Tadeusz Przemysłw Trzmiel Biotechnologiczne znaczenie bakterii Bacillus


T.Trzmiel, M. Szczęsna-Antczak

MIKROBIOLOGIA TECHNICZNA

5.1. CHARAKTERYSTYKA I BIOTECHNOLOGICZNE ZNACZENIE BAKTERII Z RODZAJU BACILLUS

5.1. Morfologia i fizjologia

Bakterie rodzaju Bacillus należą do grubościennych (firmicutes) bakterii właściwych (Eubakterie) mających zdolność do tworzenia wewnątrz komórek form przetrwalnych (endospor). Są to Gram-dodatnie, cylindryczne, ruchliwe komórki, osiągające przeciętne długości 1-3 m, ale są też znacznie większe, jak np. Bacillus megaterium zaliczane do bakterii -„olbrzymów”, których same endospory mają rozmiary 1,2-1,4 m. Wśród laseczek Bacillus, z reguły katalazo-dodatnich, wyróżnia się bezwzględne (obligatoryjne) i względne (fakultatywne) tlenowce oraz względne beztlenowce. W większości są urzęsione peritrichalnie lub biegunowo. Izoluje się też nie urzęsione i niezdolne do ruchu szczepy tych bakterii - jak Bacillus anthracis (laseczka wąglika). Liczne gatunki z rodzaju Bacillus tworzą łańcuszkowate układy bakterii. Z uwagi na kształt i rozmieszczenie przetrwalników w komórce podzielić je można na trzy grupy:

Powierzchnia wegetatywnych komórek Bacillus, jak u większości Gram-dodatnich bakterii, składa się kolejno z: (a) zewnętrznej otoczki (tzw. kapsuły), (b) warstwy S (o budowie krystalicznej, złożonej z glikoprotein lub polipeptydów), (c) kilkuwarstwowej peptydo-glukanowej otoczki (właściwa ściana komórkowa) oraz (d) białek zakotwiczonych na powierzchni membrany cytoplazmatycznej. Zewnętrzna otoczka wielu spośród tych laseczek, m.in. B. anthracis, B. subtilis, B. megaterium czy B. licheniformis, zawiera kwas poli - D- lub L-glutaminowy, podczas gdy B. circulans, B. mycoides i B. pumilus wytwarzają kapsułę polisacharydową zawierającą często dekstran lub lewan. Kapsuła zbudowana jedynie z poli-D-glutaminianu, jak u B. anthracis, nie jest tworzona przez należące do tej samej grupy bakterie B. cereus i B. thurigiensis, co służy, m.in. do odróżnienia tych gatunków. Warstwa ściany komórkowej jest prawie jednakowa u wszystkich bakterii Bacillus i zawiera kwas meso-diaminopimelinowy (DAP), często połączony z D-alaniną. Jest to charakterystyczna cecha budowy ściany komórkowej bakterii Gram(+), wyjątek stanowią B. pasteurii, B. globisporus i B. sphaericus, zawierające zamiast tego kwasu lizynę. Ściana komórkowa bakterii rodzaju Bacillus oprócz peptydoglukanu zawiera kwas tejchojowy związany z resztami kwasu muraminowego, a sposób ich połączenia jest różny dla różnych gatunków Bacillus i może służyć do ich odróżniania.

Wśród ponad 200 opisanych gatunków bakterii Bacillus znane są gatunki mezofilne i ekstremofilne (w tym termofilne i psychrofilne, a także psychrotroficzne). Większość dobrze rośnie w temperaturze pokojowej oraz w 37°C, np. B. licheniformis czy B. subtilis. Termofilne gatunki tych bakterii nie rosną w temperaturze poniżej 45°C, należą do nich m.in. B. stearothermophilus, B. schlegelii, B. acidocaldarius i B. thermoruber. Z kolei do typowych, zimnolubnych bakterii Bacillus zalicza się B. macquariensis, B. psychrophilus, B. psychrosaccharolyticus, B. globisporus, B. insolitus, B. marinus, B. megaterium i B. polymyxa. Niektóre z nich rosną i tworzą przetrwalniki w temperaturze 0oC (np. B. macquariensis, B. insolitus). Najczęściej izolowane z morskich osadów bakterie B. marinus rosną w zakresie temperatur 5-30oC, ale już nie - w 37oC.

Wiele gatunków bakterii z rodzaju Bacillus posiada duże możliwości adaptacyjne do warunków środowiska, bez wyraźnie widocznych zmian metabolicznych. Na uwagę zasługuje zdolność przystosowawcza licznych mezofilnych gatunków (B. licheniformis, B. subtilis, B. coagulans, B. badius, B. smithii i innych) do rozwoju w wysokich temperaturach, sięgających nawet 60-70°C. Gatunki te w literaturze określa się terminem „termotolerancyjnych laseczek”. Izolowane były one na przykład z piasków Sahary, osiągających latem temperaturę ponad 60°C. W grupie termofilnych bakterii rodzaju Bacillus znajdują się też fakultatywne litoauotrofy (jak bakterie B. schlegelii czerpiące energię z utleniania H2 lub CO, a węgiel - z CO2 lub CO) i laseczki wybitnie acidofilne (kwasolubne), jak np. gatunek B. acidocaldarius rosnący w temperaturze 45-65oC w zakresie pH 2-6 (formy przetrwalne tych bakterii cechuje zaskakująco wysoka termoodporność).

Bakterie Bacillus, w zależności od gatunku, wymagają do wzrostu środowiska o różnym pH. Laseczki z grupy bakterii alkalofilnych to m.in. B. firmus, B. alkalophilus, B. lentus, B. pasteurii czy ostatnio zidentyfikowany B. wakoensis. Dobrze rosną one w pH>8 a niektóre nawet w pH 11. Do neutrofili, rozwijających się najlepiej w pH obojętnym, zalicza się większość szczepów B. subtilis, B. coagulans, B. licheniformis, B. circulans, B. laterosporus czy B. pumilus. Izoluje się też acidofilne lub kwasotolerancyjne szczepy, m.in. gatunki B. polymyxa, B. coagulans, B. acidocaldarius, B. acidoterrestris czy zidentyfikowany w 2005 roku nowy gatunek Bacillus acidicola. Niektóre z tych laseczek są halofilne lub halotolerancyjne, np. B. globisporus, B. marinus, B. halophilus, B. panthotenicus i B. pasteurii - rosną nawet w 10% NaCl. W 2005 roku zdeponowano w kolekcji czystych kultur DSM (Deuche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen) w Niemczech, szczep B. arsenicus rosnący dobrze w środowisku zawierającym 20 mM arseninu.

Fizjologiczna i metaboliczna (opisana w następnym rozdziale) różnorodność poszczególnych gatunków bakterii rodzaju Bacillus związana jest z ich genetycznym zróżnicowaniem, co odzwierciedla różnica zawartości GC w ich genomowym DNA. Waha się ona w szerokim zakresie 32 - 69%. Stosując zasady taksonomii numerycznej oraz opartej o analizę sekwencji rybosomalnego RNA (jednostki 16S) bakterie rodzaju Bacillus podzielono na 5 grup:

  1. Grupa typu B. subtilis - najlepiej poznana. Są to tlenowce lub fakultatywne beztlenowce (jak B. licheniformis). Wytwarzają kwasy z cukrów a niektóre są halotolerancyjne (B. lentus i B. firmus). Do tej grupy zalicza się też gatunki B. antraxis, B. cereus i B. thuringiensis.

  2. Grupa typu B. sphearicus - ścisłe tlenowce wykorzystujące jako źródło węgla raczej octan i aminokwasy (nie cukry). Grupa wyjątkowa, gdyż w ścianie komórkowej zamiast kwasu meso-diaminopimelinowego zawiera lizynę lub ornitynę

  3. Grupa typu B. polymyxa - (nazwana obecnie Paenibacillus) to względne beztlenowce wykorzystujące mono- i polisacharydy, np. B. polymyxa prowadzi fermentację butandiolową a B. macerans w warunkach beztlenowych zakwasza środowisko i wytwarza etanol.

  4. Grupa typu bakterii B. brevis (sklasyfikowana jako Brevibacillus) jest taksonomicznie bardzo zróżnicowana, ale generalnie są to ścisłe tlenowce niewytwarzające kwasów z węglowodanów. B. azotoformans należący do tej grupy może rosnąć wykorzystując jon azotanowy jako akceptor elektronów (w warunkach beztlenowych).

  5. Bardzo zróżnicowana grupa termofilnych laseczek rosnących powyżej 50°C, do której zalicza się, m.in. wykorzystujące kwas mlekowy bakterie B. coagulans, autotroficzne chemolitotrofy oraz wspominane już kwasolubne termofile (podgrupa Alicyclobacillus).

Generalnie, bakterie rodzaju Bacillus to w większości saprofity, powszechnie bytujące w środowisku naturalnym, szczególnie licznie w glebie, ale wyróżnia się też gatunki patogenne, rozwijające się tylko w organizmach żywych (dwa najważniejsze z nich to B. anthracis i B. cereus). Wszystkie gatunki rodzaju Bacillus zdolne są do syntezy i wydzielania na zewnątrz komórek wielu enzymów, najważniejsze to hydrolazy depolimeryzujące substancje wielkocząsteczkowe (takie jak białka, węglowodany, tłuszcze i kwasy nukleinowe), oraz wielu antybiotyków i bioinsektycydów. Stąd bakterie rodzaju Bacillus pełnią dominującą rolę w procesach biotechnologicznych, szczególnie w przemysłowych procesach fermentacji mikrobiologicznej.

5.2. Metabolizm

Bakterie z rodzaju Bacillus należą do grupy wybitnie heterogennych chemoorganotrofów (chemoheterotrofy). Dobrze rosną na zwykłych podłożach bulionowych. Na podłożach agarowych rosną w postaci dużych kolonii, których rozmiary sięgają 3-5 mm. Na płynnym bulionie tworzą kożuch na powierzchni lub zmętnienie w całej objętości pożywki. Wyjątek stanowi Bacillus larvae i inne patogeny owadów, jak B. popilliae i B. lemtimorbis, które generalnie słabo przetrwalnikują i rosną na tzw. J-agarze zawierającym trypton i ekstrakt drożdżowy. Dla niektórych gatunków (prototroficznych) ściśle zdefiniowano ich wymagania pokarmowe i ustalono składy podłoży minimalnych (np. dla B. subtilis, B. megaterium).

Wymagania pokarmowe dla wegetatywnego wzrostu bakterii Bacillus są gatunkowo bardzo zróżnicowane. Podczas, gdy jednym gatunkom wystarczają pojedyncze źródła węgla, azotu i energii (np. dla B. cereus, B. licheniformis, B. pumilus i B. subtilis), inne wymagają podłoży kompleksowych, które zawierają dodatkowe czynniki wzrostu. Witaminy i aminokwasy wymagane są np. dla prawidłowego rozwoju bakterii B. azotofixans, B. macerans, B. polymyxa i B. psychrosaccharolyticus, natomiast B. megaterium nie wymaga do wzrostu związków organicznych (wystarczą odpowiednie sole mineralne i sacharoza jako źródło węgla).

Substancje organiczne metabolizowane są w komórkach Bacillus w procesach tlenowych bądź fermentacyjnych (nie wymagających tlenu) lub też w obu typach procesów. Tlen cząsteczkowy, wykorzystywany jako akceptor elektronów w metabolizmie tlenowym, może być zastąpiony u niektórych z gatunków tych bakterii przez jony NO3- (tzw. oddychanie azotanowe, jak u Bacillus licheniformis). Przykładem bakterii rodzaju Bacillus doskonale „radzących sobie” w warunkach beztlenowych jest też B. azotoformans (wyjątkowo Gram-ujemny), wykorzystujący jako akceptor elektronów w procesie oddychania NO3-, NO2-, SO4 -2 lub fumaran i przetwarzający związki azotowe do N2. Inne gatunki bakterii tego rodzaju, takie jak np. B. polymyxa, B. macerans i B. azotofixans wykazują zdolność do wiązania azotu, ale tylko w warunkach beztlenowych, gdyż tlen cząsteczkowy inhibituje nitrogenazę - enzym niezbędny do wiązania N2.

Wiele gatunków bakterii Bacillus, rosnąc w warunkach beztlenowych zdobywa energię w procesach fermentacji węglowodanowych substratów. W efekcie wytwarzane są różne produkty końcowe, których identyfikacja wykorzystywana jest do odróżniania gatunków w biochemicznych testach diagnostycznych. Na przykład gatunki B. cereus, B. licheniformis i B. subtilis w pożywkach zawierających sacharydy wytwarzają 2,3-butandiol, glicerol, CO2 i niewielką ilość mleczanu oraz etanolu. Natomiast B. polymyxa i B. macerans rozkładają w warunkach beztlenowych oprócz monosacharydów również polisacharydy: skrobię i pektyny, przy czym Bacillus polymyxa tworzy 2,3-butandiol, CO2, H2 i etanol, a Bacillus macerans - etanol, aceton, octan, mrówczan, CO2 i H2. Właśnie wytwarzanie gazowego wodoru i brak glicerolu w końcowych produktach fermentacji wyróżnia te dwa ostatnie gatunki od B. cereus, B. licheniformis i B. subtilis. W innym szlaku metabolicznym - homofermentacji mleczanowej - rozkładane są węglowodany przez Bacillus coagulans. Bakterie tego gatunku, podobnie jak bakterie kwasu mlekowego, posiadają izomerazę glukozofosforanową i wytwarzają z heksoz jedynie kwas mlekowy. Natomiast charakterystyczną cechą alkalofilnych bakterii Bacillus pasteurii jest ich zdolność do rozkładu mocznika związana z wytwarzaniem przez te bakterie enzymu - ureazy.

