BADANIE WŁAŚCIWOŚCI BIOCHEMICZNYCH DROBNOUSTROJÓW
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Sprawdzanie właściwości biochemicznych drobnoustrojów jest jednym z etapów diagnostyki mikrobiologicznej. Badanie to przeprowadza się na specjalnych podłożach diagnostycznych lub podłożach wybiórczo-diagnostycznych, zawierających, oprócz substancji odżywczych, również związki chemiczne hamujące wzrost innych drobnoustrojów. W badaniach tych wykorzystuje się najczęściej reakcje kataboliczne, tj. zdolność do rozkładu substratów za pomocą enzymów komórkowych. Produkty tych reakcji wykrywa się w hodowlach za pomocą wskaźników, odczynników lub specjalnych testów; rzadziej badanie ma na celu określenie szlaku metabolicznego, w którym dany substrat jest zużywany. W badaniach tych posłużyć się można klasycznymi już pożywkami i technikami lub nowoczesnymi zestawami (mikrometodami, szybkimi metodami) do identyfikacji drobnoustrojów (np. probówki „Enterotube", mikrotesty API).[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
] [Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Metody klasyczne, jakkolwiek pracochłonne i czasochłonne, mogą być stosowane w każdym laboratorium mikrobiologicznym o standardowym wyposażeniu. Szybkie standaryzowane testy są jak do tej pory drogie i nie mogą być powszechnie (przynajmniej w Polsce) stosowane z uwagi na ograniczenia finansowe w służbie zdrowia i laboratoriach badania żywności.[Author ID0: at Thu Nov 30 00:00:00 1899
]
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
] [Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Drobnoustroje przejawiają wiele właściwości biochemicznych determinowanych różnorodnością wytwarzanych przez nie enzymów. Różnice w tych właściwościach znalazły praktyczne zastosowanie do odróżniania rodzajów, gatunków i - rzadziej - szczepów w obrębie gatunku drobnoustrojów. W diagnostyce mikrobiologicznej bada się następujące właściwości biochemiczne: glikolityczne (sacharolityczne; rozkład węglowodanów), proteolityczne (rozkład białek, peptydów oraz aminokwasów), lipolityczne (rozkład lipidów i kwasów tłuszczowych), utleniająco-redukcyjne oraz inne, nie mieszczące się w tym podziale.[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
] [Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Wymienione właściwości biochemiczne sprawdza się łącznie, posługując się tzw. szeregami biochemicznymi (rzędy biochemiczne). Są to zestawy podłoży, na które posiewa się badane drobnoustroje, a po okresie inkubacji wykonuje się próby identyfikacyjne polegające na wykrywaniu produktów reakcji chemicznych katalizowanych przez enzymy drobnoustrojów, określeniu zmian pH środowiska wzrostu hodowli za pomocą indykatorów (wskaźników), ewentualnie badanie sposobu wykorzystania związków chemicznych będących dla bakterii źródłami węgla, energii lub azotu.
1. Właściwości glikolityczne
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Rozkład cukrów prostych i złożonych w warunkach tlenowych i beztlenowych dostarcza drobnoustrojom energii. W badaniach tych stosujemy węglowodany i ich pochodne oraz alkohole wielowodorotlenowe. Są to najczęściej pentozy (arabinoza, ksyloza, ramnoza), heksozy (glukoza, fruktoza, galaktoza, mannoza), disacharydy (sacharoza, maltoza, laktoza, trehaloza), trisacharydy (np. rafinoza), polisacharydy (skrobia, glikogen, celuloza, inulina), glikozydy (salicyna, eskulina) i alkohole wielowodorotlenowe (glicerol, mannitol, adonitol, sorbitol, inozytol, dulcytol).
1.1. Szereg cukrowy
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Badanie zdolności drobnoustrojów do rozkładania węglowodanów najczęściej wykonujemy na tzw. szeregach cukrowych „małych", zawierających kilka cukrów, lub „dużych", obejmujących większość tych związków stosowanych w praktyce. „Mały szereg cukrowy" składa się, z następujących węglowodanów: glukozy, laktozy, sacharozy, maltozy i mannitolu, które w stężeniu 1% dodaje się do podłoża tzw. wody peptonowej zawierającej wskaźnik (indykator) Andrade (fuksyna kwaśna) lub błękit bromotymolowy.[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
] [Author ID1: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Do probówek z podłożem i cukrami wkłada się dnem do góry małe probóweczki, tzw. rurki Durhama, które służą do wykrywania gazu wydzielanego w trakcie wzrostu i rozkładu substratów węglowodanowych (gaz zbiera się w rurce i jest widoczny w postaci pęcherzyka). Powstałe podczas rozkładu cukrów kwasy organiczne zmieniają pH środowiska, co przejawia się zmianą barwy indykatora ze słomkowej na różową, w przypadku wskaźnika Andrade oraz z niebieskiej na żółtą w obecności błękitu bromotymolowego.[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
] [Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Dla poprawienia warunków wzrostu drobnoustrojów słabo rosnących na wodzie peptonowej wzbogaca się ją, dodając 5% zinaktywowanej przez ogrzanie surowicy końskiej (podłoże Robesona dla maczugowców).
1.2. Rozkład cukrów na podłożu VL
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Podłoże to stosujemy do badania rozkładu węglowodanów przez beztlenowce. Zawiera ono wyciąg mięsny, ekstrakt drożdżowy, pepton, badany cukier oraz, dla obniżenia potencjału oksydo-redukcyjnego, chlorowodorek cysteiny. Po inkubacji do hodowli dodaje się wskaźnika (roztwór błękitu bromotymolowego lub purpury bromokrezolowej) - pojawienie się żółtego zabarwienia świadczy o zakwaszeniu środowiska w następstwie rozkładu badanego cukru.
