszczalniki mieszające się

wodą ( etanol , aceton )

- Skręcają płaszczyznę światła spolaryzowanego w lewo , ponieważ zbudowane są z L-aa.

- Roztwory białek cechuje duży współczynnik załamania światła , który wzrasta liniowo w

miarę wzrostu stężenia białka w roztworze , co wykorzystuje się do ilościowego oznaczania

białka metodą referencyjną

- Z powodu obecności wiązań peptydowych białka pochłaniają światło nadfioletowe z max

absorbancji przy λ = 230 nm, a z powodu obecności Tyr i Trp przy max λ = 280 nm

- Masa cząsteczkowa białek waha się od 10.000 do wielokrotności miliona.

- Białka są związkami amfoterycznymi.

- Każde białko ma charakterystyczny dla siebie punkt izoelektryczny pI np.:

- pepsyna 1.0

- kazeina 4.7

- mioglobina 7.0

- trypsyna 10. 5

W punkcie izoelektrycznym rozpuszczalność białka jest najmniejsza i najłatwiej jest wtedy

takie białko wytrącić z roztworu bądź wykrystalizować.

W punkcie izoelektrycznym białko :

- wykazuje najmniejsze ciśnienie osmotyczne

- ma najmniejszą lepkość

- najsłabiej pęcznieje

- nie reaguje z anionami ani z kationami

- wykazuje najmniejszą ruchliwość elektroforetyczną

- Białka mają właściwości buforowe w odpowiednim przedziale pH

Reakcje chemiczne , którym ulegają białka

Reakcja ninhydrynowa

Reakcja ninhydrynowa -

aa , peptydy , białka , sole amonowe ,

aminocukry , amoniak

- Reakcja z HNO

- Reakcja biuretowa ( Piotrowskiego ) - peptydy i białka.

Jest to

reakcja na wiązania

peptydowe.

W środowisku alkalicznym 2 wiązania peptydowe tworzą

kompleks z jonami

dając zabarwienie fioletowo - niebieskie. Reakcji tej ulegają więc

tylko tripeptydy ,

tetra - , penta - ....peptydy. Dipeptydy powyższej reakcji nie ulegają.

Reakcja służy do

oznaczeń ilościowych i jakościowych.

- Metoda Lowry’ego - do ilościowego oznaczania peptydów i białek.

Metoda wykorzystuje

czułą reakcję wiązań peptydowych i tyrozyny z odczynnikiem

wolframowo - molibdenowo -

fosforowym ( Folina - Ciocalteu ). Jest to kombinacja reakcji

biuretowej oraz reakcji

między resztami tyrozyny a odczynnikiem Folina , w której powstają

barwne , niebieskie

produkty. Metoda pozwala na oznaczenie białka w stężeniu 1μg / ml.

Jest zatem ok. 100

razy dokładniejsza i czulsza niż biuretowa.

- Metoda oznaczania zawartości białka za pomocą pomiaru

absorbancji w nadfiolecie -

peptydy i białka. Większość białek ze względu na zawartość reszt

Tyr i Trp wykazuje

max absorbancji przy λ = 280 nm. Związki , które mogą wpływać na

absorbancję to :

kwasy nukleinowe ( wykazujące max absorbancji przy λ = 260 nm )

oraz puryny ,

pirymidyny i fenole.

- Metoda Bradforda - peptydy i białka - metoda służy do oznaczeń

ilościowych

Z błękitem brylantowym Coomassie’go G-250 w środowisku

kwaśnym białko wiąże się

za pomocą wiązań jonowych i hydrofobowych Arg , w mniejszym

stopniu His , Lys , Tyr ,

Trp , Phe. W wyniku reakcji powstaje brunatne zabarwienie wprost

proporcjonalne do

zawartości białka w roztworze.

- Metoda Kjeldahla - oznaczanie zawartości azotu białkowego -

oznaczanie ilościowe.

Azot białka oznacza się po rozkładzie białka do NH

. Białko gotuje

się ze stężonym

+ katalizator



następuje zniszczenie białka i powstaje

(HN

)

Następnie

dodaje się nadmiar alkaliów , które powodują uwolnienie NH

, który

wyłapuje się w

płuczce z H

. Następnie oznaczenie prowadzi się przez

miareczkowanie.

- Hydroliza wiązania peptydowego.