W warunkach tlenowych i beztlenowych w komórkach bakterii Bacillus subtilis heksozy rozkładane są w glikolitycznym szlaku EMP do pirogronianu. W komórkach wegetatywnych, w warunkach tlenowych, pirogronian nie jest włączany jako acetylo-CoA do cyklu Krebsa, gdyż niektóre enzymy tego cyklu (np. dehydrogenaza 2-oksoglutaranowa) są w nich zablokowane (represja kataboliczna) i „włączane” są dopiero podczas przygotowania komórek do sporulacji (przetrwalnikowania). Zamiast cyklu Krebsa funkcjonuje wówczas cykl glioksalowy, a ATP zdobywane jest na drodze fosforylacji substratowej. Dlatego, podczas wzrostu wegetatywnego bakterie te gromadzą kwasy organiczne, co jest powodem zakwaszania środowiska (nawet do pH 4-5). Efekt zablokowania cyklu Krebsa dotyczy wegetatywnych komórek (np. B. subtilis) rosnących w obecności nadmiaru łatwo przyswajalnych cukrów prostych (glukozy), ich brak lub wyczerpywanie powoduje zwolnienie przemian glikolitycznych i odblokowanie (derepresję) enzymów cyklu Krebsa. Stąd w końcowej fazie wzrostu wykładniczego, gdy wyczerpaniu ulegają łatwo przyswajalne źródła węgla i energii a komórki rozpoczynają przygotowywać się do wytworzenia endospor, odblokowane zostają enzymy cyklu Krebsa i acetylo-CoA ulega całkowitemu utlenieniu do CO2. Dzięki temu powstaje duża ilość energii (ATP) niezbędna w procesie sporulacji. Wówczas też, w warunkach tlenowych, utlenione zostają nagromadzane wcześniej kwasy organiczne i pH środowiska rozwoju bakterii Bacillus wzrasta. Proces sporulacji wymaga znacznych ilości energii (jak już wspomniano), dlatego w komórkach Bacillus przygotowujących się do wytworzenia przetrwalników, w tzw. etapie 0 (inicjowanie tworzenia się prespor), podniesiony jest znacznie poziom ATP i NADH. Jednak tworzące się prespory nie posiadają enzymów cyklu Krebsa, te znajdują się jedynie w komórce macierzystej. Natomiast w młodych endosporach gromadzone są wysokoenergetyczne związki a także kwas pikolinowy i jony wapnia. Dipikolinian wapnia (DPA) obecny w wykształconych przetrwalnikach w ilości 10 - 15%, gwarantuje ich wysoką ciepłooporność. Inną unikalną, metaboliczną cechą komórek Bacillus tworzących formy przetrwalne jest synteza peptydoglikanu składającego się z trzech powtarzających się jednostek: (1) laktam kwasu muraminowego, (2) krótki peptyd L-alanylowy, (3) tetrapeptyd: L-Ala-D-Glu- kwas meso- diaminopimelinowy - D-Ala. Taki peptydoglikan (lub o zbliżonym składzie) obecny jest w formach przetrwalnych wielu gatunków Bacillus, a nie spotyka się go w żadnych komórkach wegetatywnych. Znacznie mniej wiadomo na temat procesu kiełkowania spor

5.3. Środowisko występowania bakterii z rodzaju Bacillus

Laseczki rodzaju Bacillus są w naturze wszechobecne. Można je spotkać w glebie, w wodach słodkich i słonych, mule, osadach wód powierzchniowych, gorących źródłach, na różnych częściach roślin, w przewodzie pokarmowym zwierząt, czy psującej się żywności. Tak szerokie rozpowszechnienie związane jest z możliwością tworzenia przez te bakterie endospor, które pozwalają im przetrwać w niesprzyjających dla rozwoju warunkach środowiskowych, a ponadto umożliwiają rozprzestrzenianie się w przyrodzie. Laseczki Bacillus obdarzone są również mechanizmami umożliwiającymi bytowanie i aktywny rozwój w środowiskach oligotropowych, o dużej rozpiętości temperatur, pH i zasolenia. Wszystko to sprawia, że bakterie rodzaju Bacillus można izolować z różnorodnych miejsc i środowisk Ziemi, a nawet znaleźć je... w przestrzeni kosmicznej.

Najpowszechniej bakterie rodzaju Bacillus występują w glebie, gdzie można spotkać zarówno gatunki mezofilne, jak i psychrofilne. Zalicza się je wspólnie do tzw. zymogenicznej mikroflory gleby, a więc, w przeciwieństwie do autochtonicznej, ich intensywny rozwój występuje w przypadku dużego napływu do gleby materii organicznej (np. opad liści w lesie, nawożenie obornikiem, itp.). Ich uzdolnienia do degradacji biopolimerów (białka, węglowodany, kwasy nukleinowe), sprawiają, że spełniają one istotną rolę w biologicznych obiegach węgla i azotu. Uczestniczą w mineralizacji materii organicznej, a w miarę nasilania się warunków niekorzystnych dla życia lub wyczerpywania zasobów pokarmowych, tworzą endospory. Endospory, które cechuje metabolizm 107 razy wolniejszy niż komórki wegetatywne mogą przetrwać tysiące lat, a po ustąpieniu niekorzystnych warunków, ponownie rozpoczynają aktywne (wegetatywne) życie. Należy przy tym mieć na uwadze, że większość gatunków bakterii z rodzaju Bacillus jest urzęsiona. Mogą więc penetrować środowiska gleby w poszukiwaniu dostępu do substancji odżywczych, co daje im znaczą przewagę nad wieloma innymi drobnoustrojami pozbawionymi narzędzi ruchu. W celu przeżycia laseczki B. subtilis potrafią nawet, wydzielając odpowiedni antybiotyk lub toksynę, zabić sąsiadujące komórki tego samego gatunku by czerpać z nich „pożywienie”.

Najliczniej reprezentowane są w glebach laseczki Bacillus cereus i tylko nieco mniej licznie B. licheniformis, B. subtilis i B. pumilus. Wynika to prawdopodobnie z ich niewielkich wymagań pokarmowych. W glebach bogatych w składniki pokarmowe, szczególnie w części ryzosfery zawierającej dużą ilość substancji odżywczych wydzielanych przez korzenie roślin, można znaleźć gatunki o dużych wymaganiach pokarmowych jak: B. psychrosaccharolyticus, B. polymyxa, B. macerans i B. azotofixans. Trzy ostatnie z nich wiążą azot atmosferyczny, który prawdopodobnie przekazują roślinom lub innym mikroorganizmom, żyjąc z nimi w systemie protokooperacyjnym. Bakterie Bacillus biorą też udział w raczej niekorzystnych z punktu widzenia rolnictwa, procesach denitryfikacji nawozów azotowych (przetwarzanie NO3- do NH3, N2O lub N2).

Jak już wspomniano, bakterie rodzaju Bacillus można też izolować z wód. W wodach słodkich, w strefach umiarkowanego klimatu, występują te same gatunki, które spotyka się w glebach, choć w znacznie mniejszej ilości.

Termofilne laseczki Bacillus (m.in. B. stearothermophilus, B. thermoruber) za typowe środowisko swego bytowania przyjęły gorące źródła, gejzery i jeziora o wysokich temperaturach. Co interesujące, B. stearothermophilus można izolować również z osadów zimnych wód, dennych pokładów oceanów czy też z gleb arktycznych. Ponieważ izolowane szczepy nie są zbytnio przystosowane do morskiej wody, przypuszcza się, że pochodzą one z endospor zdeponowanych w piaskach dennych przed wieloma tysiącami lat.

Z alkalicznych wód (i gleb) izoluje się laseczki z grupy alkalofilnych (m.in. B. firmus, B. alcalophilus, B. lentus). Można je również znaleźć w wodach morskich. Przybrzeżne wody morskie i ujścia rzek (zwłaszcza silnie zanieczyszczone) stały się siedliskiem bakterii glebowych - B. subtilis i B. licheniformis. Mogą one stanowić do 15% mikroflory tych wód. Natomiast z wód morskich o dużej czystości izoluje się Bacillus cereus.

Bakterie z rodzaju Bacillus pospolicie występują w ściółce i na martwych tkankach roślin, intensywnie uczestnicząc w II fazie ich rozkładu. Licznie reprezentowane są gatunki B. megaterium, B. cereus i B. mycoides. Wydzielając wiele różnych enzymów (m.in. hydrolazy degradujące biopolimery oraz oksydoreduktazy atakujące związki aromatyczne) zdolne są one do rozkładu martwych liści drzew zawierających znaczne ilości lignin i tanin. Również wiele laseczek zasiedla powierzchnię żywych liści i łodygi roślin. Można je również spotkać na nasionach roślin, a B. subtilis może nawet przebywać w tkance twardej nasion. Niektóre z tych gatunków dostarczają roślinom azot wiązany z powietrza (o czym już była mowa), inne chronią rośliny przed szkodliwymi owadami (wytwarzając δ- endotoksyny), a jeszcze inne zapobiegają lub hamują rozwój chorób grzybiczych roślin (wydzielając metabolity wtórne o właściwościach antybiotyków). Laseczki Bacillus można również spotkać na powierzchni igieł drzew i w glebie zasiedlonej przez rośliny iglaste.

Niektóre gatunki Bacillus występują w przewodzie pokarmowym zwierząt, biorąc czynny udział w procesach trawienia. Gatunki B. coagulans, B. licheniformis, B. circulans, B. laterosporus i B. pumilus znaleziono np. w żwaczu zwierząt trawożernych, gdzie ze względu na prowadzony rozkład białek, hemicelulozy B, degradację ksylanu i hydrolizę glikozydów ich obecność jest korzystna dla przeżuwacza.

5.4. Zagrożenie zdrowotne

Wśród bakterii z rodzaju Bacillus jedynie B. anthracis uważany jest za gatunek silnie patogenny dla człowieka i innych ssaków a nawet dla niektórych kręgowców. Gatunek znany jest bakteriologom od ponad stu lat - opisany został po raz pierwszy przez Roberta Kocha w 1876 roku. Laseczki B. anthracis są stosunkowo duże i cechują się kwadratowymi końcami. Endospory wytwarzane przez te bakterie (wielkości 2-6 m, o bardzo dużej odporności na warunki środowiska i wieloletniej żywotności w glebie i wodzie) mogą być obecne w wielu produktach pochodzenia zwierzęcego i powodować chorobę zwaną wąglikiem (łac. Anthrax). U zwierząt śmiertelność w przypadku tej choroby sięga 100%. U ludzi stykających się, np. zawodowo, z mięsem, skórami, wełną i sierścią zakażonych zwierząt, zakażenie wąglikiem ma łagodniejszy przebieg, choć w postaci płucnej lub jelitowej może także przebiegać bardzo ciężko a leczenie polega na stosowaniu wysokich dawek antybiotyków. Louis Pasteur w 1881 roku opracował szczepionkę przeciw wąglikowi. Czynnikami wirulencji tych bakterii są otoczka (polipeptyd zbudowany z kwasu D-glutaminowego) oraz egzotoksyna składająca się z trzech dobrze scharakteryzowanych białkowych komponent. Wytwarzanie egzotoksyny sprzężone jest częściowo z syntezą otoczki a geny kodujące jej składniki znajdują się w plazmidzie pX01, czyli pozachromosomalnym elemencie genetycznym tych bakterii, co odkryto w latach 80. XX wieku. Wytwarzanie otoczek następuje w organizmie żywiciela a in vitro, jedynie wówczas, gdy pożywka zawiera dwuwęglany (co odzwierciedla podwyższone stężenie CO2 występujące w organizmach zwierzęcych). Znanych jest kilkadziesiąt szczepów B. anthracis o różnej toksyczności, począwszy od wybitnie złośliwych Ames i Vollum (służących jako wojskowa broń biologiczna) do szczepu Sterne stosowanego do szczepień uodparniających. Popularność laseczek wąglika wzrosła, gdy w 2001 r wykorzystane zostały w Stanach Zjednoczonych przez bioterrorystów.

Innym patogennym gatunkiem, blisko spokrewnionym z B. anthracis (ale też z B.  mycoides i B. thuringiensis) jest Bacillus cereus. Chociaż jego wirulentność jest znacznie niższa niż laseczki wąglika (m.in. nie posiada otoczki zbudowanej z kwasu poli-D-glutaminowego), może on być przyczyną szeregu chorób, w tym: zatruć pokarmowych, lokalnych infekcji ran, zapaleń oczu, posocznic, infekcji układu oddechowego i innych. Bakterie te, zaliczane do względnych beztlenowców, powodują głównie zakażenia przewodu pokarmowego wywołane wydzielanymi przez nie enterotoksynami (termostabilną lub termolabilną). Ponieważ powszechnie występują w glebach skąd mogą przedostawać się do wielu produktów spożywczych, zatrucia nimi są znacznie częstsze, aniżeli wywoływane innymi czynnikami. Bakterie te wytwarzają antybiotyki.