1.3. Badanie rozkładu cukrów na podłożach stałych
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Jako przykłady (takich prób) zostaną omówione: rozkład laktozy na podłożu Endo, wykorzystywanie mannitolu na podłożu Chapmana oraz rozkład skrobi na płytce skrobiowej.[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
] [Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Płytka Endo stosowana jako podłoże różnicujące dla bakterii z grupy coli w badaniach bakteriologicznych próbek wody lub ścieków oraz produktów spożywczych zawiera m. in. laktozę, siarczyn sodowy oraz fuksynę zasadową. W czasie przygotowania podłoża fuksyna zasadowa zostaje zredukowana siarczynem sodowym i przechodzi w bezbarwną leukozasadę. Drobnoustroje zdolne do rozkładu laktozy - E. coli - wyrastają na tym podłożu w postaci okrągłych, gładkich kolonii z metalicznym połyskiem o charakterystycznym ciemno-czerwonym zabarwieniu. Jak wykazano, pałeczki E. coli rozkładają laktozę z wytworzeniem aldehydu octowego, który z obecną w podłożu leukozasadą tworzy barwny kompleks.[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
] [Author ID1: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Płytka Chapmana służy do identyfikacji ziarenkowców Gram-dodatnich z rodzaju Staphylococcus. Zawiera ona m. in. mannitol, czerwień fenolową oraz NaCl (8% - dla zahamowania wzrostu bakterii innych niż gronkowce, które są zdolne do wzrostu w tych warunkach). S. aureus w warunkach tlenowych i względnie beztlenowych wyrasta w postaci kolonii otoczonych żółtą strefą. Zmiana barwy podłoża z różowej na żółtą jest wynikiem rozkładu mannitolu i zakwaszenia środowiska. Podobnie zachowują się niektóre szczepy S. saprophyticus, wykazujące te właściwości w warunkach tlenowych. S. epidermidis nie rozkłada mannitolu i rośnie w postaci białych kolonii nie powodując zmiany barwy podłoża.[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
] [Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Zdolność bakterii do wykorzystania skrobi sprawdzamy na płytce agarowej (posiew pasmowy), zawierającej ten składnik. Drobnoustroje wytwarzające enzymy amylolityczne degradują skrobię do dekstryn (erytro-, achro- i maltodekstryn), maltozy i glukozy, których obecność w środowisku sprawdzamy-w reakcji z płynem Lugola (roztwór jodu w jodku potasu). Skrobia składa się z amylozy i amylopektyny, które reagują z jodem odpowiednio - na kolor niebieski i fioletowoczerwony. Barwienie skrobi jodem ma charakter fizyczny - cząsteczki jodu „układają" się w heliksie tego cukru; jedna cząsteczka jodu przypada na sześć cząsteczek glukozy. Degradacja enzymatyczna skrobi przez bakterie powoduje rozkręcania się heliksu i zanik zabarwienia z płynem Lugola (od barwy granatowej do żółtej).
1.4. Technika auksanograficzna
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Stanowi uproszczoną metodę badania zdolności drobnoustrojów do rozkładu cukrowców. W metodzie tej badany drobnoustrój posiewamy na płytkę agarową, zawierającą substancje odżywcze i indykator pH, nie zawierającą zaś cukru. Na powierzchni podłoża układamy krążki bibułowe nasycone badanymi cukrami. Zmiana barwy pożywki (po inkubacji z bakteriami) wokół krążka, spowodowana zakwaszeniem środowiska, świadczy o wykorzystaniu badanego cukru.
1.5. Próba na podłożu Hugh-Leifsona (H-L)
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Podłoże H-L wykorzystuje się do sprawdzenia sposobu rozkładu cukrów przez drobnoustroje. W celu wykazania czy dany cukier jest wykorzystywany na drodze fermentacji lub utleniania, badany szczep posiewa się na dwie probówki z podłożem H-L i jedną z nich zakrywa się parafiną płynną. Bakterie niezdolne do rozkładu cukru nie zmieniają barwy podłoża, wykorzystujące go jedynie w warunkach tlenowych zmieniają barwę podłoża w probówce bez parafiny, a fermentujące cukier spowodują zmianę zabarwienia pożywki w obu probówkach. Podłoże Hugh-Leifsona zawiera błękit bromotymolowy, który w niskim poziomie pH, powstałym na skutek wytworzenia kwaśnych produktów rozkładu cukru, zmienia barwę podłoża z zielonej na żółtą.
1.6. Wzrost bakterii na podłożu Kliglera
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Podłoże Kliglera zawiera pepton, laktozę, glukozę, siarczan żelazawy oraz wskaźnik - czerwień fenolową. Podłoże to służy do badania zdolności fermentowania laktozy lub glukozy, z wytwarzaniem lub nie, gazu oraz wydzielania siarkowodoru. Podłoże to jest uformowane tak, że dolna jego część stanowi słupek, górna zaś skos. Obydwie części posiewa się, a po 24 godzinach inkubacji obserwować można następujące zmiany:
zażółcenie całego podłoża - rozkład glukozy i laktozy,
nie zmieniona barwa podłoża - brak rozkładu cukrów,
czerwony skos, żółty słupek wskazuje na rozkład glukozy, brak zaś fermentacji laktozy,
wytwarzanie H2S - zaczernienie podłoża,
gazowanie - porozrywanie podłoża przez pęcherzyki gazu.
