ZESTAW 42

1. Metabolizm CO2

2. Biosynteza cholesterolu - przebieg, regulacja

3. Operon laktozowy E. Coli

Metabolizm CO2

(głównie na podstawie „Biochemii Harpera”)

1. udział w liogenezie

2. udział glukoneogenezie

3. synteza mocznika

Powstanie dwutlenku węgla w organizmie jest związane pośrednio (poprzez cykl Krebsa) z procesami pozyskiwania energii. W cyklu kwasów trikarboksylowych powstają równowazniki redukcyjne, które wchodzą do łańcucha oddechowego, gdzie w procesie fosforylacji oksydacyjnej, sa wytwarzane duże ilości ATP. Jednocześnie, w cyklu powstaje CO2 (dwie cząsteczki na jeden acetylo-CoA wchodzący do cyklu).

Pierwsza czasteczka CO2 powstaje podczas przemiany izocytrynianu do α-ketoglutaranu (z udziałem dekydrogenazy izocytrynianowej), druga podczas przemiany α-ketoglutaranu do bursztynylo-CoA (z udziałem kompleksu dehydrogenazy pirogronianowej).

Dwutlenek węgla jest transportowany we krwi w postaci związanej z hemem

Dwutlenek węgla jest substratem wielu karboksylaz. Zazwyczaj z karboksylazami związana jest kowalencyjnie biotyna. Przykładem takiego enzymu jest karboksylaza acetylo-CoA, która katalizuje decydujący etap w syntezie kwasów tłuszczowych (tworzenie malonylo-CoA). Grupa karboksylowa biotyny wiąże sie kowalencyjnie z grupą ε-aminowa reszty lizyny, podobnie jak w przypadku karboksylazy pirogronianowej. Podobie, dla obu tych enzymów karboksylacja ma dwuetapowy przebieg. W pierwszym etapie, kosztem ATP powstaje karboksybiotyna. Tak aktywowana grupa CO2 ulega przeniesieniu z tego intermediatu na acetylo-CoA, tworząc malonylo-CoA.

Biotyna wiąze sie kowalencyjnie z nosnikiem karboksybiotyny, bedącym fragmentem karboksylazy acetylo-CoA. Karboksylacja biotyny zachodzi pod działaniem karboksylazy biotynowej, która wchodzi w skład jednej z podjednostek karboksylazy acetylo-CoA. Trzecim elementem układu jest transkarboksylaza, która katalizuje przeniesienie zaktywowanej grupy CO2 z karboksybiotyny na acetylo-CoA.

Znaczący jest również udział karboksylaz w procesie glukoneogenezy. Karboksylaza pirogronianowa w obecności ATP, biotyny i CO2 przekształaca pirogronian w szczawiooctan (moze słuzyc jako substrat glukoneogenezy). Natomiast karboksylaza fosfoenolopirogronianowa przekształca szczawiooctan do fosfoenolopirogronianu, czemu utowarzyszy uwolnienie CO2. Dalej, karboksylaza propionylo-CoA katalizuje wiązanie CO2 do propionylo-CoA z wytworzeniem D-metylomalonylo-CoA, który jest przekształcany kolejno w D- metylomalonylo-CoA (racemaza metylomalonylo-CoA), bursztynylo-CoA (mutaza metylomalonylo-CoA), a ten w cyklu Krebsa przekształcana jest do szczawiooctanu , przekształacanego w pirogronian - substrat glukoneogenezy.

Dwutlenek węgla, wraz z amoniakiem i asparaginianem, współtworzy mocznik w cyklu mocznikowym. Pod wpływem syntetazy karbamoilofosforanowej I (mitochondrialny enzym wątroby) dochodzi do kondensacji CO2, amoniaku i asparaginianu z utworzeniem karbamoilofosforanu. Syntetaza karbamoilofosforanowa II jest enzymem cytozolowym i zamiast amoniaku preferuje glutaminę, jako źródło azotu i odgrywa rolę w syntezie pirymidyn.