Pozostałe gatunki bakterii z rodzaju Bacillus uważa się za saprofity, jakkolwiek niektóre z nich (B. alvei, B. circulans, B. pumilus, B. megaterium, B. laterosporus, B. brevis B. macerans czy B. sphaericus) mogą wywoływać infekcje, zwłaszcza wtedy, gdy odporność atakowanego organizmu jest osłabiona lub jego metabolizm jest nieprawidłowy. Częstotliwość ich izolowania jako patogenów z zakażonych miejsc u chorych pacjentów wzrasta.

Wiele z gatunków Bacillus to patogenny, ale jedynie… dla owadów, co wykorzystywane jest w walce ze szkodnikami upraw rolniczych (są to m.in. gatunki: B. thuringiensis, B. larvae, B. lentimorbis, B. popilliae). Podczas tworzenia przetrwalnych form gatunku B. thuringiensis, zaliczanego do jednej grupy wraz z B. cereus i B. anthracis, produkowane jest krystaliczne białko nazywane Bt-insektycyd, toksyczne dla larw motyli-szkodników. Obecnie dzięki osiągnięciom inżynierii genetycznej uzyskano szczepy B. thuringiensis toksyczne wybiórczo dla różnych gatunków owadów-szkodników, będące jednocześnie nieszkodliwymi dla gatunków korzystnych. Stosowane są one do tzw. „biologicznej kontroli” upraw ogrodowych i pól (więcej na ten temat w rozdziale 6.5.2). Źródłem biologicznych pestycydów są także szczepy: B. mycoides, B. pumilus i B. sphaericus.

5.5. Biotechnologiczne znaczenie

Bakterie Bacillus od tysięcy lat były tradycyjnie wykorzystywane, m.in. w krajach Dalekiego Wschodu i Afryce do przetwarzania żywności. Fermentowano tam w warunkach alkalicznych ziarno soi, nasiona roślin strączkowych, orzeszki ziemne lub arachidowe i wiele innych, uzyskując żywność o wysokich walorach smakowych i odżywczych. Naturalną mikroflorą rozwijającą się w tych warunkach były przede wszystkim bakterie Bacillus. W Japonii przetrwała tradycja wytwarzania natto, potrawy spożywanej na śniadanie, która jest produktem fermentacji ziaren soi prowadzonej przez szczep Bacillus subtilis(natto), gdzie główną rolę pełnią wydzielane przez te bakterie proteinazy oraz amylazy i celulazy.

Współczesny przemysł biotechnologiczny wykorzystuje bakterie rodzaju Bacillus przede wszystkim do produkcji na skalę przemysłową enzymów i antybiotyków a także insektycydów, chemikaliów i innych metabolitów (np. kwas hialuronowy, kwas foliowy, ryboflawina). Większość wartościowych produktów biotechnologicznych bakterie te wytwarzają w fazach pre- i post stacjonarnej, są to zatem metabolity wtórne, których biosynteza nie jest bezpośrednio związana ze wzrostem komórek, co zwiększa opłacalność ich produkcji.

Bakterie Bacillus posiadają doskonałe cechy z punktu widzenia ich przemysłowej aplikacji , do których trzeba zaliczyć:

  1. Dużą szybkość wzrostu bakterii, co daje możliwość znacznego skracania czasu procesów

  2. Zdolność do wydzielania wielu białek na zewnątrz komórek (w ilościach rzędu kilkudziesięciu g/L) dzięki dobrze rozwiniętym systemom sekrecji u tych bakterii

  3. Fakt, że najważniejsze przemysłowe szczepy: Bacillus subtilis, B. amyloliquefaciens i Bacillus licheniformis posiadają status GRAS (generalny regarded as safe), to znaczy ustalono, że są bezpieczne dla zdrowia człowieka

  4. Znaczną wiedzę na temat fizjologii, metabolizmu i genetyki tych bakterii. Wiedza ta jest wciąż rozszerzana z uwagi na duży potencjał aplikacyjny tych bakterii.

Jako drobnoustroje glebowe wytwarzają one liczne enzymy uczestniczące w degradacji różnorodnych substratów i mogą rozwijać się w kompleksowych, bardzo różnicowanych i zmiennych warunkach. Wiele enzymów wartościowych z punktu widzenia przemysłowego zastosowania (w produkcji żywności i pasz oraz detergentów) wytwarzanych jest przez rodzaj Bacillus. Zalicza się do nich przede wszystkim alkaliczne i obojętne proteazy, amylazy, celulazy, glukanazy, izomerazę glukozową, ksylanazy i inne. Stanowią one obecnie ponad 60% globalnej przemysłowej produkcji wszystkich preparatów enzymatycznych osiągającej wartość 1,6 miliarda USD (dane z 2002 roku). Aktualnie dużym zainteresowaniem cieszą się enzymy z alkalofinych szczepów tych bakterii (jak np. B. halodurans - pierwszy producent alkalicznej -galaktozydazy i ksylanazy) z uwagi na szczególnie korzystne aplikacyjne cechy tych enzymów. Zapotrzebowanie przemysłu na nowe enzymy spowodowało, że szeroko rozwinięte są dzisiaj prace nad badaniem genomów bakterii Bacillus różnych gatunków. Od 1997 roku znany jest genom szczepu Bacillus subtilis 168 (zawiera on 4100 genów kodujących białka), zsekewnencjonowano już także genomy B. cereus ATCC14579, B. antracis A202, B. thuringensis subsp. israelensis i ostatnio genom B. licheniformis ATCC 14580 - gatunku taksonomicznie związanego ze szczepem B. subtilis (ten genom zawiera 4208 regionów kodujących białka). Analiza sekwencji genomów potwierdza przewidywany ogromny potencjał metaboliczny tych bakterii. Niektóre geny o dużym znaczeniu przemysłowym, związane z wytwarzaniem enzymów degradujących węglowodany, lipidy i białka, zidentyfikowane u Bacillus wymieniono w Tabeli 5.1 (wg Schallmey M, Singh A i Ward O.P. Can.J.Microbiol. 2004;50:1-17).

Tabela 5.1. Geny bakterii Bacillus o znaczeniu przemysłowym

Gen

Poz.*)

Enzym

Gen

Poz.*)

Enzym

abfA

2939

Alfa-L-arabinofuranozydaza

abnA

2949

Endo 1,5-alfa-arabinaza arabinianu

bglC

1940

Endo-1,4-beta-glukanaza

bglH

4023

Beta-glukozydaza

bglS

4011

Endo-1,3- i 1,4-glukanaza

csn

2748

Chitozanaza

lacA

3540

Beta-galaktozydaza

sacB

3535

Lewanosacharaza

sacC

2759

Lewanaza

pel

828

Liaza pektynianowa

pelB

2034

Liaza pektynianowa

yhlE

1095

Glukanaza

ykfC

1281

Endo-1,4-beta-ksylanaza

ykfC

1367

Enzym degradujący polisacharydy

ykvQ

1445

Chitynaza

ynfF

1943

Endo-ksylanaza

yrhO

2768

Metabolizm cyklodekstryn

yvdF

3557

1,4-alfa-matlohydrolaza glukanu

yvfO

3502

Endo-1,4-beta-galaktozydaza arabinogalaktanu

yxiA

4040

Endo 1,5-alfa-L-arabinozydaza arabinianu

yvpA

3590

Liaza pektynianowa

yveB

3537

Lewanaza

nprE

1541

Obojętna metaloproteinaza, zewnątrzkomórkowa

aprE

1105

Alkaliczna, serynowa proteinaza, zewnątrzkomórkowa

epr

3939

Serynowa proteinaza zewn. (2)

pepT

3994

Peptydaza T

vpr

3907

Serynowa proteinaza zewn. (2)

yrrN

2794

Proteaza

yrrO

2793

Proteaza

lipA

292

Lipaza

lipB

293

Lipaza

csaA

2079

Chaperon związany z sekrecją białek

lsp

1616

Peptydaza sygnałowa II

prs

1071

Białko sekrecyjne

sipS; sipT; sipU; sipV; sipW

2432; 1511; 454; 1122; 2554

Peptydazy sygnałowe I

yaaT

42

Peptydaza sygnałowa II

*) pozycja genu w chromosomie

Pełna wiedza na temat potencjału genetycznego bakterii B. subtilis oraz ich fenomenologiczna zdolność do wydzielania dużych ilości białek do podłoża hodowlanego (a także szybki wzrost i łatwe prowadzenie hodowli w reaktorach) sprawia, że komórki tych bakterii są potencjalnie najlepszym gospodarzem (tzw. cell factory, komórka-fabryka,) do produkcji białek heterologicznych (których geny pochodzą z innych organizmów). W przeciwieństwie do nich, obecnie wykorzystywane w tym celu komórki E. coli mają skłonność do akumulacji produktów w cytoplazmie lub przestrzeni peryplazmatycznej (powstają wówczas tzw. ciała inkluzyjne, trudne do wydzielenia z komórek i w których białka mogą tracić natywną strukturę) a także mogą być źródłem endotoksyn szkodliwych dla organizmu ludzkiego, charakterystycznych dla większości bakterii Gram(-).

Do białek heterologicznych wytwarzanych w komórkach bakterii Bacillus należą, oprócz tych o znaczeniu terapeutycznym, takich jak hormon wzrostu, interferony, interleukina, proinsulina, aktywator plasminogenu i inne, również białka enzymów, których geny pochodzą z innych drobnoustrojów. Mimo że wiele enzymów wytwarzanych jest w skali przemysłowej w oparciu o wyselekcjonowane ze środowiska szczepy (dzikie), to w przypadku konieczności wytwarzania enzymów, których geny zidentyfikowane zostały w drobnoustrojach nie rosnących w warunkach laboratoryjnych (lub mających trudne/kosztowne do spełnienia wymagania), a także w przypadku modyfikacji (ulepszania) właściwości enzymów na drodze genetycznej (metodami technologii rekombinowanego DNA) dąży się do stosowania jako komórek-gospodarza dobrze poznanych bakterii rodzaju Bacillus (w tym B. licheniformis, B. clausii, B. subtilis i B. amyloliquefaciens). Między innymi geny termostabilnej -amylazy z Bacillus amyloliquefaciens, ksylanazy Bacillus pumilus, amidazy penicylinowej Bacillus sphaericus klonowano w komórkach Bacillus subtilis. Przenoszono też geny wielu subtylizyn w obrębie bakterii z rodzaju Bacillus (m.in. opatentowano recepturę detergentu, którego składnikiem jest subtylizyna Bacillus amyloliquefaciens, której gen był poddany ekspresji w Bacillus subtilis). Szczep B. subtilis bardzo wydajnie wytwarza „swoje” (rodzime) białka, ale często wykazuje jeszcze zbyt niską efektywność produkcji białek heterologicznych. W celu uzyskania wysokiej wydajności wydzielania obcych białek (heterologicznych) szczegółowo badane są obecnie u tych bakterii mechanizmy regulacji biosyntezy białek i regulacji systemów ich sekrecji. Efektem tych badań było między innymi uzyskanie szeregu mutantów tych bakterii nie wytwarzających proteaz (tzn. pozbawionych genów tych enzymów). W szczepie Bacillus subtilis zidentyfikowano, bowiem aż 24 różne proteazy (w tym membranowe), które były jednym z głównych powodów niskich wydajności białek heterologicznych (powodowały degradację tych obcych dla komórki białek).

Bakterie z rodzaju Bacillus są interesującym i przy tym wygodnym dla przemysłu materiałem biologicznym. Głównym powodem jest fakt, że komórki tych bakterii, w przeciwieństwie do wielu bakterii Gram (-), nie zawierają w strukturze ściany komórkowej toksycznych lipopolisacharydów oraz posiadają pojedynczą warstwę membrany cytoplazmatycznej, co właśnie ułatwia sekrecję wytwarzanych przez nie produktów. Z punktu widzenia aplikacji preparatów enzymatycznych i innych bioproduktów, drobnoustroje stosowane do ich produkcji dzieli się na trzy grupy: A, B i C. Wśród bakterii rodzaju Bacillus wyróżnia się 22 gatunki nie patogenne, dobrze scharakteryzowane i akceptowane przez przemysł biotechnologiczny. Zakwalifikowano je do grup A i B, do których należą mikroorganizmy tradycyjnie używane w produkcji żywności lub uważane za nieszkodliwe. Enzymy wytwarzane przez te bakterie, nie wymagają testowania lub testowane są jedynie pod kątem ewentualnej toksyczności. Spośród gatunków Bacillus należą do nich: Bacillus subtilis (włączając szczepy znane jako Bacillus mesentericus, Bacillus subtilis (natto) i Bacillus amyloliquefaciens) oraz Bacillus stearothermophilus, Bacillus licheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacillus circulans i Bacillus pumilus. Natomiast 26 gatunków, które mogą być patogenne (m.in. Bacillus cereus i Bacillus anthracis), umieszczono w grupie C (stosowanie w produkcji żywności enzymów wywodzących się z tych gatunków wymaga specjalistycznych testów).

Szczepy bakterii z rodzaju Bacillus dość łatwo dają się doskonalić na drodze mutacji i selekcji, i jako takie, o zwiększonej produktywności lub aktywności enzymatycznej są stosowane w wielu znanych przemysłowych technologiach. Całe komórki tych bakterii (często immobilizowane) znajdują też zastosowanie w procesach biotransformacji i biodegradacji, w tej postaci wykorzystuje się je głównie jako źródło oksydoreduktaz i izomeraz. Możliwości stosowania ich w tych procesach są bardzo szerokie i nie do końca wykorzystane. Posiadany przez nie potencjał enzymatyczny jest tak bogaty, że należy się tu spodziewać wielu nowych aplikacji.