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Drobnoustroje wykorzystujące glukozę zakwaszają podłoże w pierwszych godzinach hodowli. Jeżeli mogą fermentować laktozę, wykorzystują ją w drugiej kolejności - podłoże przyjmuje barwę żółtą. Jeśli bakterie nie mogą korzystać z laktozy, rozkładają aminokwasy zawarte w peptonie, alkalizując środowisko - barwa czerwona. Powstały w hodowli siarkowodór reaguje z jonami Fe2+ dając siarczek żelaza, który zaczernia podłoże.
1.7. Próba Voges-Proskauera (VP) i Metyl Red (MR)
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Stosowane są do identyfikacji drobnoustrojów z rodziny Enterobacteriaceae, które prowadzą rozkład glukozy z wytwarzaniem wielu produktów pośrednich i końcowych: kwasów organicznych (mrówkowy, octowy, mlekowy, bursztynowy), alkoholu etylowego, gazów (C02 i H2), a także acetoiny (produkt kondensacji dwóch cząsteczek kwasu pirogronowego) oraz 2,3 butandiolu (produkt powstały po redukcji acetony. Są one wytwarzane w różnych zestawieniach jakościowych i stosunkach ilościowych, co jest uzależnione od gatunku bakterii. Z tego punktu widzenia wyróżniamy dwa typy fermentacji, jeden - charakterystyczny m. in. dla E. coli, w którym głównymi produktami są kwasy organiczne, a 2,3 butandiol powstaje w niewielkiej ilości, oraz drugi - przejawiany przez m. in. Enterobacter sp., w którym w produktach końcowych przeważa 2,3 butandiol, zaś kwasy organiczne wytwarzane są w ilościach śladowych. Wysokie stężenie kwasów organicznych odpowiedzialne jest za wynik dodatni w odczynie z czerwienią metylową - MR, obecność zaś acetoiny (prekursora 2,3 butandiolu) decyduje o dodatniej próbie V-P.[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
] [Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Próby MR i V-P wykonujemy na podłożu Clarka, zawierającym glukozę i pepton. Do 72 - godzinnych hodowli badanego drobnoustroju dodajemy roztworu czerwieni metylowej. Czerwone zabarwienie, świadczy o dodatniej próbie MR. Do próby V-P używa się 48-godzinnej hodowli badanego szczepu, do której dodaje się alkoholowego roztworu α-naftolu, stężonego roztworu wodorotlenku potasu oraz roztworu kreatyny. Czerwone zabarwienie górnej części hodowli świadczy o obecności acetoiny, która w środowisku alkalicznym, w obecności kreatyny, przy dostępie tlenu, utlenia się do diacetylu. Ten ostatni związek, w obecności α-naftolu, reaguje" z guaniną zawartą w peptonie, dając czerwone zabarwienie świadczące o dodatniej próbie V-P.
2. Właściwości proteolityczne[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID1: at Sat Oct 20 21:21:00 2012 ]2.1. Hydroliza kazeiny
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Kazeina - białko znajdujące się w mleku może - podlegać procesowi peptonizacji, tj. upłynniania w wyniku działania enzymów proteolitycznych bakterii. Zdolność drobnoustrojów do hydrolizy kazeiny sprawdzamy na płytce agarowej zawierającej 10% odtłuszczonego mleka. Po inkubacji płytki z bakteriami (37°C, 48 godzin) można zaobserwować przejaśnienia wokół kolonii świadczące o peptonizacji tego białka (wynik dodatni).
2.2. Upłynnianie żelatyny
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Bakterie wytwarzające enzym - żelatynazę - hydrolizują żelatynę z wytworzeniem rozpuszczalnych w wodzie peptydów. Upłynniona żelatyna nie krzepnie w temperaturze pokojowej. Badanie zdolności bakterii do wzrostu i rozrzedzania żelatyny wykonujemy posiewając je na słupek żelatynowy (posiew „kłuty") i inkubując w temperaturze pokojowej lub, jeżeli bakterie nie rosną w tych warunkach, to w temperaturze 37°C przez trzy dni. W przypadku bakterii nie wykazujących zdolności do hydrolizy żelatyny sprawdzamy typ ich wzrostu na słupku. Typy wzrostu hodowli kłutych w żelatynie oraz typy jej rozrzedzenia ilustruje rys.1. W celu sprawdzenia, czy upłynnienie żelatyny w temperaturze 37°C nastąpiło w wyniku działania enzymu, czy też w następstwie inkubacji w wysokiej temperaturze, probówki z podłożem schładzamy w zimnej wodzie lub w lodówce. W przypadku enzymatycznego rozkładu żelatyny podłoże po schłodzeniu nie zakrzepnie.
Rys.1 Hodowle na słupku z żelatyną
Typy wzrostu:
1 - nitkowaty,
2 - oddzielne skupiska,
3 - rozgałęziony,
4 - drzewiasty
Typy rozrzedzenia:
5 - nieckowaty,
6 - miseczkowaty,
7 - lejkowaty,
8 - workowaty,
9 - warstwowy
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Wytwarzanie żelatynazy przez bakterie można też sprawdzić posługując się hodowlą bakterii na płytce agarowej z 2% dodatkiem żelatyny. Po 24-godzinnej inkubacji podłoże z bakteriami zalewamy nasyconym roztworem siarczanu amonu lub chlorku rtęciowego w HCl (odczynnik Fraziera). Wokół kolonii bakterii rozkładających żelatynę wystąpi strefa przejaśnienia, gdyż upłynnione białko nie ulegnie wytrąceniu pod wpływem wymienionych soli.