Biosynteza cholesterolu - przebieg, regulacja

(przebieg -na podst. „Biochemii Harpera”, regulacja - głównie Stryer)

Przebieg - schemat podany w rozdziale 28 „Biochemii Harpera”

Źródłem wszystkich atomów węgla cholesterolu jest acetylo-CoA. Biosyntezę można podzielić na etapy:

1. synteza mewalonianu (C6) z trzech cząsteczek acetylo-CoA

2. utorzenie jednostek izoprenoidowych (C5) przez dekarboksylację mewalonianu

3. utworzenie skwalenu (C30) przez kondensację 6 jednostek izoprenoidowych

4. cyklizacja skwalenu do lanosterolu (C30) - zawierającego szkielet steroidowy

5. powstanie cholesterolu (C27) w kolejnych reakcjach

Regulacja:

Głównym miejscem regulacji biosyntezy cholesterolu jest aktywność reduktazy HMG-CoA (reduktaza 3-hydroksy-3-metyloglutarylo-CoA), a więc etap powstania mewalonianu:

Na aktywnośc reduktazy wpływ ma wiele różnorodnych czynników:

- na poziomie transkrypcji (szybkość powstawania reduktazy mRNA, czyli represja transkrypcji genu reduktazy HMG-CoA) - kontrolowana przez element regulatorowy wrażliwy na sterol (SRE). Stanowi on krótką sekwencję DNA na 5' końcu genu. W obecności steroli, SRE znacznie hamuje wytwarzanie mRNA;

- na poziomie translacji (szybkość tranlacji reduktazy mRNA) - hamowana przez niesterolowe metabolity pochodzące z mewalonianu;

- na poziomie samego enzymu (rozpad reduktazy) - enzym ma dwie części : katalityczną domenę cytozolową i domenę błonową działającą jak czujnik pochodnych cholesterolu i mewalonianu. Duże stężenie tych produktów powoduje gwałtowny rozpad reduktazy;

(modyfikacje kowalencyjne) - fosforylacja zmniejsza aktywność reduktazy; enzym może być „wyłączany” przez kinazę białkową aktywowaną przez AMP; tak więc synteza cholesterolu zanika, kiedy stężenie ATP jest małe. Analogiczna regulacja ma miejsce w przypadku karboksylazy acetylo-CoA, kluczowej w syntezie kwasów tłuszczowych (!)

Należy pamietać, że poprzez powyższe mechanizmy moga działać hormony (insulina i hormony tarczycy powoduja wzrost aktywności reduktazy HMG-CoA, a glukagon i glikokortykosteroidy - zmniejszenie). Także fosforylacja/defosforylacja moga zachodzic zależnie od cAMP, którego stężenie również może mieć związek z oddziaływaniem hormonu na receptor.

Ponadto na syntezę ma wpływ ilość dostarczanego w diecie cholesterolu , ale także występuje mechanizm zwrotnej regulacji, w którym reduktaza HMG-CoA jest hamowana przez mewalonian, czyli pośredni produkt, i cholesterol, czyli produkt końcowy (znowu zwracam uwagę na wyżej podane mechanizmy).

Synteza jest również hamowana przez cholesterol zawarty w LDL (ma to związek z ilością receptorów dla LDL)

Operon laktozowy E. Coli

(na podst. „Krótkich wykładów”, „Biochemii” Bańkowskiego)

Ogólnie:

Geny komórki prokariotycznej dzielą sie na strukturalne, operatorowe i regulatorowe. Jeden gen strukturalny koduje syntezę jednego łańcucha polipeptydowego. Białka o strukturze podjednostkowej mogą (choć nie muszą) być kodowane przez dwa lub więcej genów strukturalnych. Geny kodujace biosyntezę białek enzymatycznych, uczestniczących w jednym procesie, np. rozkład laktozy, są zlokazlizowane obok siebie, a ich czynność jest koordynowana przez leżący w sąsiedztwie gen operatorowy. Gen operatorowy i kodowane przez niego geny strukturalne noszą nazwę operonu. Uczynnienie genu operatorowego pobudza funkcje genów strukturalnych. Zjawisko to nosi nazwę indukcji, a unieczynnienie genu operatorowego unieczynnia wszystkie geny strukturalne danego operonu. Jest to zjawisko represji. Indukcję i represję reguluje gen regulatorowy poprzez kodowane przez siebie białko zwane represorem, rozpoznające sekwencję operatorową. Związanie lub odłączenie represora przez gen operatorowy wywołuje represję lub derepresję (indukcję).