Ważnym obszarem biotechnologicznego wykorzystania bakterii z rodzaju Bacillus na skalę przemysłową jest produkcja antybiotyków (np. bacytracyny, gramicydyny S) oraz bioinsektycydów (np. δ-endotoksyn Bacillus thuringiensis). Do producentów antybiotyków rodzaju Bacillus zaliczyć można: B. brevis (gramicydyna i tyrotrycyna), B. circulans (cyrkulina), B. cereus (cereksyna i zwittermycyna), B. laterosporus (laterosporyna), B. licheniformis (bacytracyna), B. polymyxa (polimyksyna i kolistyna), B. pumilus (pumulina), B. subtilis (polimyksyna, difficynina, subtilina, mykobacilina). Spektrum działania tych antybiotyków jest różne, i tak np.: bacytracyna, pumulina, laterosporyna, gramicydyna i tyrocydyna przeciwdziałają wzrostowi bakterii Gram(+), kolistyna i polimyksyna inhibitują wzrost bakterii Gram(-), wreszcie difficynina ma szerokie spektrum działania a mykobacilina i zwittermicin są przeciwgrzybiczne. Naturalna produkcja antybiotyków związana jest z rozpoczęciem przetrwalnikowania komórek Bacillus (więcej na temat produkcji antybiotyków przez szczepy Bacillus w rozdziale 5.5.3).

5.5.1. Bakterie z rodzaju Bacillus jako producent pozakomórkowych enzymów

Bakterie rodzaju Bacillus największą rolę odgrywają w przemyśle enzymatycznym. Preparaty enzymatyczne produkowane w oparciu o te bakterie to głównie proteazy (w tym subtylizyny) oraz enzymy amylolityczne. Stanowią one prawie 3/5 produkowanych w skali światowej preparatów enzymatycznych i są stosowane w produkcji detergentów (37%), przetwórstwie skrobiowym (13%), przemyśle tekstylnym (6%), spożywczym (15%) i produkcji pasz (8%). Firma Novo Pharmaceutical Co. (Kopenhaga) jako pierwsza uruchomiła na początku lat 60. przemysłową produkcję subtylizyny - enzymu obecnie powszechnie stosowanego jako składnik środków piorących i detergentów. Oprócz działającego dziś koncernu Novo-Nordisk, który wytwarza ok. 41-44% wszystkich preparatów enzymatycznych, produkowane są one przez firmę Genecor International (21%) oraz DSN N.V (8%) oraz liczne mniejsze firmy w Japonii, Chinach i Europie (27-30%).

Znanych jest już znacznie ponad 50 pozakomórkowych enzymów produkowanych przez różne bakterie rodzaju Bacillus. W tabeli 5.2 podano nazwy (obecnie zalecane) podstawowych enzymów wytwarzanych przez szczepy Bacillus.

Tabela 5.2. Ważne pozakomórkowe enzymy bakterii z rodzaju Bacillus

Gatunek

Enzym

Hydrolazy oligo- i polisacharydów

B. acidocaldarius

amylaza (E.C. 3.2.1.1); -galaktozydaza (E.C. 3.2.1.23)

B. acidopullulyticus

-amylaza (E.C. 3.2.1.2); 1,4--glukozydaza glukanowa (E.C. 3.2.1.3); pululanaza (E.C. 3.2.1.41); 1,4-maltohydrolaza glukanowa (E.C. 3.2.1.133)

B. amyloliquefaciens

-amylaza; celulaza (E.C.3.2.1.4); endo-1,3(4)--glukanaza glukanowa (E.C. 3.2.1.6); 1,4--glukozydaza glukanowa (E.C. 3.2.1.3); endo-1,4--ksylanaza (E.C. 3.2.1.8); licheninaza (E.C. 3.2.1.73); mannanaza (E.C. 3.2.1.25),

B. brevis

amylaza (termo-alkalostabilna); celulaza; licheninaza; -mannozydaza (E.C. 3.2.1.25)

B. cereus

amylaza; -amylaza; chitozanaza (E.C. 3.2.1.132); chitynaza (E.C. 3.2.1.14); -laktamaza (E.C.3.5.2.6); -mannozydaza

B. cellulolyticus

celulaza (Avicel*)

B. circulans

-amylaza; -amylaza; celulaza; chitozanaza; chitynaza (E.C. 3.2.1.14); endo-1,4--galaktozydaza arabinogalaktanu (E.C. 3.2.1.89); endo-1,3--D-glukozydaza glukanowa (E.C. 3.2.1.39); endo-1,6--glukozydaza glukanowa (E.C. 3.2.1.75); 1,4,--ksylanaza (E.C. 3.2.1.8); licheninaza; -mannozydaza; pululanaza (E.C. 3.2.1.41)

B. clausii

endo-1,3--D-glukozydaza

B. coagulans

-amylaza (termostabilna); chitozanaza; cyklomaltodekstrynaza (E.C. 3.2.1.54); -galaktozydaza; oligo-1,6-glukozydaza (E.C. 3.2.1.10)

B. firmus

celulaza; ksylanaza

B. halodurans

-galaktozydaza (E.C. 3.2.1.22); pululanaza; ksylanaza; pektynaza

B. licheniformis

-amylaza; celulaza; chitynaza; endo-1,3(4)--glukanaza (E.C. 3.2.1.6); endo-1,4--galaktozydaza arabinogalaktanu; -glukozydaza (E.C. 3.2.1.20); licheninaza; -mannozydaza

B. macerans

-amylaza; -galaktozydaza; endo-1,3(4)--glukanaza; licheninaza; pululanaza

B. megaterium

-amylaza (alkaliczna); dekstranaza (E.C. 3.2.1.11); -mannozydaza

B. polymyxa

-amylaza; celulaza; -1,3-glukanaza; -glukozydaza; ksylanaza; licheninaza; -mannozydaza; neopullulanaza

B. pumilus

-N-arabinofuranozydaza termostabilna (E.C.3.2.1.55); celulaza; chitozanaza; 1,4--ksylozydaza ksylanowa (E.C. 3.2.1.37); licheninaza

B. stearothermophilus

-amylaza; -N-arabinofuranozydaza; endo-1,5--arabinozydaza arabinianowa (E.C. 3.2.1.99); -1,4-maltohydrolaza glukanowa (E.C. 3.2.1.133)

B. subtilis

-amylaza; -N-arabinofuranozydaza (E.C. 3.2.1.55); endo-1,5--arabinozydaza arabinianowa; celulaza (alkalostabilna); endo-1,4--galaktozydaza arabinogalaktanu; -1,3-glukanaza; -glukozydaza (E.C. 3.2.1.20); -glukozydaza; endo-1,3--D-glukozydaza; dekstranaza; ksylanaza; lewanaza (E.C. 3.2.1.65); licheninaza; -mannozydaza

B. thetaiotaomicron

neopululanaza (E.C.3.2.1.135)

Bacillus sp.

agaraza (E.C. 3.2.1.81); -amylaza; chitosanaza (E.C. 3.2.1.123); cyklomaltodekstrynaza (E.C. 3.2.1.54); -1,4-galakturonidaza galakturanu (E.C. 3.2.1.67); izoamylaza (E.C. 3.2.1.68); -1,4-maltoheksaonidaza glukanu (E.C. 3.2.1.98)

Hydrolazy peptydowe

B. alcalophilus

subtylizyna (alkaliczna proteinaza serynowa), E.C. 3.4.21.62

B. amyloliquefaciens

metaloproteinaza (E.C. 3.4.24.4); subtylizyna (BPN')

B. brevis

subtylizyna

B. cereus

bacillolizyna, zwyczajowo metalopeptydaza termolizyno-podobna, E.C.3.4.24.28

B. clausii

proteaza alkaliczna (Savinase*)

B. lentus

subtylizyna (wybitnie alkaliczna) (BL)

B. licheniformis

endopeptydaza glutamylowa (E.C. 3.4.21.82); subtylizyna (Carlsberg) (preparaty Alcalase* lub Maxatase*);

B. megaterium i polymyxa

metaloproteinaza

B. pumilus

subtylizyna, esteraza acetyloksylanowa (E.C.3.1.1.72)

B. subtilis

tripeptydaza (E.C.3.4.11.4); bacillolizyna,; subtylizyna

B. stearothermophilus

bacillolizyna,

Bacillus sp.

aminoacylaza; aminopeptydaza leucynowa (E.C.3.4.1.1); proteaza halofilna (szczep halofilny); subtylizyna

B. thermoproteolyticus

termolizyna lub termostabilna neutralna proteaza (E.C. 3.4.24.27)

Nukleazy, penicylinazy i fosfatazy

B. anthracis

-laktamaza (penicylinaza) E.C. 3.5.2.6

B. amyloliquefaciens

alkaliczna fosfataza (E.C. 3.1.3.1); DNA-aza typ II (E.C. 3.1.21.4); 3-fitaza (E.C. 3.1.3.8), 4-fitaza (E.C. 3.1.3.26); rybonukleaza T1 (E.C. 3.1.27.3) i T2 (E.C. 3.1.27.1); barnaza (E.C. 3.1.27.5);

B. cereus

alkaliczna fosfataza; deoksyrybonukleotydo-rybonukleaza;
5'-nukleotydaza (E.C. 3.1.3.5); -laktamaza,

B. intermedius

alkaliczna fosfataza

B. licheniformis

3-fitaza; 4-fitaza; -laktamaza,

B. megaterium

-laktamaza; acylaza penicylinowa (E.C. 3.5.1.4); 5-nukleotydaza

B. sphaericus

acylaza penicylinowa

B. subtilis

DNA-aza I (E.C. 3.1.21.1); alkaliczna fosfataza; -laktamaza; egzodeoksyrybonukleaza (E.C. 3.1.11.5); 5'-nukleotydaza

Enzymy bakteriolityczne**)

B. alvei

endo--N-acetyloglukozaminidaza mannozylo-glikoproteiny (E.C. 3.2.1.96)

B. circulans

endo-1,3--D-glukozydaza glukanowa (E.C. 3.2.1.39)

B. clausii

endo-1,3--D-glukozydaza glukanowa

B. licheniformis

amidaza N-acetylomuramylo-L-alaninowa (E.C. 3.5.1.28)

B. stearothermophilus

-N-acetylo heksozaminidaza (E.C. 3.2.1.52)

B. subtilis

endo-N-acetyloglukozoaminidaza, egzo-N-acetylo-glukozoaminidaza, -N-acetylo heksozaminidaza, endo-N-acetylomuramidaza, amidaza N-acetylomuramylo-L-alaninowa, endo-1,3--D-glukozydaza glukanowa

Inne enzymy

B. acidocaldarius

karboksyloesteraza (E.C. 3.1.1.1)

B. alcalophilus

glukanotransferaza cyklomaltodekstrynowa, GTCD (E.C. 2.4.1.19)

B. amyloliquefaciens

lewanosacharaza (E.C. 2.4.1.10);

B. cereus

fosfolipaza C (E.C. 3.1.4.3)

B. circulans

GTCD; karboksyloesteraza (E.C. 3.1.1.1); lewanosacharaza; liaza pektynowa (E.C. 4.2.2.10); liaza poli(-D-mannuronianowa) E.C. 4.2.2.3; liaza poli(-D-guluronianowa) E.C. 4.2.2.11

B. coagulans

GTCD; izomeraza glukozowa (E.C. 5.3.1.18)

B. halophilus

GTCD

B. licheniformis

GTCD; izomeraza ksylozowa (E.C. 3.5.1.5); liaza pektynianowa (E.C.4.2.2.2); lipaza (E.C. 3.1.1.3); tannaza (E.C. 3.1.1.20)

B. lentus

GTCD

B. macerans

4--glukanotransferaza (E.C.2.4.1.25); GTCD; liaza pektynowa (E.C. 4.2.2.10); liaza pektynianowa

B. polymyxa

liaza pektynowa

B. pumilus

esteraza acetyloksylanu (E.C. 3.1.1.72); liaza pektynowa

B. sphaaericus

liaza pektynowa

B. subtilis

3-fitaza; 4-fitaza; katalaza; lewanosacharaza; liaza pektynowa; lipaza

B. stearothermophilus

lipaza

B. thiaminolyticus

tiaminaza (E.C. 2.5.1.2)

B. thuringiensis

fosfolipaza C

Wyjaśnienia: * -handlowa nazwa preparatu; **) enzymy powodujące naruszenie struktury ściany komórkowej drobnoustrojów; GTCD - glukanotransferaza cyklomaltodekstrynowa

Do najważniejszych należą alkaliczne serynowe proteinazy (subtylizyny) i obojętne proteazy oraz -amylaza. Roczna produkcja tylko jednej z subtylizyn, typu Carlsberg, wytwarzanej przez B. licheniformis (a także B. pumilus i B. subtilis) sięga 500 000 ton rocznie, enzym stosowany jest już standardowo jako składnik proszków do prania. Amylazy Bacillus (licheniformis, halodurans) są szeroko wykorzystywane w procesach upłynniania skrobi z uwagi na ich stabilność (ok. 5 min.) w temp. 105-110oC. Ważnym enzymem wytwarzanym przez B. coagulans jest izomeraza glukozowa znajdująca zastosowanie w końcowym etapie przetwarzania skrobi w produkty słodzące, np. w konwersji syropów glukozowych w fruktozowe. Właściwości wielu z białek enzymatycznych (najczęściej tych o znanej budowie i strukturze przestrzennej), modyfikuje się by nadać im cechy optymalne dla danego zastosowania, wykorzystując metody przypadkowej i ukierunkowanej mutagenezy oraz ukierunkowanej ewolucji. Celem tych modyfikacji jest np. zmiana profilu pH-aktywności, zwiększenie stabilności w różnych warunkach (np. odporności na czynniki utleniające w przypadku enzymów stosowanych w detergentach) lub zmiana specyficzności substratowej (częsty sposób poprawy właściwości piorących subtylaz). Stosując techniki inżynierii genetycznej poprawia się również technologie wytwarzania preparatów enzymatycznych, np. zwiększa wydajność oczyszczania białek enzymatycznych z cieczy pohodowlanej poprzez niewielkie zmiany ich konformacji prowadzące np. do wydajniejszego związania ze złożem chromatograficznym. Równolegle poszukiwane są (szczególnie w środowiskach ekstremalnych) nowe enzymy wykazujące unikalne właściwości. Do ostatnio wykrytych należą enzymy pochodzące z ekstermofilnych szczepów Bacillus, m.in. termostabilne: pululanaza i neopululanaza, ksylanaza i -mannanaza, czy też wybitnie alkaliczne: glukanotransferaza cyklomaltodekstrynowa (stosowana w produkcji cylkodekstryn ze skrobi), ksylanaza (dla przemysłu papierniczego) a także -1,3-glukanaza, celulaza i karboksyloesteraza.