2.3. Badanie wytwarzania amoniaku
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]NH3 powstaje w trakcie procesów deaminacji aminokwasów. Wykrywamy go w hodowli bulionowej bakterii, umieszczając pod korkiem probówki z podłożem papierek lakmusowy. Zmiana jego barwy z różowej na niebieską, spowodowana alkalizacją środowiska w obecności NH3, świadczy o wyniku dodatnim.
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Próba ilościowa opiera się na reakcji powstałego w środowisku wzrostu bakterii NH3 z odczynnikiem Nesslera (odczynnik jodowo-rtęciowy), który w środowisku alkalicznym reaguje z NH3, z wytworzeniem barwnego kompleksu (jodek amidoksyrtęciowy).
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Ilość amoniaku można określić na podstawie intensywności powstałego zabarwienia. Barwa jasnożółta świadczy o małej ilości amoniaku. Zabarwienie brązowe o znacznej ilości, wypadnięcie brązowego osadu przemawia za bardzo dużą ilością NH3 w hodowli. W pełni ilościowe oznaczenie polega na pomiarze absorbancji próby badanej wobec roztworu wzorcowego (NH4C1 lub (NH4)2S04) przy długości fali 430 nm.
2.4. Wytwarzanie siarkowodoru
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]H2S powstaje w wyniku rozkładu aminokwasów siarkowych (cystyny, cysteiny i metioniny). Enzym, który warunkuje ten proces - sulfhydraza - hydrolizuje wiązanie chemiczne pomiędzy grupą sulfhydrylową (SH) a resztą aminokwasu. Uwolniona grupa SH zostaje zredukowana do H2S w środowisku wzrostu bakterii.[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
] [Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Wytwarzanie siarkowodoru przez bakterie badamy na bulionie lub wodzie peptonowej oraz podłożach syntetycznych zawierających ww. aminokwasy. Obecność H2S w środowisku wzrostu bakterii sprawdzamy umieszczając w probówce (pod korkiem) z hodowlą pasek bibuły nasycony octanem ołowiu. Wydzielany H2S reaguje z tym związkiem chemicznym z wytworzeniem siarczku ołowiu, który zaczernia pasek bibuły
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Próbę można też wykonać posiewając bakterie na podłoże odżywcze, zawierające 2% octanu ołowiu i zestalone agarem. O wyniku dodatnim (wydzielanie H2S) świadczy wzrost bakterii w postaci czarnych kolonii. W badaniach rutynowych stosuje się podłoże SS oraz Kliglera
2.5. Rozkład tryptofanu (próba na indol)
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Bakterie syntetyzujące enzym tryptofanazę rozkładają tryptofan z wytworzeniem indolu. Obecność indolu sprawdzamy w hodowlach bakterii na podłożu z DL-tryptofanem, posługując się metodą Ehrlicha lub Kovacsa.[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
] [Author ID1: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]W metodzie Ehrlicha do hodowli szczepu dodaje się eteru etylowego i wytrząsa. Obecny w hodowli indol zostaje wyekstrahowany przez eter, który tworzy warstwę na powierzchni hodowli. Po dodaniu pod warstwę eterową, za pomocą pipety pasterowskiej, odczynnika Ehrlicha (p-dimety-loaminobenzaldehyd w roztworze alkoholu etylowego i stężonego HC1) powstaje intensywnie czerwony pierścień (na granicy warstwy eterowej i hodowli).[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012 ]W metodzie Kovacsa hodowlę bakterii na podłożu z tryptofanem nawarstwiamy odczynnikiem Kovacsa (p-dimetyloaminobenzaldehyd w alkoholu amylowym lub izoamylowym i stężonym HCl). Pojawienie się w ciągu kilku minut ciemnowiśniowego pierścienia świadczy o obecności indolu w hodowli bakterii.
2.6. Deaminacja fenyloalaniny
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Niektóre bakterie (np. Proteus) przejawiają zdolność do deaminacji fenyloalaniny w obecności tlenu, z wytworzeniem kwasu fenylopirogronowego. Jego powstawanie sprawdzamy przez nakroplenie 10% roztworu chlorku żelazowego na powierzchnię hodowli bakterii, na podłożu z D-α-fenyloalaniną. Za wynik dodatni przyjmujemy pojawienie się zielonego zabarwienia.
2.7. Dekarboksylacja aminokwasów
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Zdolność bakterii do dekarboksylacji aminokwasów w warunkach beztlenowych, z wytworzeniem amin biogennych, bada się na podłożu Falkowa, zawierającym substrat (lizyna, ornityna, arginina), glukozę oraz purpurę bromokrezolową. Badany szczep bakterii posiewamy na probówkę z podłożem oraz kontrolną, nie zawierającą aminokwasu (obie pokryte warstwą oleju parafinowego). Po inkubacji ocenia się wzrost i zmianę barwy podłoża w obu probówkach. Wystąpienie fioletowej barwy podłoża z aminokwasem i żółtej w probówce kontrolnej świadczy o wyniku dodatnim. W przypadku reakcji ujemnej obydwie probówki pozostają żółte. Podczas hodowli drobnoustroje wykorzystują najpierw glukozę - bardziej przyswajalne źródło węgla i energii, a po jej zużytkowaniu, jeżeli wytwarzają odpowiednią dekarboksylazę, rozkładają badany aminokwas. Wykorzystanie glukozy prowadzi do zakwaszenia hodowli, co objawia się zmianą jej barwy z fioletowej na żółtą, zaś wtórna alkalizacja środowiska wzrostu w wyniku dekarboksylacji aminokwasu „przywraca" pożywce barwę wyjściową.
