Sprawozdanie nr 2 Biologia Laboratorium

Temat: Aktywność enzymatyczna

Wykonane przez:

Grupa: Środa, godz. 15.15-18.45

Prowadząca: mgr Inż. Zofia Dziuganowska

Ćwiczenie 1:

Materiały:

Wyciąg z ziemniaków, 0,1 M bufor fosforanowy (pH=7,4), 0.3% r-r pirokatechiny

Do 4 probówek dodaliśmy 3ml wyciągu z ziemniaka. Próbkę nr 3 umieściliśmy na 5min w łaźni wodnej i schłodziliśmy. Umieściliśmy w nich bufor i pirokatechinę, oraz wodę. Wyniki po 30min przedstawiono w tabeli:

Nr	Wyciąg z ziemniaka (ml)	Woda (ml)	Bufor fosforanowy (ml)	Pirokatechina (ml)	Wynik
1	3	0	0,5	1	Brązowe zabarwienie Spieniony
2	3	1	0,5	0	Przezroczyste
3	3	0	0,5	1	Brązowe zabarwienie
4	3	0	0,5	1	Jasnobrązowy, słabo spieniony

Wnioski: Substratem reakcji jest pirokatechina, wyciąg z ziemniaka dostarczas enzymu oksydazy polifenylowej.

Brązowe zabarwienie jest wynikiem działania tego enzymu, który tworzy melaniny nadające barwę roztworom, co doskonale widać w próbie nr 1.

W próbie nr 2 nie było pirokatechiny – brak substratu do utleniania.

Próbą kontrolną była próba nr 3, enzym został w niej zdezaktywowany przez denaturację w wysokiej temperaturze.

Próba nr 4 różni się od próby nr 1 tylko wydajnością – reakcja zachodziła wolniej, bo tej probówki nie wstrząsano.

Ćwiczenie 2 :

Próba benzydynowa

Materiały: Wyciąg z ziemniaków, odczynnik benzydynowy.

Przebieg doświadczenia: Przygotowano dwie probówki. Do obu dodano 1ml wyciągu z ziemniaka. Probówkę numer 2 zagotowano i następnie oziębiono. Następnie dodano kilka kropel świeżo przygotowanego odczynnika benzydynowego.

Wyniki: W probówce numer 1 barwa roztworu zmieniła się z brązowej na granatową. W probówce numer 2 barwa nieznacznie zmieniła się z brązowej na jasnobrązową.

Wnioski: Zmiana barwy w probówce numer 1 świadczy o obecności peroksydazy ( odczynnik benzydynowy z peroksydazą zmienia zabarwienie na granatowo). W probówce numer 2, w której wyciąg z ziemniaka został uprzednio zagotowany nie doszło do znaczącej zmiany zabarwienia, gdyż peroksydaza została zniszczona pod wpływem wysokiej temperatury. Nieznaczna zmiana zabarwienia może wynikać z zanieczyszenia probówki lub zbyt późnego dodania odczynnika benzydynowego.

Ćwiczenie 3 : b-amylaza z nasion zbożowych

Materiały: Wyciąg z nasion, płyn Lugola, 0,5% r-r skrobi, odczynnik Benedicta

Do 6 ponumerowanych probówek dodaliśmy po 0,7m wody i 1ml skrobi. Do 1 probówki dodaliśmy 0,3ml zagotowanego wyciągu z nasion. Probówki 1,3,4,5,6 umieściliśmy w 37C na czas podany w tabeli.

Później probówki zagotowaliśmy ok 5min, oziębiliśmy i podzieliliśmy na 2 części, w jednej przeprowadzając próbę Benedicta a w drugiej Lugola.

Nr	Czas inkubacji (min)	Próba Benedicta	Próba Lugola
1	30	Brak odbarwienia	granatowe zabarwienie
2	0	Ceglasto-czerwony osad	ciemnoniebieskie zabarwienie
3	5	Ceglasto-czerwony osad	ciemnoniebieskie zabarwienie
4	10	Ceglasto-czerwony osad	niebieskie zabarwienie
5	20	Ceglasto-czerwony osad	niebieskie zabarwienie
6	30	Ceglasto-czerwony osad	niebieskie zabarwienie

Wnioski: Próba Lugola wykrywa skrobię, zaś próba Benedicta cukry redukujące.