Szereg gatunków Bacillus jest również źródłem niezbędnych w pracach genetycznych enzymów restrykcyjnych. Używa się ich w biologii molekularnej do manipulacji fragmentów DNA. Bakterie te wytwarzają też kilka interesujących enzymów związanych z membranami komórkowymi (np. występujących w błonie cytoplazmatycznej, jak np. alkaliczna fosfataza u B. licheniformis). Niektóre z nich mogą być w odpowiednich warunkach uwalniane poza komórkę, jak np. proteinaza W czy bacillopeptydaza F, i zaliczane są wówczas do... zewnątrzkomórkowych (dawniej egzoenzymów).

Biosynteza i sekrecja zewnątrzkomórkowych enzymów Bacillus

Biosynteza większości zewnątrzkomórkowych hydrolaz produkowanych przez szczepy Bacillus indukowana jest w fazie przejściowej między wzrostem wegetatywnym i przetrwanym tych bakterii. W warunkach naturalnych powoduje to zwiększenie puli substratów i podtrzymuje wzrost komórek. Jednakże fizjologiczna rola większości enzymów zewnątrzkomórkowych u bakterii Bacillus do dzisiaj nie została do końca wyjaśniona. Bez wątpienia część z nich wyposaża komórkę bakteryjną w mechanizm pozwalający na otrzymywanie niezbędnych związków pokarmowych z egzogennych źródeł. Ekspresja genów kodujących niektóre z tych enzymów jest związana, lecz nie obligatoryjnie, ze sporulacją komórki (np. alkalicznej i obojętnej proteinazy) a innych z wyczerpaniem specyficznego substratu z pożywki (-amylaza, alkaliczna fosfataza). Nie wyklucza się, że np. proteinazy serynowe (w tym subtylizyna) są włączone w proces tworzenia spor a także ich kiełkowania.

Na powiązanie pomiędzy procesem tworzenia spor u bakterii z rodzaju Bacillus a biosyntezą subtylizyny zwrócono uwagę na podstawie obserwacji, że enzym pojawia się zawsze tuż przed sporulacją, w późnej fazie wykładniczej wzrostu kultury lub wczesnej stacjonarnej. Intensywna synteza pozakomórkowych proteinaz zachodzi wkrótce po inicjacji sporulacji, a maksymalne nagromadzenie subtylizyny następuje zwykle po 3 godzinach od momentu zakończenia fazy wykładniczej. Wynika to z faktu, że oba procesy (synteza subtylizyny i przetrwalnikowanie) są kontrolowane przez ten sam mechanizm. Zbadano, że czynnikiem regulującym u Bacillus subtilis i Bacillus licheniformis jest pula nukleotydów, a głównie poziom GTP w komórce. Inicjacja sporulacji spowodowana jest obniżeniem poziomu GTP w komórce, co uaktywnia transkrypcję genu spo0A (u asporogennych mutantów spo0‾ sporulacja jest zatrzymywana w fazie 0). Przypuszcza się, że produkt genu spo0A odgrywa podstawową rolę jako regulator globalnych procesów komórkowych, w tym również w dalszych fazach sporulacji jak i regulacji biosyntezy subtylizyny.

Większość pozakomórkowych enzymów syntetyzowanych przez bakterie z rodzaju Bacillus zaliczanych jest do kategorii indukcyjnych. Typowe enzymy indukcyjne powstają w komórce zawsze, ale pod nieobecność substratu jedynie w nieznacznych ilościach (tzw. poziom bazowy). Ta minimalna ilość enzymu wystarcza do oddziaływania na wielkocząsteczkowy, egzogenny substrat (jeśli jest on obecny w podłożu). W wyniku jego degradacji, uwalnia się bezpośredni induktor, który wnika do komórki i włącza się w mechanizm transkrypcji. W obecności induktora ilość syntetyzowanego enzymu może wzrosnąć nawet 1 000-krotnie. Z reguły natychmiast po wprowadzeniu substratu do podłoża (o ile komórka zwolniona jest z represji katabolicznej) uruchamiany jest mechanizm indukcyjny. W momencie wyczerpania się substratu, ilość produkowanego enzymu zmniejsza się do poziomu bazowego.

Biosynteza kilku pozakomórkowych enzymów bakterii Bacillus (w tym -amylazy i subtylizyny) odbiega od tego schematu. Po pierwsze, obecność białka w podłożu hodowlanym Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis czy też Bacillus subtilis zwiększa jedynie kilkakrotnie wydajność syntezy subtylizyny. Po drugie, intensywna produkcja tego enzymu (i innych pozakomórkowych proteinaz) niezależnie od momentu wprowadzenia białka do podłoża hodowlanego, rozpoczyna się dopiero tuż przed sporulacją. Ponadto alkalifilne szczepy bakterii z rodzaju Bacillus produkują subtylizynę w zbliżonych ilościach, niezależnie od ilości białka w podłożu i od formy źródła azotu - nawet nieorganiczne źródła N sprzyjają tworzeniu enzymu.

Obok indukcji, drugim podstawowym procesem regulującym metabolizm bakterii z rodzaju Bacillus na poziomie genetycznym jest represja. Represja kataboliczna polega na nieustannym hamowaniu biosyntezy enzymów w podłożach zawierających glukozę lub inne łatwo przyswajalne źródła węgla.

W klasycznym mechanizmie represji katabolicznej wykrytym u E. coli, centralną rolę odgrywa cykliczny AMP (cAMP). Jednakże u bakterii z rodzaju Bacillus nie znaleziono cyklazy adenylowej i stąd nie stwierdza się w komórkach obecności cAMP. Tym niemniej również u tych bakterii opisano wiele przykładów hamującego wpływu glukozy lub innych łatwo metabolizowanych źródeł węgla (tych, za których transport do komórki przez membranę cytoplazmatyczną odpowiada tzw. system fosfotransferaz, PTS), na syntezę zewnątrzkomórkowych enzymów. Na przykład glukoza i inne łatwo przyswajalne źródła węgla hamują biosyntezę -amylazy i proteinaz u bakterii Bacillus licheniformis i Bacillus subtilis. Jak wcześniej wspomniano, centralną rolę regulatora globalnych procesów komórkowych u bakterii Bacillus pełni gen spo0A, kontrolowany przez poziom GTP w komórce. Przyjmuje się, że ilość GTP w komórkach bakterii Bacillus zależy od stężenia dostępnej glukozy i stąd jej regulacyjny wpływ na wiele komórkowych procesów (m.in. sporulację, transport białek oraz syntezę większości pozakomórkowych i części wewnątrzkomórkowych enzymów). Wiele danych wskazuje również, że represja glukozowa u części gatunków bakterii z rodzaju Bacillus może być częściowo związana ze zmianą powinowactwa polimerazy RNA do matrycy DNA. U bakterii B. subtilis zidentyfikowano trzy składniki (sekwencje nukleotydowe) odpowiedzialne za represję kataboliczną powodowaną przez łatwo metabolizowane źródła węgla, które transportowane są do komórki w postaci ufosforylowanej, przez system PTS. Jedna z tych sekwencji (CRE - cis-acting catabolite repression element) umiejscowiona na przykład w genie promotora amylazy (AmyE) lub w genie struktury ksylanazy (xylA), stanowi miejsce wiązania kompleksu białka represorowego (produkt genu CcpA) z ufosforylowanym białkiem HPr(Ser-P) będącym składnikiem wspomnianego wyżej systemu fosfotransferaz. Znane są jednakże przykłady braku wpływu glukozy na biosyntezę enzymów zewnątrzkomórkowych u bakterii z rodzaju Bacillus, szczególnie u mutantów przemysłowych (są to mutanty ccpA-), które nie są wrażliwe na wysokie stężenia glukozy. Na przykład, niewrażliwy na kataboliczną represję mutant szczepu Bacillus licheniformis DSM 641 stosowany jest do produkcji subtylizyny. Dziki szczep tych bakterii produkował enzym na wysokim poziomie, ale jedynie wtedy, gdy stężenie glukozy było niskie i ściśle limitowane. Znane są też szczepy Bacillus produkujące -amylazę na podłożach zawierających glukozę lub inne łatwo przyswajalne związki węgla, np. galaktozę lub laktozę.

Biosynteza proteinaz oraz wielu innych enzymów działających na substraty zawierające azot jest silnie hamowana u niektórych szczepów Bacillus również przez jony amonowe. Regulatorowa funkcja pozakomórkowych jonów NH4+ podobna jest do wywoływanej przez glukozę w represji kataboliczno-glukozowej. Ogólnie biorąc represji podlega synteza białek uczestniczących w wykorzystywaniu przez komórkę złożonych organicznych związków azotu. Jednakże u Bacillus licheniformis i Bacillus subtilis biosynteza arginazy, histydynazy i dehydrogenazy alaninowej nie znajduje się pod kontrolą azotowej represji, enzymy te wytwarzane są bowiem w podłożach zawierających mocznik, NH4+, azotany czy glutaminian. Na biosyntezę pozakomórkowych proteinaz represyjne działanie wykazują również obecne w podłożu mieszaniny aminokwasów, szczególnie z glicyną.

Proces sekrecji białek zewnątrzkomórkowych, czyli wydzielania z komórki wytworzonych w niej białek, jest wysokospecyficzny i regulowany na wielu poziomach. Niezbędnym mechanizmem komórkowym jest system specyficznych translokaz - białek transportujących dane białko przez membranę cytoplazmatyczną. Proces sekrecji białek na zewnątrz komórki podzielić można na trzy podstawowe etapy:

  1. Wewnątrzkomórkowy. Polega na kierowaniu białek przeznaczonych do wydzielenia z komórki (a ściśle mówiąc prekursorów tych białek, które do N-końca przyłączone mają dodatkowe sekwencje peptydowe, tzw. peptydy sygnałowe) do systemu translokaz membranowych i związanie ich z tą „maszynerią transportującą”. Transportowane w cytoplazmie białka oddziałują zwykle z białkami chaperonowymi, które ewentualnie umożliwiają ich ufałdowanie lub utrzymują je w stanie nie ufałdowanym, jednocześnie zabezpieczając je przed agregacją. Wielkość peptydów sygnałowych u Bacillus waha się od 18 do 35 reszt aminokwasów, a fragment ich C-końca jest rozpoznawany przez specyficzną peptydazę (tzw. peptydazę sygnałową), która „odcina” go w trzecim etapie sekrecji danego białka. Co więcej wiele białek wydzielanych z komórek Bacillus wytwarzanych jest w postaci pre-pro-białek, które zawierają oprócz sekwencji sygnałowej (pre-) dodatkową sekwencję (pro-) różnej długości, np. dla -amylazy B. subtilis jest to tylko 8 aminokwasów a dla obojętnych proteinaz aż 200.

  2. Membranowy. Polega na translokacji (przemieszczeniu) białka przez membranę cytoplazmatyczną z wykorzystaniem odpowiednich mechanizmów transportujących. Zbadano, że białka, które nie uległy wcześniej ufałdowaniu w cytoplazmie transportowane są z wykorzystaniem mechanizmu Sec-translokazy, a białka ufałdowane - Tat-translokazy. Mechanizmy transportu są intensywnie badane, dotychczas poznano jeszcze trzy inne mechanizmy transportu białek przez membranę cytoplazmatyczną.

  3. Faza końcowa. Polega na usunięciu peptydu sygnałowego oraz specyficznej translokazy, ufałdowanie białek wcześniej nie ufałdowanych i przejście białka przez ścianę komórkową. Dotychczas w komórkach B. subtilis stwierdzono obecność kilku peptydaz sygnałowych typu I i II (odcinających peptydy sygnałowe). Fałdowanie białek odbywa się w przestrzeni między membraną a ścianą komórkową. W efekcie białko uzyskuje konformację aktywną biologicznie, niewrażliwą na ujemny ładunek ściany komórkowej (istotne podczas przechodzenia przez nią) oraz na zewnątrzkomórkowe proteazy. W przypadku transportu wielu białek z komórek B. subtilis proces ten wymaga obecności jonów Fe+3 i Ca+2 i/lub lipoproteiny PrsA.

