ZESTAW 45

1. Cykl pentozofosforanowy - lokalizacja, przebieg, regulacja

2. Centrum aktywne enzymów - metody badania

3. Transkrypcja informacji genetycznej

Cykl pentozofosforanowy - lokalizacja, przebieg, regulacja

(na podst. „Biochemii Harpera”, „Biochemii” Bańkowskiego)

Ogólnie o szlaku:

Szlak pewntozofosforanowy stanowi alternatywną drogę metabolizmu glukozy. Jednak, w odróżnieniu od glikolizy nie generuje ATP. Jego główne funkcje to:

1. generacja NADPH (etap oksydacyjny)

2. dostarczanie reszt rybozy (etap nieoskydacyjny)

Enzymy szlaku pentozofosforanowego znajdują sie w cytozolu. Reakcje szlaku mogą zachodzić praktycznie we wszystkich tkankach. Utlenianie, podobnie jak w glikolozie, zachodzi przez odwodornienie, jednak, odmiennie niż w glikolizie, akceptorem protonów jest NADP+, a nie NAD+.

Reakcje szlaku można podzielić na dwie fazy :

- nieodwracalny etap oksydacyjny (odwodornienie i dekarboksylacja glukozo-6-fosforanu do pentozy - rybulozo-5-fosforanu; wytworzenie NADPH)

- odwracalny etap nieosydacyjny (przekształcenie rybulozo-5-fosforanu do glukozo-6-fosforanu).

Reakcje utleniania - przebieg:

Dwie cząsteczki NADPH powstają podczas przekształcenia jednej cząsteczki glukozo-6-fosforanu w rybulozo-5-fosforan.

Utleniaące odgałęzienie szlaku zaczyna się od odwodornienia glukozo-6-fosforanu przy węglu C1 pod działaniem dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej. Produktem reakcji jest 6-fosfoglukonolakton. Enzym współdziała z NADP+. Następnie pod działaniem hydrolazy glukonolaktonowej (syn. glukozolaktonaza) zachodzi hydroliza 6-fosfoglukonolaktonu do 6-fosfoglukonianu.

Druga reakcja utleniania zachodzi pod działaniem dehydrogenazy 6-fosfoglukonolaktonowej, ktora działa na 6-fosfoglukonian. Tu również akceptorem wodoru jest NADP+ (-> NADPH). W wyniku działania tego enzymu, oraz w nastepującej dekarboksylacji powstaje rubulozo-5-fosforan. Prawdopodobnie produktem przejściowym przemiany jest 3-keto-6-fosfoglukonian.

Reakcje fazy nieoksydacyjnej:

Kierunek przemian rybulozo-5-fosforanu jest zróżnicowany, zależny od potrzeb na dany produkt (cykl pentozofosforanowy jest zintegrowany z glikolizą i glukoneogenezą). Enzymy fazy nieoksydacyjnej nie podlegaja kontroli regulacyjnej - przebieg jest regulowany jedynie przez dostepność substratów. Jedynym potrzebnym koenzymem jest pirofosforan tiaminy (koenzym transketolazy).

Zasadniczy kierunek przemian rybulozo-5-fosforanu jest izomeryzacja do rybozo-5-fosforanu z udziałem izomerazy pentozofosforanowej. Tak powstaje substrat do biosyntezy nukleotydów, a ten kierunek przemian zachodzi głównie w komórkach dzielacych się.

Brak zapotrzebowania na rybozo-5-fosforan sparwia, że cząsteczki rybulozo-5-fosforanu przekształcają się do aldehydu-3-fosfoglicerynowego i fruktozo-6-fosforanu: (na przykładzie 6 cząsteczek rybulozo-5-fosforanu). Dwie spośród 6 cząsteczek rybulozo-5-fosforanu izomeryzuja do rybozo-5-fosforanu (izomeraza pentozofosforanowa). Cztery pozostale izomeryzuja do ksylulozo-5-fosforanu (epimeraza pentozofosforanowa).

Pod działaniem transketolazy (enzymu przenoszącego fragmenty dwywęglowe) następuje przeniesienie fragmentów dwuwęglowych z dwóch cząsteczek ksylulozo-5-fosforanu na dwie cząsteczki rybulozo-5-fosforanu z utworzeniem dwóch cząsteczek aldehydu 3-fosfoglicerynowego i dwóch cząsteczek sedoheptulozo-7-fosforanu. Pozostałe dwie cząsteczki ksylulozo-5-fosforanu nie uczestniczą w reakcji.