Substratem reakcji jest β-amylaza pochodząca z nasion zbożowych. Wraz ze wzrostem czasu inkubacji próba Lugola dawała coraz słabszy wynik, z uwagi na rozpad skrobii, a próba Benedicta dawała coraz więcej czerwonego osadu Cu2O. Enzymy przed zagotowaniem miały coraz więcej czasu by rozłożyć skrobię na prostsze cukry. 1 próba jest kontrolna, w niej znajdował się zagotowany wyciąg z nasion bez wcześniejszej inkubacji, czyli enzymy nie miały czasu zadziałać przed denaturacją i skrobia nie została rozłożona.

Ćwiczenie 4

INWERTAZA Z DROŻDŻY

Materiały: R-r inwertazy, bufor octanowy (pH=4.4), r-r skrobi, r-r sacharozy, odczynnik Benedicta, woda.

Przebieg doświadczenia: Do 4 ponumerowanych probówek odmierzono podane w poniższej tabeli ilości enzymu, buforu, wody, r-r skrobi, r-r sacharozy. Próbówkę numer 4 z enzymem należało zagotować przed dodaniem pozostałych składników. Po wykonanych czynnościach inkubowano probówki w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Po tym czasie należało zobojętnić wszystkie probówki roztworem węglanu sodu ( odczyn sprawdzano papierkiem lakmusowym). Wykonano próbę Benedicta.

Tabela:

Nr próby	Enzym	Woda	Bufor	Skrobia	Sacharoza
1	1	1	1	0	0
2	1	0	1	1	0
3	1	0	1	0	1
4	1	0	1	0	1

Obserwacje:

Probówka nr 1 : próba kontrolna, gdyż nie dodawaliśmy r-r cukrów – wynik negatywny

Probówka nr 2 : próba z roztworem skrobi, bez obecności sacharozy- wynik negatywny

Probówka nr 3 : próba z roztworem sacharozy- wynik pozytywny (ceglasto-czerwone zabarwienie po zagotowaniu)

Probówka nr 4: próba z sacharoza i zagotowanym enzymem- wynik negatywny

Wnioski: Inwertaza jest enzymem który katalizuje sacharozę do prostych cukrów redukujących- glukozy i fruktozy. Próba Benedicta umożliwia wykrycie cukrów redukujących. Z doświadczenia wynika, że tylko sacharoza rozkłada się do cukrów redukujących, gdyż zabarwienie zmieni się tylko w probówce numer 3. W probówce numer 4 zdezaktywowaliśmy inwertazę z drożdzy poprzez jej zagotowanie, dlatego kataliza reakcji nie zaszła. Probówka numer 1 była probówką kontrolną, gdyż nie dodawaliśmy do niej cukrów, więc próba Benedicta dała negatywny wynik. Probówka numer 2 dała negatywny wynik gdyż skrobia nie rozkłada się do cukrów redukujących.

Ćwiczenie 5

Enzymatyczna hydroliza skrobi przez α-amylazę śliny

Materiały: 1% roztwór skrobi, odczynnik Benedicta, ślina, płyn Lugola

Do 4 probówek dodaliśmy po 3ml śliny i skrobię, 2 z nich zagotowaliśmy. Po upływie 10 min wykonaliśmy próby Benedicta i Lugola.

Próba Benedicta.

Lekkie zabarwienie ceglastoczerwone w ślinie niezagotowanej i niebieski roztwór śliny zagotowanej.

Próba Lugola

W ślinie niezagotowanej wynik ujemny, w zagotowanej dodatni, roztwór zabarwił się na niebiesko.

Wnioski:

W ślinie niezagotowanej amylaza śliny rozłożyła skrobię, co dało dodatni wynik próby Benedicta.

W ślinie zagotowanej amylaza została zdezaktywowana i nie rozłożyła skrobii, dając pozytywny wynik próby Lugola.