Operon laktozowy (lac) koduje trzy enzymy:

-permeazę galaktozydową (parmeazęlaktozową), odpowiedzialną za transport laktozy przez błonę komórkową

- β-galaktozydazę, która hydrolizuje laktaozę do galaktozy i glukozy

- transacetylazę tiogalaktozydową o niejasnej funkcji

Są to enzymu indukowane (ich ilość wzrasta, gdy w środowisku pojawia się laktoza), a proces nosi nazwę indukcji.

Transkrypcję wszystkich trzech genów uruchamia allolaktoza (induktor). Pojawia się ona z przekształcenia laktozy przez β-galaktozydazę, działającą jeszcze przed indukcją operonu lac.

Innym induktorem jest izopropylotiogalaktozyd (IPTG). W przeciwieństwie do allolaktozy, nie jest metabolizowany przez E. Coli, więc znalazł zastosowanie w badaniach eksperymentalnych.

W operonie lac genami struktury są geny lacZ, lacY i lacA, kodujące odpowiednio β-galaktozydazę, permeazę, transacetylazę. Transkrypcja operonu lac prowadzio do powstania jednego, policistronowego mRNA, który ulega translacji, produkując wszystkie trzy enzymy. Policistronowy mRNA gwarantuje, że ekspresja wszystkich trzech enzymów odbywa się w sposób skoordynowany.

Transkrypcja operonu lac odbywa się z pojedynczego promotora (Plac), który położony jest powyżej genów struktury i do którego przyłącza się polimeraza RNA. Pomiędzy nim i genami struktury znajduje się sekwencja operatora (Olac), a przed promotorem znajduje się gen represora lac (lacI)

PlacI

lacI

Plac

Olac

lacZ

lacY

lacA

(polecam schematy zamieszczone na str 198-199 w „Krótkich wykładach”)

Represor lac:

Polimeraza RNA wiąże się z promotorem genu lacI (gen represora), a więc w miejscu PlacI i powoduje syntezę mRNA. W translacji powstąją monomery represora. Dopiero połączone w tetramer są aktywne - moga mocno związać się z miejscem operatorowym Olac.

Operon Olac ma sekwencje palindromową - ta sama sekwencja niezależnie, czy jest czytna od końca 3' czy 5'. Ta symetria odpowiada symetrii represora w postaci tetrameru.

Przy braku induktora, gen lacI ulega represji (powstający represor lac wiąże się z Olac i blokuje transkrypcję genów lacZ, lacY, lacA). Gdy induktor jest obecny, wiąże się on z represorem (z tertramerem). Powoduje to konformacyjna zmianę represora, która w znacznym stopniu zmniejsza jego powinowadztwo do miejsca operatorowego Olac. Zmieniony represor oddysocjowuje od Olac i pozwala polimerazie RNArozpocząć transkrypcję genów lacZ, lacY i lacA.

Jeżeli induktor zostanie usunięty, represor lac szybko wiąże się ponownie z operatorem i transkrypcja zostaje natychmiast zachamowana.

CRP/CAP

Do uzyskania wysokiego poziomu transkrypcji operonu lac potrzebne jest białko aktywujące geny kataboliczne - CAP (syn. Receptor cAMP, CRP). Jest ono aktywatorem. W aktywnej formie aktywator jest dimerem złożonym z dwóch cząsteczek CRP. Dimer ten wiąże 3'5'cAMP, tworząc kompleks CRP-cAMP, który wiąże się z promotorem lac i ułatwia przyłączenie polimerazy RNA, stymujując transkrypcję operonu lac.

Działanie CRP zależy od źródła węgla. W obecności glukozy poziom cAMP spada i CRP nie może wiązać się z promotorem i operon lac jest transkrybowany słabo. Odwrotnie, gdy spada ilość glukozy.

---