Nowo powstałe dwie cząsteczki aldehydu 3-fosfoglicerynowego i dwie cząstyeczki sedoheptulozo-7-fosforanu reagują ze soba pod działaniem transaldolazy, która przenosi dwa fragmenty trójwęglowe z dwóch cząsteczek sedoheptulozo-7-fosforanu na dwie cząsteczki aldehydu 3-fosfoglicerynowego; powstają dwie cząsteczki fruktozo-6-fosforanu i odłączają się dwie cząsteczki erytrozo-4-fosforanu.

Dwie pozostałe cząsteczki ksylulozo-5-fosforanu reagują z dwoma cząsteczkami erytrozo-4-fosforanu (transketolaza) z utworzeniem dwóch cząsteczek fruktozo-6-fosforanu. I dwóch cząsteczek aldehydu 3-fosfoglicerynowego.

Produkty te moga być przekształcane drogą glikolizy do pirogronianu (który drogą oksydacyjnej dekarboksylacji i w cyklu Krebsa przekształcany jest do CO2 i H2O) lub glukoneogenezy do glukozy (2 cząsteczki aldehydu 3-fosfoglicerynowego daja jedną cząsteczkę glukozy). Przekształcenie pirogronianu do CO2 i H2O sprawia, że cykl pentozofosforanowy może być drogą kompletnego utlenienia glukozy, ale bez wytworzenia ATP.

Gdy zapotrzebowanie na nukleotydy do biosyntezy DNA jest duzo większe niż zapotrzbowanie na NADPH faza oksydayjna może zostać pominięta. Glukozo-6-fosforan jest przekształcany we fruktozo-6-fosforan i aldehyd-3-fosfoglicerynowy drogą glikolizy:

Dwie cząsteczki fruktozo-6-fosforanu i jedna aldehydu-3-fosfoglicerynowego tworzą trzy cząsteczki rybozo-5-fosforanu, czemu nie towarzyszy powstanie NADPH.

* w erytrocytach szlak szlak spełnia role w zapobieganiu hemolizie poprzez dostarczanie NADPH dla utrzymania glutationu w stanie zredukowanym

Bilans:

3 cząsteczki glukozo-6-fosforanu dają początek 3 cząsteczkom CO2 i 3 resztom pięciowęglowym, z których regenerują się 2 cząsteczki glukozo-6-fosforanui; jednocześnie powstaje jedna cząsteczka pośredniego metabolitu glikolizy - glicerolo-3-fosforan (z 2 cząsteczek glicerolo-3-fosforanu może zostać odtworzony glukozo-6-fosforan);

Centrum aktywne enzymów - metody badania

(na podst. źródeł internetowych, notatek z wykładu)

W metrodach badania składu centrum aktywnego mozna wyróżnić

1. metody blokowania (np, aby dowiedzieć się, czy w centrum aktywnym biora udział grupy -SH, na enzym działa się związekiem chemicznym wiążącym grupy -SH; jesli po takim zablokowaniu tych grup spadła aktywność enzymu, grupy -SH, a więc cysteina lub metionia uczestniczą w tworzeniu centrum aktywnego)

2. metody kinetyczne (badanie wpływu pH i tempereatury; dostarczają one informacji o jonizacji aminokwasów występujących w centrum aktywnym)

- dla enzymów zawierających grupy prostetyczne (koenzymy) - analiza mapy gęstości elektronowej;

- rentgenograficzne badania oddziaływań enzymu z inhibitorami.

Doświadczenie to można przeprowadzić dzięki znacznej porowatości kryształów białka. Stosunkowo duże cząsteczki inhibitorów mogą dyfundować w kanałach między różnymi cząsteczkami białka i odnajdować drogę do specyficznych miejsc wiązania. Jeżeli struktura krystaliczna nie ulega znacznym zmianom, to gęstość elektronową odpowiadającą dodatkowej cząsteczce można wyznaczyć bezpośrednio z natężenia rozproszenia promieni rentegenowskich z uzyciem wcześniej wyznaczonych faz dla kryształu białka. (metoda różnicowa Fouriera)

- badanie kompleksu enzymu z nieaktywnym substratem, np. dla lizozymu z trimerem N-acetyloglukozoaminy

- wiązanie w miejscu aktywnym prekursora przekształcanego w substrat pod wpływem światła. Pełny obraz dyfrakcyjny kryształu zawierającego tego typu substrat uzyskujemy stosując wiżkę promieni rentgenowskich o wysokim natężeniu.