Proces transportu białek przez błonę cytoplazmatyczną odbywać się może równolegle z ich biosyntezą (mechanizm sekrecji kotranslacyjnej) lub po jej zakończeniu (potranslacyjnie). Istnienie kotranslacyjnej sekrecji białek u Bacillus udowodniono badając między innymi wytwarzanie -amylazy u Bacillus subtilis i δ-laktamazy u Bacillus licheniformis. Natomiast mechanizm sekrecji wielu innych pozakomórkowych enzymów (w tym proteinaz) u bakterii z rodzaju Bacillus jest jeszcze słabo znany. Wiadomo już jednak, że subtylizyna wytwarzana jest w postaci prekursora zlokalizowanego w membranie komórkowej i występującego w około 1 000 miejscach w komórce. Prekursor tej proteinazy zostaje uwolniony z komórki dopiero po procesie „dojrzewania” (polegającym m.in. na odcięciu peptydów sygnalnych), dzięki autoproteolitycznym właściwościom samego enzymu.

Wydajność biosyntezy i sekrecji białek zewnątrzkomórkowych przemysłowych szczepów Bacillus jest podwyższana wieloma metodami. Między innymi wykonuje się przypadkowe i ukierunkowane mutagenizacje, stosuje techniki rekombinacyjne oraz modelowanie zarówno składu podłoża jak i komórkowych przepływów metabolicznych (tzw. inżynieria metabolizmu). Głównym etapem limitującym produkcję zewnątrzkomórkowych białek jest zwykle etap transkrypcji genu, będącego matrycą dla biosyntezy danego białka. Wykryto wiele aktywatorów i inhibitorów tego procesu dla poszczególnych białek zewnątrzkomórkowych. Na przykład transkrypcja genu apr (kodującego alkaliczną protezę u B. subtilis) kierowana jest szeregiem białek (nazwanych Hpr, Sin, SacU/Q, AbrB), które muszą się związać w odpowiednich miejscach regulatorowych tego genu, aby zachodziła wydajna jego transkrypcja. Wydajność wytwarzania i sekrecji białek natywnych przez szczepy przemysłowe sięga obecnie dziesiątek gramów w 1 litrze podłoża hodowlanego.

Technologia produkcji pozakomórkowych enzymów bakterii z rodzaju Bacillus

Technologia produkcji pozakomórkowych enzymów bakterii z rodzaju Bacillus dzieli się na dwa podstawowe etapy: proces biosyntezy enzymu i proces jego wyodrębniania z podłoża pohodowlanego. Biosyntezę prowadzi się przeważnie w oparciu o wgłębną, okresową hodowlę bakterii w klasycznych fermentorach (o objętości 200-300 m3), w ciekłych pożywkach o ściśle określonym składzie i przy zastosowaniu specyficznych dla każdego szczepu warunków fizycznych i chemicznych. Z jednej szarży można otrzymać 1-2 tony preparatów enzymatycznych.

Oprócz wyselekcjonowanych wysokowydajnych dzikich szczepów rodzaju Bacillus coraz częściej w dużej skali stosuje się różnego typu mutanty. Na przykład przemysłowe szczepy Bacillus stosowane w produkcji proteinaz są zazwyczaj asporogenne (nie wytwarzają przetrwalników), co zapewnia m.in. wydłużenie czasu produkcji enzymu przez komórki tym samym wzrost ich produktywności. Stosuje się też szczepy-mutanty auksotroficzne, np. antybiotykooporne lub auksotrofy aminokwasowe. W charakterze materiału posiewowego do fermentora, zazwyczaj stosuje się młode komórki będące w logarytmicznej fazie wzrostu. Ilość inokulum używana do zaszczepiania podłoża hodowlanego waha się w szerokich granicach, od 0,1-5% objętościowych, co zapewnia około 106 komórek bakterii w 1cm3 pożywki w fermentorze.

Skład podłoża hodowlanego musi zabezpieczać pokarmowe zapotrzebowanie komórek, z uwzględnieniem mechanizmów regulacji biosyntezy danego enzymu oraz ekonomicznej opłacalności procesu. Niewielkie zmiany stężenia niektórych, kluczowych dla biosyntezy wytwarzanego enzymu, składników podłoża mogą powodować znaczne polepszenie lub pogorszenie syntezy enzymu. Dlatego skład pożywek hodowlanych dobiera się (optymalizuje) indywidualnie dla każdego szczepu produkcyjnego.

Z substancji wchodzących w skład pożywek hodowlanych największy wpływ na syntezę pozakomórkowych enzymów bakterii Bacillus wywierają związki stanowiące źródła węgla oraz azotu. Pierwiastki te są bowiem głównymi składnikami produkowanych białek enzymatycznych (np. alkaliczne proteinazy zawierają około 16% N).

Źródło węgla stanowić mogą węglowodany zarówno w postaci poli- jak i monosacharydów. Stężenie skrobi i produktów jej hydrolizy w środowisku hodowlanym może wahać się od 0,1 do 15 % (w zależności od rodzaju szczepu). Jako źródło węgla w podłożach dla biosyntezy proteinaz stosuje się również maltozę, glicerol, laktozę, sacharozę, alkohole oraz sole organicznych kwasów. W praktyce przemysłowej, z uwagi na to, że wysokie stężenie węglowodanów obniża wydajność biosyntezy proteinaz dodaje się je porcjami, utrzymując odpowiedni ich poziom. Natomiast w procesie biosyntezy -amylazy źródłem węgla może być mąka kukurydziana, melasa buraczana lub trzcinowa, syrop kukurydziany, hydrolizaty skrobi ziemniaczanej oraz ziarna zbóż.

Jako źródło azotu w procesie biosyntezy pozakomórkowych enzymów przez bakterie Bacillus stosuje się przeważnie złożone substancje organiczne, często traktowane jako kompleksowe źródła azotu, węgla, witamin i mikroelementów. Należą do nich: serwatka, odpady sojowe, otręby zbożowe, mąka sojowa, ekstrakty oraz wyciągi kukurydzy (np. namok kukurydziany), soi, jęczmienia, itp. Niekiedy dodaje się mączkę rybną lub kiełki słodowe. Szeroko stosuje się pożywki, w których źródłem azotu są białka lub produkty ich hydrolizy: peptydy i aminokwasy. Bakterie Bacillus preferują jako źródło azotu glutaminę a inny aminokwas - glicyna, hamuje biosyntezę zarówno amylaz jak i proteaz.. W procesach biosyntezy proteinaz w podłożach hodowlanych dla bakterii Bacillus często stosuje się kazeinę lub żelatynę, a czasami peptony i polipeptony. Niekiedy dodatek (NH4)2SO4 lub KNO3 zwiększa produkcję proteaz. Dla alkalofilnych szczepow Bacillus sp. z powodzeniem można stosować w takich podłożach nieorganiczne źródła azotu (często fosforan lub siarczan amonu).

Generalnie, podłoża stosowane w przemysłowej produkcji alkalicznych proteaz zawierają duże ilości węglowodanów i białek (rzędu 100-150 g/L), dlatego istotnym elementem tych hodowli jest dodatek substancji zbijających pianę, szczególnie intensywnie powstającej w tych warunkach.

Do wzrostu i rozwoju bakterie z rodzaju Bacillus wymagają ponadto w niewielkich ilościach substancje biologicznie czynne, takie jak witaminy, zasady purynowe i pirymidynowe. Źródłem tych związków mogą być drożdże lub ich ekstrakt a także namok kukurydziany. Również do podłoża można dodawać wolne witaminy. Ważnym składnikiem pożywek hodowlanych dla bakterii z rodzaju Bacillus stosowanych w syntezie pozakomórkowych enzymów jest fosfor (np. podczas produkcji proteaz jego poziom sięgać winien 2 g w 1 litrze pożywki). Dodawany jest on najczęściej w postaci fosforanów potasu, które jednocześnie buforują środowisko hodowli. Stymulatorami wytwarzania enzymów są lub mogą być także jony metali Mn2+, Fe3+, Zn2+, Mg2+, Ca2+, Co2+ , Mb2+ oraz K+. Szczepy alkalofilne wymagają do wzrostu i sporulacji jonów Na+. Z wyjątkiem wapnia i niekiedy magnezu pozostałe jony metali, traktowane jako mikroelementy, w dostatecznej ilości są wprowadzane z innymi składnikami pożywki.

Podobnie jak skład pożywki, dla każdego szczepu bakterii z rodzaju Bacillus indywidualnie dobiera się fizyko-chemiczne warunki hodowli. Istotny wpływ na biosyntezę pozakomórkowych enzymów ma pH pożywki, które wpływa na komórkowe procesy enzymatyczne oraz transport wielu związków przez membranę cytoplazmatyczną. Większość szczepów bakterii rodzaju Bacillus podczas produkcji enzymów zewnątrzkomórkowych hoduje się w zakresie pH 6,5-7,5. Jedynie alkalofilne szczepy Bacillus (np. Bacillus alcalophilus, Bacillus firmus) wymagają środowiska alkalicznego (pH 8,5-11,0). Zmiany pH hodowli w trakcie syntezy danego enzymu mogą pokazywać kinetykę procesu jego biosyntezy (np. rozpoczęcie i zakończenie wytwarzania przez komórki proteaz).

Temperatura hodowli bakterii z rodzaju Bacillus ma również bardzo duży wpływ na wzrost kultury i syntezę pozakomórkowych enzymów, choć nie do końca znane są mechanizmy odpowiedzialne za ten wpływ. Zależnie od szczepu, hodowle prowadzone są w temperaturze od 28°C aż do 55-60°C. Optymalna temperatura dla wzrostu bakterii często nie pokrywa się z optymalną dla biosyntezy enzymu. Na przykład Bacillus mesentericus najlepiej rozwija się w 42°C, podczas gdy maksymalna synteza subtylizyny występuje w 28°C. Bacillus megaterium najlepiej rośnie w przedziale temperatur 35-38°C, a metaloproteinazę najefektywniej wytwarza w 31°C. W wysokiej temperaturze, ok. 60°C, wydajnie wytwarzane są zewnątrzkomórkowe enzymy przez bakterie B. stearothermophilus.

Stężenie rozpuszczonego tlenu (pO2) w podłożu jest kolejnym ważnym czynnikiem wpływającym na szybkość i intensywność biosyntezy enzymów przez bakterie Bacillus. Stężenie to regulować można zarówno ilością doprowadzanego powietrza jak i szybkością mieszania. Dla każdego fermentora i procesu w nim prowadzonego optymalne parametry napowietrzania (aeracji) dobiera się indywidualnie. Ilość doprowadzonego powietrza z reguły waha się w granicach 0,7-1,0 vvm (objętość powietrza na objętość podłoża na minutę). Zapotrzebowanie na tlen zwiększa się w fazie logarytmicznego wzrostu bakterii oraz na początku sporulacji i dlatego w tych okresach konieczne jest zwiększenie ilości dostarczanego powietrza. Zbyt małe napowietrzanie hodowli jest powodem niskich wydajności syntezy alkalicznych proteaz. Szybkość obrotów mieszadła zależy od typu stosowanego fermentora. Z reguły korzystna jest regulacja obrotów mieszadła w trakcie procesu na podstawie eksperymentalnie ustalonego zapotrzebowania bakterii na tlen rozpuszczony w podłożu w danym momencie hodowli.

Po zakończeniu hodowli bakterii w fermentorze, wytworzony enzym wyodrębnienia się z podłoża pohodowlanego na drodze wirowania lub filtracji, które mają na celu oddzielenie komórek bakterii i innych stałych składników podłoża. Filtrat lub supernatant poddaje się ogólnie stosowanym procedurom zatężania (najczęściej stosując metody ultrafiltracyjne) i ewentualnie oczyszczania białek. Jeśli zanieczyszczenia zawarte w preparacie nie wpływają negatywnie na katalityczne właściwości enzymu oraz nie stanowią toksykologicznego zagrożenia dla konsumenta nie zachodzi wówczas konieczność poddawania ich drogim procesom oczyszczania. Głównie, przeznaczenie enzymu decyduje o formie i stopniu czystości jego handlowych preparatów. Preparaty wykorzystywane w celach analitycznych charakteryzują się najwyższą czystością (niekiedy są one homogennym białkiem enzymatycznym, którego cena jest bardzo wysoka). Również enzymy/białka stosowane w farmacji posiadają wysoką czystość. Natomiast te same enzymy przeznaczone dla przemysłu spożywczego lub chemicznego nie wymagają już tak wysokiego stopnia czystości i są tym samym wielokrotnie tańsze. Dla niektórych technologii nie muszą być nawet wyjaławiane. Praktycznie najczęściej wytwarza się preparaty enzymatyczne przeznaczone dla konkretnego procesu, dobierając ich aktywność katalityczną tak, aby dodana ilość preparatu mieściła się w zakresie 0,05-0,5 % na kg substratu.

5.5.2. Owadobójcze deltaendotoksyny

Na przestrzeni ostatniego półwiecza zużycie chemicznych środków owadobójczych podwaja się co 10 lat. Stosuje się je do zwalczania szkodników upraw oraz owadów roznoszących rozmaite choroby. Jednakże poważną wadą tych substancji jest ich mała specyficzność w stosunku do żywych organizmów. Stąd, mogą powodować liczne zatrucia ludzi i zwierząt. Ponadto likwidują nie tylko szkodniki, ale również pożyteczne owady, w tym naturalnych wrogów danego szkodnika. Wiele z tych związków jest trudno biodegradowalnych i ich stężenie w wielu regionach niepokojąco rośnie, powodując zachwianie równowagi w naturalnych ekosystemach.