A) hydroliza kwaśna

6 - 12N HCl lub 4 - 7N H

w temperaturze 110



C przez 24 ,

48 i 72 godziny

Używamy 5 - 10 razy więcej kwasu niż białka . Nie wolno używać

HNO

gdyż powoduje

utlenienie bądź nitrowanie pierścieni .

Wady :

niszczy : - Trp

- Powoli aa z grupą -OH : Ser , Thr ( ale mając

stężenia tych aa po

czasie 24 , 48 ,72 h można ekstrapolować

stężenie wyjściowe )

- Gln , Asn w środowisku kwaśnym są nietrwałe



Glu , Asp + NH

Na podstawie uwolnionego NH

oznaczamy

sumę Gln + Asn i np.

chromatograficznie sumę Asp + Asn oraz Glu +

Gln

B/. Hydroliza zasadowa - w 2M NaOH - rzadko stosowana bo powoduje

racemizację i straty

Ser , Thr , Arg , Cys .

Trp - nie ulega zniszczeniu , stąd metodę tę można stosować do

odzysku Trp

C/. Hydroliza enzymatyczna - najlepsza !

Endo- i egzopeptydazy

Karboksy- i aminopeptydazy

Schemat uzyskiwania czystej frakcji białek z materiału

biologicznego

1. Ekstrakcję białka z materiału biologicznego rozpoczynamy od

homogenizacji tkanki w

zimnym ( ok. 4ºC ) buforze. Do buforu dodajemy inhibitory proteaz

aby zapobiec proteolizie .

2. Wytrząsanie z H



białka rozpuszczalne w H

O przechodzą do

roztworu

3. Ekstrakcja białka do 1:1 etanol : chloroform

4. Wysalanie przy odpowiednim stężeniu soli ( wypada kilka białek )

5. Wsalanie

6. Wytrącanie w pJ ( kilka białek ). Pozbywamy się przy okazji znacznej

ilości białek

balastowych.

7. Adsorbcja na żelu fosforanowo - wapniowym

8. Elucja z żelu

9. Wysalanie

10. Wsalanie

11. Oczyszczanie końcowe i analiza .

Na każdym etapie oczyszczania należy kontrolować obecność

badanego białka

Uzyskiwanie frakcji białkowych

1. Wirowanie różnicowe

- f. Jąder komórkowych i nie rozerwane fragmenty komórkowe - wirowanie 600 G 3 minuty

- f. Mitochondriów , chloroplastów , lizosomów i peroksysomów - wirowanie 6000 G 8 min.

- f. Mikrosomalna : błony komórkowe , fragmenty aparatu Golgiego i ER

wirowanie - 40 000 G 30 min.

- f. Podjednostek rybosomów - wirowanie 100 000 G 90 min. W roztworze pozostają białka

cytoplazmatyczne.

- f. Białek cytoplazmatycznych - wirowanie



100 000 G

2. Wirowanie w gradiencie gęstości sacharozy ( lizosomy



mitochondria



peroksysomy )

Rozdział mieszaniny białek

- biorąc pod uwagę wielkość ( rozmiar ) cząsteczek :

•

Elektroforeza żelowa ( na żelu poliakryloamidowym ) w obecności SDS - rozdział białek

odbywa się na podstawie masy cząsteczkowej białka .

•

Chromatografia żelowa - filtracja żelowa ( sączenie molekularne ). Fazą nieruchomą jest

żel polisacharydowy , który dzaiła jak sito molekularne . Jego cząstki zawierają wypełnione

wodą puste przestrzenie - kanaliki - do których przenikają małe i średnie cząsteczki . Duże

cząsteczki pozostają na zewnątrz. Odpowiedni rozpuszczalnik wymywa je.

•

Ultrafiltracja

•

Ultrawirowanie - wirowanie w gradiencie gęstości.

W tym celu nawarstwia się roztwory sacharozy o różnej gęstości. Podczas wirowania

białka wędrują tak długo aż własna gęstość białka zrówna się z gęstością rozpuszczalnika.

Po odwirowaniu rozdzielamy warstwy przez kolejne zlewanie każdej z nich z osobna.

- biorąc pod uwagę ładunek elektryczny :

•

Chromatografia jonowymienna

•

Elektroforeza w żelu poliakryloamidowym

Przy odpowiednim pH , które ustala się przez zastosowanie buforu , różne białka wędrują

w polu elektrycznym zgodnie ze swoim ładunkiem elektrycznym. Cząsteczki białka o

wypadkowym cząstkowym ładunku ujemnym wędrują w kierunku Anody, białka

posiadające ładunek dodatni - w kierunku Katody. Prędkość wędrówki zależy od sumy

ładunków , wielkości i kształtu cząsteczki . ( Elektroforeza dyskowa , Immunoelektroforeza )

•

Elektroforeza w gradiencie pH - ogniskowanie izoelektryczne

Białko będzie wędrowalo do momentu osiągnięcia pozycji , w której pH żelu

zrówna się z pH białka .

