Dolina Rospudy to jeden z najcenniejszych obszarów torfowiskowych w Polsce, tworzony przede wszystkim jednak przez przepływowe torfowiska przejściowe o naturalnych, nie zaburzonych przez człowieka, stosunkach wodnych. Torfowisko to utrzymuje stały wysoki poziom wody, dzięki czemu nie zarasta drzewami i krzewami. Różni się tym od zbliżonych obszarów bagiennych naruszonych ingerencją człowieka, które dla utrzymania roślinności nieleśnej wymagają powtarzanych zabiegów ochrony czynnej, np. regularnego koszenia. Strefę otwartych torfowisk okalają bagienne lasy i zarośla sosnowo-brzozowo. Dalej, przy granicy z mineralnymi zboczami doliny, występują borealne świerczyny na torfie oraz modelowo wykształcone i bardzo dobrze zachowane olszy. Niewielkie płaty innych zbiorowisk roślinnych rozrzucone są w różnych częściach doliny.
Dolina Rospudy jest objęta ochroną ze względu na występowanie rzadkich gatunków roślin i zwierząt. Rośnie tam m.in. 19 przedstawicieli rodziny storczykowatych, podlegającej ścisłej ochronie prawnej, w tym jedyne w Polsce stanowisko miodokwiatu krzyżowego, rośliny wpisanej do Polskiej Czerwonej Księgi Roślin oraz jedno z kilku stanowisk podgatunku storczyka krwistego o żółtych kwiatach. Ponadto na terenie doliny występują inne storczyki, a także inne rzadkie rośliny chronione.
Fauna bezkręgowców Doliny Rospudy obfituje w gatunki rzadkie, zagrożone i objęte ochroną prawną. Do gatunków objętych ścisłą ochroną należy motyl dostojka akwilonaris, występujący on wyłącznie na torfowiskach, ponieważ rośliną żywicielską jego larw jest żurawina błotna.
Również wśród kręgowców zmiennocieplnych stwierdzono tu gatunki o wysokim statusie ochronnym. Ryby reprezentowane są przez różankę i piskorza, zaś płazy - przez traszkę grzebieniastą i żabę jeziorkową. Wszystkie te gatunki objęte są ochroną ścisłą, zaś pierwsze trzy z nich umieszczono w Załączniku II Dyrektywy Siedliskowej i Polskiej Czerwonej Księdze.
W Dolinie Rospudy i przylegających do niej lasach gniazdują liczne chronione gatunki ptaków, objęte Załącznikiem I Dyrektywy Ptasiej. Obszar ten jest również żerowiskiem dla ptaków gniazdujących na pobliskich terenach, w tym w Puszczy Augustowskiej.
Dla dużych ssaków, takich jak np. wilki i jelenie, Dolina Rospudy stanowi korytarz migracyjny - tędy przemieszczają się one z Puszczy Augustowskiej i Biebrzańskiego Parku Narodowego na zachód. Ponadto żyją tu m.in. bobry, wydry, oraz co najmniej trzy gatunki nietoperzy: nocek rudy, karlik malutki i umieszczony w Załączniku II Dyrektywy Siedliskowej nocek łydkowłosy.