2.8. Hydroliza mocznika
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Mocznik jest rozkładany przez bakterie syntetyzujące ureazę. Produktami końcowymi tego rozkładu są NH3 i C02. Właściwości te u bakterii badamy na podłożu Christensena, zawierającym mocznik jako jedyne źródło azotu oraz indykator - czerwień krezolową; barwa wyjściowa podłoża - jasnożółta. Amoniak uwalniany podczas wzrostu bakterii silnie alkalizuje pożywkę, powodując zmianę jej barwy na fioletową.
3. Właściwości lipolityczne
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Pod tym pojęciem rozumiemy zdolność drobnoustrojów do rozkładania lipidów do kwasów tłuszczowych i glicerolu lub innych alkoholi wielowodorotlenowych, przy udziale enzymów hydrolitycznych - lipaz. W badaniach praktycznych koncentrujemy się na stwierdzeniu w hodowlach obecności kwasów tłuszczowych.
3.1. Podłoże z margaryną
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Płytkę agarową z dodatkiem margaryny posiewamy pasmowo i inkubujemy przez cztery dni w cieplarce. Po tym okresie podłoże zalewamy 20% roztworem siarczanu miedzi. O wyniku dodatnim świadczy zielone zabarwienie wokół i pod rysą wzrostu. Barwa ta pojawia się na skutek powstawania kompleksu miedzi z uwolnionymi z tłuszczu kwasami tłuszczowymi.
3.2. Podłoże z dodatkiem Tween 80
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Podłoże z dodatkiem Tween 80 pozwala pośrednio stwierdzić właściwości lipolityczne bakterii. Bakterie posiewa się na podłoże, agarowe zawierające Tween 80 (polietylenosorbitan-jednooleinowy) oraz chlorek wapniowy. Drobnoustroje wytwarzające lipazy (esterazy - enzymy szeroko swoiste pod względem substratowym) uwalniają z cząsteczki Tweenu 80 związany estrowo kwas oleinowy, który z jonami wapnia tworzy nierozpuszczalną sól - „mydło wapniowe". Płytki z bakteriami inkubujemy cztery doby; wokół kolonii bakterii lipolitycznych obserwuje się zmętnienie.
4. Właściwości utleniająco-redukcyjne
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Drobnoustroje najczęściej utleniają związki organiczne przez ich odwodorowanie. Utlenienie jednego substratu pociąga za sobą redukcję drugiego związku chemicznego, gdyż oba procesy są ze sobą sprzężone i określane jako reakcje red-oks. Procesy te leżą u podstaw oddychania biologicznego wszystkich organizmów, a głównymi substratami oddechowymi, tj. donatorami elektronów i protonów są przede wszystkim cukry złożone i proste, kwasy organiczne i kwasy tłuszczowe. Akceptorami pośrednimi elektronów i protonów są dwunukleotyd nikotynamidoadeninowy (NAD+), jego ufosforylowana pochodna (NADP+) lub dwunukleotyd flawinoadeninowy (FAD+), zaś końcowymi tlen (oddychanie tlenowe), związek nieorganiczny (oddychanie beztlenowe) lub związek organiczny (fermentacja).[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
] [Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Wyróżniamy trzy grupy enzymów, odpowiedzialnych za procesy red-oks - dehydrogenazy odrywające elektrony i protony od substratu, oksydazy przenoszące elektrony na tlen oraz reduktazy przekazujące elektrony z łańcucha oddechowego na związki nieorganiczne, np. azotany lub siarczany.[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
] [Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Wykrywanie enzymów odpowiedzialnych za reakcje red-oks u drobnoustrojów wchodzi również w skład diagnostyki mikrobiologicznej.
4.1. Oksydaza cytochromowa
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Oksydaza cytochromowa jest enzymem końcowym układu oddechowego bakterii tlenowych i przenosi elektrony na tlen atmosferyczny z wytworzeniem H20. Jej obecność u bakterii wykrywamy za pomocą odczynnika „NADI" (chlorowodorek dimetylo-p-fenylodiaminy i α-naftolu). Powstanie niebieskiego zabarwienia świadczy o próbie dodatniej.
4.2. Katalaza
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Przeniesienie dwóch elektronów na tlen prowadzi do powstania trującego dla bakterii nadtlenku wodoru - H202. Jego rozkład do wody i tlenu warunkuje m. in. katalaza - enzym występujący u większości drobnoustrojów tlenowych i względnie beztlenowych. Nie wytwarzają go paciorkowce i bakterie bezwzględnie beztlenowe. Katalazę wykrywamy, nanosząc na 24-godzinną hodowlę bakterii na skosie agarowym 3% roztwór wody utlenionej. Pojawiające się na powierzchni podłoża pęcherzyki gazu (tlen) świadczą o wyniku dodatnim.
4.3. Peroksydaza
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Peroksydaza jest enzymem, który - podobnie jak katalaza - rozkłada H202, ale z równoczesnym utlenieniem innego substratu. Wykrywamy ją przez naniesienie na podłoże stałe z hodowlą bakterii roztworu pirokatechiny oraz roztworu perhydrolu. Kolonie bakterii wytwarzających peroksydazę zabarwiają się na kolor czerwonobrunatny, tj. barwę utlenionej formy pirokatechiny - donatora protonów.[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID1: at Sat Oct 20 21:21:00 2012 ]Obecność peroksydazy i katalazy może być oznaczona łącznie na tym samym podłożu. Po dodaniu odczynnika do wykrywania peroksydazy wydziela się tlen widoczny w postaci pęcherzyków gazu, a kolonie bakterii wytwarzających peroksydazę stają się czerwonobrunatne.