•

HPLC

- biorąc pod uwagę wielkość cząsteczki i ładunek elektryczny

•

Rozdzielanie na podstawie rozpuszczalności .

Polega na wysalaniu z roztworu wodnego solami obojętnymi np.: (NH

)

lub MgSO

Do roztworu białek dodaje się wzrastającą ilość soli każdorazowo odwirowując wytrącone

białko. Przez zmianę pH metodę można udoskonalić. Metoda ta stosowana jest tylko do

oczyszczania wstępnego .

Po wyizolowaniu białka w czystej postaci wyżej wymienionymi metodami białko należy

scharakteryzować pod względem chemicznym :

- przez wyznaczenie punktu izoelektrycznego

- przez wyznaczenie względnej masy cząsteczkowej

- przez analityczne oznaczenie całkowitego stężenia białka

- charakterystyka immunologiczna

Metody wyznaczania względnej masy cząsteczkowej :

•

ultrawirowanie przez wyznaczenie stałej sedymentacji Svedberga

•

na podstawie składu białka ( oznaczamy ilość O , C , N , S



masa białka )

•

na podstawie ciśnienia osmotycznego jakie białko wywiera na błonę półprzepuszczalną

w ściśle określonym pH i stężeniu białka w roztworze.

•

na podstawie efektu Tyndala ( rozpraszania światła )

•

chromatografia na sitach molekularnych

•

Elektroforeza żelowa SDS

•

Metoda wirowania w różnych gradientach stężeń

60 - 20% roztwór sacharozy

6M roztwór chlorku cezu sam tworzy gradient

Są to metody porównawcze naszego białka z białkiem stanowiącym wzorzec standardowy.

Określenie struktury I rzędowej białka

1. Jeśli białko jest heteropolimeryczne tzn zawiera wiecej niż jeden łańcuch polipeptydowy

to łańcuchy należy rozdzielić i oczyścić .

Rozrywanie wiązań :

- wodorowe - 8M mocznik

6M chlorowodorek guanidyny

- diS - utlenianie kwasem nadmrówkowym do SO

- redukcja za pomocą β - merkaptoetanolu do -SH a następnie należy

podziałać kwasem jodooctowym lub akrylonitrylem aby zablokować

grupę -SH i zapobiec powstawaniu nowych wiązań diS

- hydrofobowe - detergenty

- jonowe - kwasy , zasady

Rozdział i oczyszczanie - podobnie jak białka

2. Określenie reszty aa na N i C - końcu każdego z rozdzielonych łańcuchów .

N - koniec

A) z odczynnikiem Sangera ( 1 - fluoro - 2,4 - dinitrobenzen ) FDNB

w środowisku alkalicznym



HF + dinitrofenyl - peptyd



kwaśna hydroliza



rozrywa

łańcuch polipeptydowy



+ dinitrofenyl - aa ( N - końcowy aa połączony przez

grupę -NH

z dinitrobenzenem ). Jest to żółta pochodna dinitrofenylowa nie ulegająca

rozkładowi w czasie hydrolizy.

Z odczynnikiem może również kondensować grupa -SH Cysteiny , -OH Tyrozyny ,

dodatkowe grupy -NH

aa zasadowych , pierścień imidazolowy Histydyny.

Dinitrofenylowe pochodne można rozdzielić chromatograficznie ( bibułowa ,

cienkowarstwowa , kolumnowa )

B) z chlorkiem dansylu ( HCl 1-dimetyloaminonaftyleno-5-sulfonylu )



HCl + dansyl - peptyd



kwaśna hydroliza



dansyl - aa + aa

Reakcja ta jest ok. 100 razy czulsza niż z odczynnikiem Sangera

C) DEGRADACJA EDMANA z fenyloizotiocyjanianem ( odczynnikiem Edmana )

środowisko alkaliczne pH=8 - 9



fenylotiokarbamoilowe pochodne



słaby kwas

trifluorooctowy



fenylotiohydantoinowa pochodna z N - końca + peptyd

Analiza ciągła np. przez zastosowanie metod chromatograficznych.