Od 25 lat alternatywą dla stosowania owadobójczych substancji chemicznych stały się biopestycydy. Najlepiej poznanym i szeroko stosowanym biopestycydem są białka δ-endotoksyn otrzymywane z hodowli różnych odmian bakterii Bacillus thuringiensis (Bt). Ta pospolita bakteria glebowa najczęściej spotykana jest w pyle zbożowym zalegającym silosy i inne pomieszczenia służące do przechowywania zboża. Ustalono, że istnieją tysiące odmian B.thuringiensis. Każda odmiana w trakcie sporulacji produkuje własne unikalne kryształy insektycydowego białka, które są odkładane w komórkach poza przetrwalnikiem. Insektycydowa aktywność toksyn z każdej odmiany Bt różni się. Dlatego też, zespół Bt delta-endotokyn atakuje rozmaite gatunki z rzędów chrząszczy (Coleoptera), ciem i motyli (Lepidoptera) czy much i moskitów (Diptera). Niektóre Bt delta-toksyny wykazują skuteczność toksycznego działanie na równi z syntetycznymi pestycydami (np. organofosforowymi). W odróżnieniu od organofosforowych pestycydów, które wykazują działania ogólne, Bt toksyny są bardzo wąsko specyficzne; wykazują skuteczność jedynie w stosunku do pewnych szkodliwych insektów i tym samym są bezpieczne dla większości nieszkodliwych, a nawet pożytecznych insektów i innych zwierząt. Ponadto Bt toksyny są biodegradowalne i nie zaśmiecają środowiska.

Poznano 34 podgatunki B.thuringiensis. Najbardziej wśród nich rozpowszechnione to: podgatunek kurstaki (przeciw Lepidoptera), israelensis (przeciw Diptera, głównie moskitom i czarnym muchom) i podgatunek tenebrionis (przeciw Leptinotarsa decemlineata, czyli stonce ziemniaczanej). Dwie główne grupy insektycydowych białkowych kryształów produkowanych przez odmiany tych bakterii zostały zidentyfikowane jako: Cyt (cytolizyny) i Cry (kryształy delta-endoksyn). W roku 1989 zdefiniowano cztery klasy genów Cry i dwie klasy genów Cyt. Toksyny CryI i CryII są aktywne przeciw ćmom i motylom, CryII i CryIV są przeciw muchom i moskitom a toksyna CryIII przeciw chrząszczom. Toksyny Cyt są aktywne w stosunku do much, moskitów oraz chrząszczy i ponadto przeciwko prawdziwym robakom (hemipterans) oraz karaluchom i termitom (dictyopterans). Toksyny CryIII są produkowane przez podgatunki B.thuringiensis zwane tenebrionis i tolworthi a CryIV przez israelensis. Ogólnie, nie znaleziono dotychczas jakiejś wyraźnej korelacji pomiędzy rodzajem toksyny a produkującym ją podgatunkiem bakterii. Toksyny Cry wiążą się ze specyficznymi receptorami komórkowymi środkowego fragmentu przewodu pokarmowego insektów. Toksyny Cyt, w odróżnieniu od toksyn Cry, nie rozpoznają specyficznych miejsc wiązania.

Delta-endotoksyny dzieli się ze względu na specyficzność w stosunku do poszczególnych rzędów owadów na cztery klasy: od CryI do CryIV; a te dalej - na podklasy i odmiany. Przykładowo białko δ-endotoksyny CryIA(c) jest toksyczne względem wielu owadów z rzędu Lepidoptera, ale tylko dla trzech gatunków z rodziny Torticidae (zwójki). Ta ukierunkowana specyficzność δ-endotoksyn ma najprawdopodobniej związek z ich wiązaniem się z odpowiednimi receptorami na powierzchni komórek nabłonka jelita danego owada. Brak receptorów rozpoznających określone toksyny decyduje o niewrażliwości owadów.

Bacillus thuringiensis bezpośrednio powoduje śmiertelność insektów. Podobny skutek wywołują toksyny z rozmaitych odmian tych bakterii w następstwie podobnego sposobu działania. Po połknięciu przez insekta, kryształy delta-endotoksyn rozpuszczają się w jego środkowym fragmencie przewodu pokarmowego, uwalniając prototoksynę, z której są zbudowane. Ta dalej proteolitycznie przetwarzana jest do fragmentów, które wiążą się z błonami pokrywającymi wnętrze przewodu pokarmowego. Aktywne białka zakłócają osmolityczną równowagę tych komórek przez tworzenie por w membranach komórkowych prowadząc do lizy komórek. Jelito staje się sparaliżowane i insekt przestaje spożywać pokarm i większość z nich ginie w przeciągu kilku godzin. Toksyczność wspomnianych fragmentów toksyn w stosunku do danego insekta zależy od powinowactwa wiązania się z membranami komórkowymi.

B. thuringiensis po raz pierwszy na skalę przemysłową został zastosowany we Francji w 1938 roku. W Stanach Zjednoczonych jego handlowe znaczenie datuje się od 1950 roku. Od wiele lat, w formie aerozolu stosowany jest powszechnie przy uprawach roślin oraz do zwalczania owadów w leśnictwie. W latach 80-tych komercyjne zainteresowanie preparatami Bt bardzo szybko wzrosło, gdy okazało się, że wiele popularnych syntetycznych insektycydów staje się nieefektywnych z powodu wytworzenia się oporności insektów czy też nie nadaje się do użycia z powodu środowiskowych ograniczeń. Ponadto w tym samym czasie następuje rozwój inżynierii genetycznej. W 1987 roku pojawia się pierwszy raport o wbudowaniu genu kodującego biosyntezę delta-toksyn Bt do roślin. Pierwszymi (1993) transgenicznymi roślinami z ekspresją Bt toksyn były tytoń i pomidory. Dzisiaj, znaczące Bt transgeniczne uprawy obejmują kukurydzę, bawełnę, ziemniaki i ryż.

Równocześnie prowadzone są badania nad wyeliminowaniem kilku niekorzystnych cech dotychczas stosowanych preparatów. Chodzi tu głównie o zwiększenie ich trwałości, a także o wyeliminowanie z nich spor i niektórych metabolitów wtórnych (m.in. -egzotoksyny i hemolizyny, które mogą być toksyczne dla wielu organizmów). Badania te polegają na wprowadzaniu genów kodujących δ-endotoksyny Bacillus thuringiensis do innych komórek bakteryjnych (m.in. Pseudomonas fluorescens, Bacillus megaterium czy Bacillus sphaericus, który również produkuje swoiste toksyny (w stosunku do owadów z rzędu Diptera) lub na ich wprowadzaniu do roślin.

Również niektóre inne gatunki Bacillus (wspomniany już Bacillus sphaericus, Bacillus cereus, Bacillus popilliae, Bacillus larvae i Bacillus lentimorbis) wytwarzają toksyny o białkowej naturze, aktywne w zwalczaniu owadów.

5.5.3. Antybiotyki

0x08 graphic
Początek ery antybiotyków datuje się na rok 1929r., gdy A. Fleming zaobserwował hamujący wpływ grzyba Penicillium notatum na wzrost bakterii Staphylococcus. W 1942r. wyizolowana została z Penicillium notatum penicylina, a z bakterii Bacillus brevis tyrotrycyna. W następnych latach odkryto wiele innych antybiotyków. Obecnie w lecznictwie stosuje się ich około 100. Niektóre z nich wytwarzane są w oparciu o wgłębną hodowlę bakterii Bacillus. Jako przykład można wymienić gramicydynę S, pierścieniowy dziesięciopeptyd wytwarzany przez Bacillus brevis. Gramicydynę S stosuje się jako składnik maści i roztworów używanych zewnętrznie do leczenia owrzodzeń oraz zainfekowanych ran i oparzeń.

Bakterie Bacillus brevis wytwarzają jeszcze inne antybiotyki, m.in. tyrocydyny A, B i C (główne składniki tyrotrycyny), będące również cyklicznymi oligopeptydami, zawierającymi -D-fenyloalaninę, podobnie jak gramicydyna S. Znanych jest obecnie ponad 25 antybiotyków wytwarzanych przez różne szczepy tych bakterii.

Innym przykładem antybiotyku o budowie peptydowej jest bacytracyna, wytwarzana na skalę przemysłową (m.in. w PZF „POLFA” w Pabianicach) w oparciu o hodowlę bakterii Bacillus subtilis.

Bacytracyna jest mieszaniną spokrewnionych ze sobą cyklicznych peptydów wytwarzanych przez bakterie Bacillus licheniformis i Bacillus subtilis. Mieszanina ta zawiera co najmniej 10 komponentów, z których tylko najbardziej znaczący, bacytracyna A, i jej utleniony odpowiednik, 0x08 graphic
bacytracyna F, mają w pełni zdefiniowaną strukturę chemiczną.

Bacytracyna F powstaje z bacytracyny A: na drodze oksydatywnej zostaje usunięta grupa aminowa a tiazolowy pierścień ulega odwodornieniu. Wiadomo również, że bacytracyna B posiada trzy zmienione miejsca w stosunku do bacytracyny A (między innymi izoleucyna została zastąpiona waliną).

Bacytracyna w postaci soli cynkowej, a także w kombinacji z innymi antybiotykami (przeważnie polimyksyną B i neomycyną) jest używana w maściach (np. o nazwie handlowej „Neosporin” USA) w leczeniu infekcji skóry i oczu, a także zapobiegawczo przeciw infekcjom ran. Skuteczna jest przeciwko bakteriom Gram-dodatnim (gronkowce, paciorkowce), pałeczkom beztlenowców i niektórym pierwotniakom. Jest inhibitorem fosfatazy lipidowej. Używana bywa także, jako dodatek do paszy dla drobiu, świń, bydła i zwierząt futerkowych (z wyłączeniem królików).

Poszczególne szczepy bakterii Bacillus subtilis, obok bacytracyny, produkują ponad 65 innych antybiotyków o budowie polipeptydowej. Jednym z lepiej poznanych jest subtilina (podobna do bacytracyny), antybiotyk o wysokiej aktywności w stosunku do bakterii gram-dodatnich i rozmaitych patogennych grzybów. Należy do grupy lantibiotyków, czyli antybiotyków peptydowych zawierających lantioninę - bis(2-amino-2-karboksyetylo)siarczek - o wzorze chemicznym HOOC-CH(NH2)-CH2-S-CH2-CH(NH2)-COOH.

0x08 graphic
Z kolei Bacillus polymyxa wytwarza polimiksyny. Z punktu widzenia budowy chemicznej przypominają one peptydy. DAB jest kwasem α,γ-diaminomasłowym, połączony z innymi aminokwasami wiązaniami peptydowymi. Stąd antybiotyki te zalicza się do polipeptydowych.

Polimiksyny należą do antybiotyków o wąskim zakresie działania, działają jedynie na bakterie Gram-ujemne. Jednakże charakteryzują się silnymi właściwościami bakteriobójczymi.

Tabela 6.1. Antybiotyki produkowane przez bakterie z rodzaju Bacillus

Gatunek

Produkowany antybiotyk

B. brevis

gramicydyna, tyrotrycyna i inne

B. cereus

cereksyna, zwittermycyna, i inne,

B. circulans

cyrkulina, butyrozyna

B. colistinus

kolistyna

B. laterosporus

laterosporyna

B. licheniformis

bacytracyna, surfaktyna

B. polymyxa

polimiksyna

B. pumilus

pumulina

B. subtilis

bacytracyna, polimiksyna, difficydyna, surfaktyna, subtilina, mykobacilina, i inne

Antybiotyki bakterii z rodzaju Bacillus wykazują pełny przedział antymikrobiologicznej aktywności: bacytracyna, pumulina, laterosporyna, gramicydyna i tyrocydyny są efektywne przeciw Gram-dodatnim bakteriom; kolistyna i polimiksyna są anty-Gram-ujemne; difficydyna posiada szerokie spektrum działania; a mykobacilina i zwittermycyna są przeciw grzybom. Ich działanie jest różne. Niektóre blokują syntezę ściany komórkowej lub zakłócają funkcje błon biologicznych, inne, mniej liczne, zakłócają replikację, transkrypcję lub translację.

Wyjątkowy wśród bakterii z tego rodzaju jest Bacillus circulans, który syntetyzuje butyrozynę - antybiotyk aminoglukozydowy. Na drodze biotransformacji otrzymuje się obecnie z niego jeden z najefektywniejszych mutasyntetycznych antybiotyków, jakim jest amikacyna.

5.5.4. Nukleotydy purynowe

Nukleozydy i nukleotydy purynowe znalazły zastosowanie w medycynie i jako środki poprawiające smak. Nukleotydy: kwas guanylowy (guanozyno-5'-fosforan - GMP), kwas inozynowy i kwas ksantynowy są produkowane głównie w oparciu o hodowle Corynebacterium glutamicum, ale alternatywną drogą jest użycie Bacillus subtilis syntetyzującego nukleozydy i ich późniejsza chemiczna fosforylacja.

Biosynteza rybonukleotydów purynowych u Bacillus subtilis podlega złożonej inhibicji na zasadzie sprzężenia zwrotnego i represji końcowym produktem. Jedynie mutanty odporne na efekt sprzężenia zwrotnego są wykorzystywane do celów produkcyjnych. Do przemysłowej produkcji inozyny używa się mutantów Bacillus subtilis K, u których nukleozyd łatwo przechodzi przez membrany komórkowe do podłoża hodowlanego. Wydajność większą niż 20g/dm3 uzyskuje się z zastosowaniem adenino-auksotrofowych mutantów.