4.4. Reduktaza azotanowa
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Niektóre bakterie mikroaerofilne, np. E. coli wykazują zdolność nie tylko do oddychania tlenowego, ale również do oddychania beztlenowego, tzw. oddychania azotanowego. Przeniesienie elektronów i protonów, u tych bakterii, z łańcucha oddechowego na azotan warunkuje reduktaza azotanowa, której obecność wykrywamy w hodowlach na pożywce z azotanem potasu. Do hodowli dodaje się odczynnika Griessa (roztwór kwasu sulfanilowego i α-naftyloaminy w kwasie octowym), który w obecności azotynów (NO2- - powstających w wyniku redukcji NO-3) daje różowoczerwone zabarwienie związane z wytworzeniem barwnika dwuazowego w procesie dwuazowania kwasu sulfanilowego i reakcji z α-naftyloaminą.
4.5. Redukcja chlorku 2,3,5-trifenylotetrazoliowego (TTC)
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Próbę na redukcję TTC przeprowadza się u bakterii z rodzaju Pseudomonas na płytce lub podłożu płynnym z tym związkiem. Hodowle 48-godzinne bakterii, zdolne do reakcji z TTC, rosną w postaci czerwonych kolonii na płytkach lub wytwarzają czerwony strąt w hodowlach płynnych.
4.6. Redukcja błękitu metylenowego
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Redukcja błękitu metylenowego jest testem diagnostycznym dla paciorkowców, proces ten można badać również u drożdży. Barwnik ten w wysokich rozcieńczeniach, a więc stężeniach nietoksycznych, może w nieobecności tlenu pełnić rolę „sztucznego" akceptora protonów i elektronów pochodzących od różnych substratów. Podlega on wtedy redukcji do bezbarwnego leukozwiązku. Przenoszenie protonów i elektronów warunkują dehydrogenazy obecne u drobnoustrojów.
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Próbę przeprowadza się w 24-godzinnych bulionowych hodowlach bakterii (z dodatkiem mleka - tło), wprowadzając 1% roztwór błękitu metylenowego. Po półgodzinnej inkubacji hodowli z barwnikiem w temperaturze 37°C ocenia się odbarwienie pożywki. W przypadku silnie dodatniej reakcji obserwuje się całkowite odbarwienie, wynik słabo dodatni (częściowa redukcja) objawia się zabarwieniem przejściowym niebieskozielonym, wynik ujemny - brak odbarwienia.
5. Inne właściwości biochemiczne drobnoustrojów[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
] [Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Wśród testów często stosowanych w diagnostyce mikrobiologicznej są: wzrost na podłożu Simmonsa z cytrynianem, wykrywanie lecytynazy i fosfatazy oraz zmiany na podłożu - mleko z lakmusem.
5.1. Wzrost bakterii na podłożu Simmonsa z cytrynianem
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Na podłożu Simmonsa wyrastają bakterie mające zdolność do wykorzystywania cytrynianu sodowego jako jedynego źródła węgla oraz jako źródła azotu - jonu amonowego. Źródłem tego jonu w podłożu jest diwodorofosforan amonowy. Drobnoustroje rosnąc na tym podłożu w ciągu 48 godzin alkalizują je, dzięki uwolnieniu amoniaku z fosforanu amonowego. Podwyższenie pH środowiska prowadzi, w obecności wskaźnika - błękitu bromotymolowego - do zmiany barwy podłoża z zielonej na niebieską (wynik dodatni).
5.2. Wykrywanie lecytynazy
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Lecytynazy są enzymami o różnym mechanizmie działania, hydrolizującymi lecytyny, tj. glicerofosfolipidy, w których kwas fosforowy jest zestryfikowany aminoalkoholem cholina (trójmetyloetanolamina). Lecytyny występują m.in. w żółtkach jaj kurzych. Obecność lecytynaz u bakterii (cecha charakterystyczna dla wielu laseczek tlenowych i beztlenowych) sprawdzamy przez ich posiew na płytkę agarową zawierającą żółtka jaj. Za wynik dodatni przyjmuje się zmętnienie podłoża wokół wyrosłych kolonii.
5.3. Wykrywanie fosfatazy
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Fosfataza odszczepia reszty fosforanowe od węglowodanów, tłuszczów lub białek. Jest to, więc enzym o szerokiej swoistości substratowej. Wykrywamy go w hodowlach bakterii na podłożu płynnym lub stałym, zawierającym sól sodową difosforanu fenoloftaleiny, z której enzym odrywa resztę fosforanową uwalniając barwnik. W przypadku próby dodatniej, po dodaniu do hodowli kropli NaOH lub stężonego NH3, pojawia się różowe zabarwienie.
5.4. Zmiany w mleku z lakmusem
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Obserwacje wzrostu drobnoustrojów beztlenowych na podłożu, zawierającym mleko z lakmusem lub purpurą bromokrezolową dostarczają uzupełniających danych przydatnych w diagnostyce. Podłoże pokryte warstwą płynnej parafiny zaszczepia się bakteriami i inkubuje przez 48 godzin, prowadząc obserwacje w jej trakcie. Żółte zabarwienie pożywki świadczy o jej zakwaszeniu, barwa niebieska powstaje w wyniku alkalizacji podłoża. W trakcie wzrostu możemy także obserwować koagulację (ścięcie) mleka spowodowaną wytrąceniem kazeiny przez wytworzony przez bakterie kwas lub peptonizację (upłynnienie) kazeiny objawiającą się przejaśnieniem hodowli oraz gazowanie. Możemy również obserwować „ścięcie, podpuszczkowe" oraz peptonizację.