C - koniec

A) Hydrazynoliza - reakcja Akabori

polipeptyd + bezwodna hydrazyna NH

-NH

w 100°C 5 godzin



hydrazydy + wolny

C-terminalny aa. Identyfikacja chromatograficzna. Potwierdzenie - reakcja barwna.

B) Redukcja C - końcowego aa za pomocą LiAlH

( wodoroglinian litu )

wolna grupa -COOH



redukcja do -CH

-OH ( alkoholu )



kwaśna hydroliza



aminoalkohol z C-końcowego aa ( oznaczany chromatograficznie ) + aa

C) Karboksypeptydaza - odcina C - końcowy aa ( z wolną grupą -COOH )

- karboksypeptydaza A - odcina C - końcowy aa oprócz Pro , Arg , Lys

- karboksypeptydaza B - efektywna gdy C - końcowym aa jest Arg lub Lys

Fragmentacja łańcucha polipeptydowego

A) Enzymatyczna

- Trypsyna - tnie wiązania peptydowe po karboksylowej stronie reszt Arg i Lys

- Chymotrypsyna - po stronie karboksylowej reszt aa aromatycznych ( Phe , Tyr , Trp )

- Klostrypaina - po stronie karboksylowej reszt Arg

- Proteaza ze

Staphylococcus

- po karboksylowej stronie reszt asparaginianowych i

glutaminianowych ( glutaminowych tylko w pewnych warunkach : w buforze

wodorowęglanowym lub octanowym ) . Enzym bardzo wybiórczy

B) Nieenzymatyczna fragmentacja

- Bromocyjan ( CNBr ) - po karboksylowej stronie reszt metioninowych

- O - jodobenzen - po karboksylowej stronie reszt tryptofanowych

- Hydroksylamina - wiązania Asn-Gly w pH=9,0 Asp-Pro w pH=2,5 w 40°C

- 2-Nitro-5-tiocyjanobenzen -

po aminowej stronie reszt Cysteiny

Rozdzielenie fragmentów np. chromatograficznie i określenie ich sekwencji :

- degradacja Edmana

- spektroskopia masowa (



dokładność i czułość )

Określenie struktury przestrzennej białka :

- spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego - NMR

- krystalografia rtg

- spektroskopia elektronowa

- rentgenografia krystaliczna i dyfrakcyjna

Oznaczanie N - końcowej reszty peptydu. Peptyd znakuje się chlorkiem dabsylu, a następnie
hydrolizuje stosując HCl. Dabsyloaminokwas ( w tym przypadku

dabsyloalaninę

)

identyfikuje się za pomocą technik chromatograficznych.

DEGRADACJA EDMANA.

Document Outline

Slide 1
Slide 2
Slide 3
Slide 4
Slide 5
Slide 6
Slide 7
Slide 8
Slide 9
Slide 10
Slide 11
Slide 12
Slide 13
Slide 14
Slide 15
Slide 16
Slide 17
Slide 18
Slide 19
Slide 20
Slide 21
Slide 22
Slide 23
Slide 24
Slide 25
Slide 26
Slide 27
Slide 28
Slide 29
Slide 30
Slide 31
Slide 32
Slide 33
Slide 34
Slide 35
Slide 36
Slide 37
Slide 38
Slide 39
Slide 40
Slide 41
Slide 42
Slide 43
Slide 44
Slide 45
Slide 46
Slide 47
Slide 48
Slide 49
Slide 50

Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
b9.11, Prywatne, Biochemia WYKŁADÓWKA I, Biochemia wykładówka 1, WYKŁADY, wykłady I
Biochemia wykład nr 3 kopia
Biochemia wykład 1st 2nd rok 2
globalne cykle biochemiczne wykład 10
Biochemia wykład1, wzory
prawo ustrojowe ue wyklad wstepny rozwoj 2014
Biochemia - kolokwium[1], Studia, Semestr III, Biochemia, Wykłady
lipidy 2, Prywatne, Biochemia WYKŁADÓWKA I, Biochemia wykładówka 1, TESTY, testy
Biochemia wykład 13 Metabolizm węglowodanów
Biochemia wykład 04 2013r 3
Biochemia- wyklady 1-8, Semestr II, biochemia
Biochemia wykłady, biochemia
biochemiawykady, Wykład 12, Wykład 12

więcej podobnych podstron

Biochemia wyklad wstepny2005

Document Outline