Transkrypcja informacji genetycznej

(na podst. „Krótkich wykładów”)

Transkrypcja w komórkach prokariotycznych:

Etap inicjacji

(związanie enzymu - polimerazy RNA z promotorem ulokowanym przed transkrybowanym genem z utworzeniem kompleksu inicjującego; u prokariotów występiuje tylko jeden rodzaj polimerazy RNA; w łączeniu z promotorem role odgrywa podjednostka σ enzymu; polimeraza RNA nie wymaga stratera - transkrypcję inicjuje holoenzym polimerazy złożony z podjednostek α2ββ'ωσ. Holoenzym rozpoznaje rejon promotorowy zawierający dwa elementy: sekwencję -10 (kaseta Pribnova) o sekwencji zgodnej TATAAT oraz sekwencję -35 (sekwencja zgodna TTGACA))

Etap elongacji (matryce stanowi nić antysensowna; w powstającym RNA nukleotydy zamiast tyminy zawierają uracyl

Po zakończeniu inicjacji podjednostka σ odłącza się od kompleksu inicjującego, pozostawiając rdzeń enzymu α2ββ'ω który kontynuułe syntezę RNA w kierunku 5'-> 3';

W trakcie transkrypcji helisa DNA jest lokalnie rozplatana z utworzeniem bąbla transkrypcyjnego)

Etap terminacji (napotkanie przez polimerazę RNA odpowiedniej sekwencji odpowiadającej sygnałowi terminacji;

Powszechnie występującym sygnałem terminacji jest struktura spinki do włosów, utworzona zazwyczaj przez palindromowy rejon bogaty w GC, po którym następuje odcinek bogaty w AT. Wydajna terminacja wymaga udziało białka rho (ρ), które umozliwia rozpoznanie miejsc terminacji)

Transkrypcja u eukariotów :

U eukariotów występują trzy polimerazy RNA. Każda z polimeraz przepisuje na RNA jedną nić DNA, zwana nicią antysensowną (-). O wyborze konkretnej nici decyduje orientacja promotora. Synteza RNA przebiega w kierunku 5'-> 3'i nie wymaga startera.

Etap inicjacji: dla polimerazy II sekwencją rozpoznawaną jest kaseta TATA zlokalizowana około 25 pz (par zasad) od miejsca startu transkrypcji (w stosunku do prokariotów, sekwencja promotorowa znajduje sie wiec dalej od miejsca startu). Transkrypcja jest też regulowana przez elementy kontrolujące transkrypcję położone od strony 5' kasety TATA.

Niektóre eukariotyczne geny nie posiadają kasety TATA, mają za to tzw. element inicjatorowy, o zróżnicowanym składzie, umieszczony centralnie w stosunku do miejsca startu. Jeszcze inne geny nie maja ani kasety TATA ani elementu inicjatorowego - ich poziom transkrypcji jest zwykle niski, a miejsce inicjacji nie jest precyzyjnie zdefiniowane.

Do rozpoczęcia transkrypcji polimeraza RNA II wymaga współdziałania z tzw. ogólnymi, podstawowymi czynnikami transkrypcyjnymi (TF II), tworzącymi w miejscu promotorowym kompleks, umozliwiający związanie polimerazy:

Najpierw z kaseta TATA wiąże się TF IID, którego kluczowa podjednostką jest TBP (TATA-box binding protein). Inne podjednostki zwane są czynnikami oddziałującymi z TBP.

Tak więc TBP wiąże się z TATA. Potem, przynajmniej osiem innych podjednostek przyłącza sie tworząc TF IID. Do kompleksu TF IID przyłącza sie TF IIA, stabilizując oddziaływanie TF IID z TATA.

Następnie do TF IID przyłącza się TF IIB, pełniący funkcje łącznika czynników transkrypcyjnych z polimerazą RNA; wtedy przyłącza się polimeraza RNA II, w formie wczesniej utworzonego kompleksu z TF IIF, po czym dochodzi do wiązania TF IIE, H, J. Tak powstaje kompleks inicjujący transkrypcję (minimalny, podstawowy - o małej wydajności). Dopiero związanie dodatkowych czynników z DNA i ich interakcja z podstawowym kompleksem inicjującym zwiększaja szybkość procesu.

Wiązanie polimerazy w przypadku genów nie posiadających kasety TATA wymaga dodatkowego białka (białek) umozliwiających związanie TBP z matrycą.

Etap elongacji i terminacji: Inaczej niz polimeraza prokariotyczna, polimeraza eukariotyczna kończy transkrypcję w miejscach przypadkowych, w róznej odległości za genem. Również, przeciwnie niż u prokariota, powstały pierwotny transkrypt musi ulec intensywnym procesom dojrzewania (w tym splicing, obróbka końców 3' i 5')

---