6. Mikrometody, szybkie testy do badania właściwości biochemicznych drobnoustrojów
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]W celu skrócenia czasu badania właściwości biochemicznych bakterii oraz dla oszczędności materiałów używanych do testów (podłoży, układów indykatorowych oraz odczynników), a także w związku z potrzebą uzyskania powtarzalnych i porównywalnych wyników badań z różnych laboratoriów, opracowano mikrometody i standaryzowane szybkie testy identyfikacyjne. Są one produkowane na wielką skalę przez uznane firmy zajmujące się wytwarzaniem i rozprowadzaniem podłoży i testów mikrobiologicznych. O ich dopuszczeniu do stosowania w pracowniach mikrobiologicznych decyduje w Polsce Państwowy Zakład Higieny (PZH).
6.1. Enterotube (Roche)
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Enterotube przypomina kształtem probówkę spłaszczoną z jednej strony (rys. 2). Wykonana jest z przezroczystego tworzywa sztucznego i jest podzielona na osiem lub więcej części; w każdej z nich umieszczony jest inny rodzaj podłoża agarowego, przeznaczonego do badania konkretnej cechy biochemicznej bakterii z rodziny Enterobacteriaceae (pałeczki jelitowe). Przez środek podłoży przechodzi cienki drucik - rodzaj ezy, który przed posiewem wyciąga się z rurki (czynność tę należy wykonać przy zapalonym palniku), jego końcem dotyka się kolonii identyfikowanych bakterii, wyrosłych na płytce. Następnie cały drucik przeciąga się kolejno przez wszystkie podłoża w enterotubie, dokonując tym samym ich posiewu.
[Author ID1: at Sat Oct 20 21:21:00 2012 ]Dextrose Lysine Ornithine H2S/indole Lactose Dulcitol/PA Urea Citrate
Rys.2. „Enterotube" - zestaw do identyfikacji biochemicznej pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae (A); mikrotest API do szybkiej identyfikacji biochemicznej bakterii (B)
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Po okresie inkubacji w temperaturze 37°C przez 24-48 godzin, odczytujemy wyniki posiewu. Zasada odczytu jest taka sama, jak w testach klasycznych - reakcje barwne są bardzo dobrze widoczne poprzez plastyk. Zaletą enterotube jest skrócenie czasu badania o dwa dni w porównaniu z metodą tradycyjną, należy jednak pamiętać o pewnych rozbieżnościach uzyskiwanych wyników w obu metodach.
6.2. Enterotest (Lachema - Czechy)
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Stanowi zminiaturyzowaną wersję testów biochemicznych konwencjonalnych. Można oznaczać za jego pomocą 23 właściwości biochemiczne, wychodząc z jednej kolonii identyfikowanych bakterii. Składa się z dwóch płytek ze studzienkami (mikrotiter plates) zawierającymi wysuszone substraty, które rozpuszcza się dodając zawiesinę bakterii. Na jednej płytce można zbadać 8 szczepów bakterii. W zestawie znajdują się odczynniki do wykrywania produktów reakcji.
6.3. Enteroplast (Plastomed - Polska)
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Jest to również zminiaturyzowany zestaw do oznaczania 12 właściwości biochemicznych pałeczek Gram-ujemnych z rodziny Enterobacteriaceae. Składa się z płytek plastykowych z dołkami, zawierającymi zliofilizowane podłoża diagnostyczne. Zasada oznaczania jak w przypadku Enterotestu.
6.4. Mikrometoda API
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Zestawy API firmy Bio Merieux zdominowały rynek testów diagnostycznych, przeznaczonych dla mikrobiologii. Z uwagi na całościowe podejście do zagadnienia identyfikacji drobnoustrojów, niezawodność, powtarzalność wyników, a także możliwość ustalenia, z określonym prawdopodobieństwem, przynależności badanego szczepu do rodzaju, gatunku a niekiedy biotypu lub wariantu bakterii są obecnie powszechnie stosowane na świecie.[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
] [Author ID1: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Testy te opierają się na różnicowaniu bakterii na podstawie właściwości biochemicznych. Ich przygotowanie poprzedziła analiza komputerowa wyników badań kilkudziesięciu tysięcy szczepów klinicznych oraz szczepów laboratoryjnych wzorcowych, przeprowadzona w licznych laboratoriach. Wyniki tej analizy były punktem wyjścia do selekcji substratów i metod badania właściwości biochemicznych oraz opracowania zestawów testów służących do identyfikacji konkretnych grup bakterii. Mikrometody API stosowane są do oznaczania m.in. mikrokoków i gronkowców (API Staph) oraz paciorkowców (API Strep), pałeczek Gram-ujemnych tlenowych (API NE) i względnie beztlenowych (API E), a także niektórych bakterii beztlenowych oraz drożdży.[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
] [Author ID1: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Mikrometody API można porównać do zminiaturyzowanego szeregu biochemicznego (rys. 2). Na pasku z tworzywa sztucznego znajdują się przezroczyste studzienki (mikroprobówki, mikropojemniki) zawierające zliofilizowane substraty i zestawy indykatorowe do oceny reakcji biochemicznych. Do zestawu dołączone są również odczynniki przeznaczone do wykrywania produktów metabolizmu bakterii oraz szczegółowe instrukcje do wykonania testu wraz z kartami do wpisywania wyników. Podłoża posiewa się standaryzowaną zawiesiną bakterii, inkubuje w komorze wilgotnej w czasie i temperaturze optymalnej dla danej grupy drobnoustrojów. Po okresie inkubacji odczytuje się wyniki reakcji lub sprawdza się obecność produktów metabolizmu mikroorganizmów. Wyniki wpisuje się do kart wyników. Każdej z cech biochemicznych badanych drobnoustrojów przypisuje się odpowiednią liczbę punktów. Punkty odpowiadające próbom dodatnim dodaje się, a otrzymaną liczbę odszukuje się w książce kodowej (Analytical Profile Index), odczytując wynik badania - konkretny gatunek mikroorganizmów.
7. Inne cechy drobnoustrojów brane pod uwagę w ich identyfikacji
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Oprócz właściwości hodowlanych, cech mikroskopowych oraz właściwości biochemicznych w diagnostyce mikrobiologicznej drobnoustrojów zwraca się także uwagę na wytwarzanie barwników, właściwości hemolityczne, zróżnicowanie antygenowe, właściwości biologiczne oraz wrażliwość na antybiotyki, fagi i bakteriocyny.
7.1. Wytwarzanie barwników przez bakterie
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Blisko połowa gatunków rodzaju Pseudomonas syntetyzuje barwniki fenazynowe, fluoryzujące lub niefluoryzujące oraz barwniki karotenowe. Te pierwsze dyfundują do środowiska wzrostu, powodując nie tylko zabarwienie kolonii, ale także podłoża; barwniki karotenowe nie są wydzielane do środowiska wzrostu. \[Author ID1: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Wytwarzanie przez Pseudomonas aeruginosa pyocyjaniny jest jedną z cech identyfikujących. Barwnik ten można wyekstrahować chloroformem z hodowli bakterii.[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
] [Author ID1: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Wśród bakterii niechorobotwórczych wytwarzających barwniki wymienić należy: rodzaj Micrococcus - drobnoustroje występujące na skórze ludzi, w powietrzu, kurzu, ale także i glebie; rodzaj Sarcina - drobnoustroje obecne w powietrzu; drobnoustroje wodne - bakterie fotosyntetyzujące i halofilne. Bakterie te wytwarzają barwniki żółte lub czerwone, które chronią je przed fotooksydacją.
7.2. Właściwości hemolityczne
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]Pod tym pojęciem rozumiemy zdolność bakterii do lizy krwinek czerwonych ludzi i zwierząt (hemoliza). Właściwości hemolityczne wykazują bakterie wytwarzające hemolizyny, które mogą działać jak enzymy lub, co jest częściej spotykane, powodują powstawanie kanałów w membranie krwinek (pore forming cytolysins). Wyróżniamy dwa rodzaje hemolizyn: wolne (zewnątrzkomórkowe) i związane z komórką. Hemolizyny wolne są wytwarzane w komórce bakterii i wydzielane do środowiska ich wzrostu, skąd mogą być wyosobnione (np. z przesączów hodowli). Ten typ hemolizyn wytwarzają np. S. aureus (a hemolizyna), E. coli (hemolizyna HlyA) i Listeria monocytogenes (LisA). Hemolizyny związane z komórką są wytwarzane przez Proteus mirabilis (hemolizyna HpmA) oraz Serratia marcescens (hemolizyna ShlA) i można wykazać ich obecność podczas hodowli płynnych bakterii wraz z krwinkami. Wszystkie poznane dotychczas hemolizyny są białkami.[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]
[Author ID2: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
] [Author ID1: at Sat Oct 20 21:21:00 2012
]W badaniach rutynowych aktywność hemolityczną bakterii sprawdzamy przez ich posiew na płytkę agarową z dodatkiem 5% odwłóknionej krwi człowieka lub owcy (płytka krwawa). Drobnoustroje wytwarzające hemolizyny rozkładają krwinki, co jest widoczne w postaci przejaśnienia lub zazielenienia wokół kolonii. W związku z tym wyróżnia się dwa typy hemolizy:
α - objawiająca się na płytce krwawej jako zielona strefa powstała w wyniku przekształcenia uwolnionej hemoglobiny w methemoglobinę,
β- widoczna jako pełne przejaśnienie pożywki wokół kolonii na skutek całkowitej lizy krwinek i rozłożenie barwnika.
8
Wyszukiwarka
Podobne podstrony:
Cw 07 E 01 Badanie właściwości elektrycznych kondensatora pł
Cw 02 M 04A Badanie wlasciwos Nieznany
Badanie właściwości minerałów i skał
Badanie właściwości aplikacyjnych i eksploatacyjnych powłok polimerowych - sprawozdanie, metody bada
ćw.10.Badanie właściwości łuku prądu stałego, Elektrotechnika - notatki, sprawozdania, Urządzenia el
BADANIE WŁAŚCIWOŚCI UKŁADU NERWOWEGO, dietetyka umed, fizjologia
Badanie właściwości materiałów magnetycznych –?rromagnetyki
Badanie właściwości przetworników prędkości liniowej
Doswiadczalne badanie właściwości optycznych teleskopu
Badanie wlasciwosci statycznych
badanie właściwości redoks kompleksów Fe, chemia nieorganiczna, laboratorium, Chemia nieorganiczna
Badanie właściwości tensometrów oporowych, Studia, sprawozdania, sprawozdania od cewki 2, Dok 2, Dok
Badanie właściwości mostków czterogałęźnych v5
Badanie właściwości mostków czterogałęźnych v4
Badania właściwości mechanicznych materiałów izolacyjnych, Pim c6, Politechnika Wrocławska
więcej podobnych podstron