Z kolei u guanozyno-produkcyjnych szczepów Bacillus subtilis, brakuje reduktazy GMP (EC 1.7.1.7). Mutanty te wywodzą się z producentów inozyny. Wydajność guanozyny w tym procesie jest nie mniejsza niż 8g/dm3.

Mutanty Bacillus subtilis stosowane do produkcji ksantyny są guanino-auksotrofami. Wydajność biosyntezy tego nukleozydu sięga nawet 15g/dm3.

5.5.5. Witaminy

W chwili obecnej jedynie niewielka ilość witamin produkowana jest komercyjnie przez hodowlę drobnoustrojów. Jednakże postęp w klonowaniu genów strukturalnych ryboflawiny, kobalaminy i biotyny w genomie bakterii Bacillus, w kombinacji z wykorzystaniem genetycznej i metabolicznej strategii rekonstrukcji, zapewnia potencjał skłaniający do wykorzystania szczepów Bacillus w produkcji witamin na skalę przemysłowa. Ponadto stwierdzono, że mutacja w operatorze ribO ryboflawinowego operonu, prowadzi do kilkakrotnej nadprodukcji ryboflawiny.

Do tradycyjnie używanych przemysłowych producentów witamin zalicza się wyższe grzyby (Ascomycetes), Eremothecium ashbyii i Ashbya gossypii. Jednakże, bakterie i drożdże mają przewagę nad nimi z uwagi na możliwość obwitego wzrostu i użycia prostych syntetycznych podłoży. Aktualnie rozważa się wykorzystanie trzech różnych mikroorganizmów do produkcji ryboflawiny: nitkowatego grzyba Ashbya gossypii; drożdży Candida famata i Bacillus subtilis. Dwa pierwsze mikroorganizmy w piątym dniu hodowli wytwarzają maksymalne ilości ryboflawiny na poziomie 20g/dm3. Corynebacterium ammoniagenes również nagromadza w podłożu ryboflawinę na poziomie 20g/dm3, ale w krótszym trzydniowym cyklu.

Bacillus subtilis, w optymalnych warunkach, zapewnia wydajność produkcji ryboflawiny na poziomie 30g/dm3 w ciągu trzech dni hodowli. W związku z tym, staje się najbardziej atrakcyjnym mikrobiologicznym producentem ryboflawiny.

5.5.6. Kwas poliglutaminowy

Kwas poliglutaminowy (PGA) jest anionowym naturalnym homopoliamidem, który jest zbudowany z jednostek kwasu D- i L-glutaminowego połączonych amidowym (ściśle biorąc peptydowym) wiązaniem pomiędzy aminowymi i karboksylowymi grupami. PGA jest rozpuszczalny w wodzie i, co najważniejsze, jest biodegradowalny. Znalazł zastosowanie w przemyśle spożywczym, kosmetycznym, w medycynie i w oczyszczalni ścieków. Specyficznym zastosowaniem PGA i jego pochodnych jest ich używanie jako zgęszczaczy, hemektantów nawilżających, krioprotektantów, nośników wielu leków, hydrożeli o wysokiej adsorbancji wody, flokulantów, absorbentów ciężkich metali i dodatku do pasz dla zwierząt.

Kilka gatunków bakterii z rodzaju Bacillus jest zdolnych do syntezy PGA, jednakże najintensywniej badane są Bacillus licheniformis i Bacillus subtilis.

Geny wymagane dla biosyntezy PGA udało się w ostatnim czasie (2002) sklonować w Bacillus subtilis. Charakterystyka produktów tych genów wskazuje, że syntetaza PGA (ligaza glutamylo-poliglutaminianowa - enzym z podpodklasy EC 6.3.2.) jest kluczowa dla biosyntezy PGA.

W przypadku Bacillus licheniformis ATCC 9945A w skali laboratoryjnej - bioreaktor o pojemności 2,5dm3 - wydajność biosyntezy PGA wynosi 35g z jednego litra podłoża. Uruchomiona w Japonii dla celów komercyjnych produkcja PGA w oparciu o hodowlę bakterii Bacillus subtilis F-2-01 pozwala osiągnąć wydajność powyżej 50g/dm3.

5.5.7. D-Ryboza

D-Ryboza jest często używana jako przyprawa poprawiająca smak żywności, farmaceutyk, kosmetyk, w zdrowej żywności, w leczeniu zawału mięśnia sercowego i bólu mięśni. Na możliwość mikrobiologicznej produkcji D-rybozy zwrócono uwagę stosunkowo późno, bo dopiero w 1997 roku. Jednakże już w 2000 roku światowa produkcja tego związku na drodze fermentacji sięga 2000 ton.

Mikroorganizmy, które wytwarzają D-rybozę są pozbawione transketolazy (EC 2.2.1.1) i/lub 3-epimerazy D-rybuluzo-fosforanowej (EC 5.1.3.1). Kilka szczepów Bacillus subtilis i Bacillus pumilus oraz ich mutanty produkują znaczące ilości D-rybozy. Dzięki rozwojowi inżynierii genetycznej i biotechnologii udało się w ostatnim czasie przekroczyć w 1dm3 podłoża 90g D-rybozy przy wyjściowym stężeniu glukozy 200g/dm3 przy jednoczesnym znaczącym skróceniu czasu hodowli bakterii i obniżeniu stężenia niepożądanych ko-produktów.

5.5.8. Rozmaite inne produkty z bakterii Bacillus spp.

Obok wyżej opisanych, bakterie z rodzaju Bacillus wytwarzają rozmaite inne produkty o znaczeniu przemysłowym. Niektóre z nich oraz ich zastosowanie przedstawiono w tabeli 5.5.

Tabela 5. Różnorodne produkty o znaczeniu przemysłowym z bakterii Bacillus.

Produkt

Zastosowanie

Gatunek bakterii Bacillus

δ-Endotoksyny

Biopestycydy, insektycydy

B .thuringiensis, B .sphaericus, B .popilliae, B .lentimorbus

Nukleotydy purynowe

Środki poprawiające smak żywności oraz medycyna

B. subtilis

Ryboflawina

Witaminowy składnik zdrowej żywności

B. subtilis

Kwas poliglutaminowy (PGA)

Biopolimer, zagęszczacz, przemysł spożywczy, kosmetyczny, medycyna

B. subtilis

D-Ryboza

Przyprawa poprawiająca smak żywności, zdrowa żywność, farmaceutyk, kosmetyk,

B. subtilis, B. pumilus

Taumatyna

Super słodkie białko - środek słodzący

B. subtilis

Polihydroksymaślan (PHB)

Biodegradowalny plastik

B. megaterium

Streptawidyna

Białko o wysokim powinowactwie do biotyny. Testy immunoenzymatyczne i w biologii molekularnej.

B. subtilis

2-Acetylo-1-pirolina

Naturalne środki smakowe i zapachowe.

B. cereus

Taumatyna jest super słodkim monomerycznym białkiem o masie 22 kDa z afrykańskiej rośliny Thaumatococcus daniellii. Występuje pięć form taumatyny, ale najobficiej występują formy I i II. Formy I i II taumatyny stanowią pojedyncze łańcuchy polipeptydowe zbudowane z 207 reszt aminokwasów, które różnią się między sobą jedynie pięcioma aminokwasami. Taumatyna jest potencjalnym niskokalorycznym substytutem cukru stosowanym jako substancja słodząca (E 957).

Gen taumatyny II z Thaumatococcus daniellii transformowano do bakterii Bacillus subtilis. Do transformacji użyto wektor plazmidowy, który zawierał cDNA taumatyny II pod kontrolą promotora α-amylazy i rybosomalny 35S RNA. U bakterii tych dokonano ekspresji transformowanego genu.

Polimer polihydroksymaślan (PHB) dodany do leku utrzymuje stałe jego stężenie w organizmie oraz kieruje go dokładnie w miejsce, w którym jest potrzebny. Polimer umożliwia kontrolowane stałe uwalnianie leku. Dzięki temu można np. podawać mniej antybiotyków. Leki antyrakowe są z kolei kierowane dokładnie do chorych komórek, co oznacza mniejsze skutki uboczne. PHB występuje naturalnie w przyrodzie - jest syntetyzowany m.in. w ludzkim organizmie i roślinach. Dzięki temu jest bioakceptowalny, biodegradowalny i biokompatybilny - czyli ani on sam, ani produkty jego rozkładu nie są szkodliwe dla człowieka.

PHB otrzymuje się metodą polimeryzacji β-butyrolaktonu z zastosowaniem nowoczesnych inicjatorów supramolekularnych. Alternatywną metodą jest produkcja oparta o hodowle drobnoustrojowe. Np. Bacillus megaterium nagromadza w komórkach w 14 dniu hodowli w podłożu zawierającym 5% melasy kwas polihydroksymasłowy w ilości ponad 3,4g/dm3 podłoża. Szczep jest tak skonstruowany, że po zakończeniu hodowli następuje samouszkodzenie komórek i PHB jest uwalniany do podłoża, z niego ekstrahowany i dalej czyszczony. Gotowy polimer PHB jest tańszy niż antybiotyk, do którego jest dodawany.

Streptawidyna jest tetramerycznym białkiem (4x13kDa), które ma rozmaite biochemiczne zastosowania. Wykazuje wysokie powinowactwo do biotyny i biotynylowanych cząstek. Każdy monomer wiąże jedną molekułę biotyny. To powoduje, że powierzchnie pokryte streptawidyną są idealne do wiązania małych cząstek takich jak peptydy i oligonukleotydy. Płytki ze streptawidyną wykorzystywane są w testach immunoenzymatycznych i w biologii molekularnej. Generalnie stosowane są tam gdzie istnieje potrzeba immobilizacji cząstek, które trudno poddają się pasywnej adsorbcji.

Atrakcyjnym producentem streptawidyny są bakterie Bacillus subtilis (m.in. z uwagi na dostępność szczepów wytwarzających pozakomórkowo łatwo odzyskiwalne białka, przy jednoczesnym deficycie aktywności endopeptydaz). Bakterie te produkują streptawidynę na poziomie 40-50mg/dm3 podłoża.

0x08 graphic
Generacja naturalnych środków smakowych i zapachowych otrzymywanych metodami biotechnologicznymi szybko opanowuje rynki światowe. Do tego typu komponentów zalicza się: wanilino-podobne związki, aldehyd benzoesowy (gorzkie migdały, wiśnie) i lakton kwasu (R)-4-hydroksydekanowego (oleisto-słodki, o nutcie owocowej). Ich produkcja sięga kilku tysięcy ton rocznie. Związki smakowe pochodzące z hodowli bakterii Bacillus występują często w połączeniu z aminokwasami lub peptydami. Lotne związki zapachowe wytwarzane w trakcie fermentacji soi z zastosowaniem bakterii z rodzaju Bacillus są aldehydami, ketonami i kwasami. Niektóre szczepy Bacillus cereus, izolowane podczas fermentacji kakao, produkują 2-acetylo-1-pirolinę jako podstawowy komponent odpowiedzialny za znany powszechnie charakterystyczny aromat prażonej kukurydzy.

5.5.9. Biotransformacja

Biotransformacja to jednoetapowe (rzadziej dwuetapowe) chemiczne przekształcenie egzogennych związków organicznych w strukturalnie im podobne produkty dokonywane przez żywą komórkę. Produkty tych przekształceń bardzo często nie mają żadnego znaczenia dla komórki, a niekiedy wręcz mogą okazać się dla niej toksyczne.

Biotransformacja nie jest celem działania komórki; zachodzi ona często jako proces niezależny od jej funkcji życiowych. Można uznać, że w wielu przypadkach „komórka nawet nie zdaje sobie sprawy z tego, że zostaje oszukana i wykorzystana do przekształcenia podsuniętego jej związku organicznego”. Biotechnolog wykorzystuje naturalny aparat enzymatyczny komórki, podstawia jej pewne związki organiczne i oczekuje, że zostaną one przekształcone zgodnie z jego przewidywaniami. Bakterie z rodzaju Bacillus znalazły zastosowanie w wielu takich bioprocesach.

5.5.9.1. Hydroliza estrów

Wykorzystanie biotransformacji w procesach przemysłowych wymagających stosowania wysoko selektywnych reakcji hydrolitycznych (do których należy zaliczyć znaczną część reakcji hydrolitycznego rozkładu estrów pochodzenia nienaturalnego) ograniczone jest niewielką ilością odpowiednich enzymów drobnoustrojowych. W przeciwieństwie do lipaz, esterazy właściwe - a więc o takiej specyficzności, jaką wykazują esterazy izolowane z wątroby świni (PLE) lub konia (HLE) - są słabo rozpowszechnione u drobnoustrojów. U niektórych mikroorganizmów (m.in. u Bacillus subtilis i Bacillus coagulans) znaleziono jednak nowy typ esteraz (tzw. karboksyloesterazy - NP), wykazujących wysoką specyficzność dla pewnego rodzaju substratów.

0x08 graphic
Reakcja hydrolitycznego rozkładu estrów prowadzona z udziałem bakterii z rodzaju Bacillus może być wysoce stereospecyficzna i regioselektywna, co ma niewątpliwie istotne znaczenie z praktycznego punktu widzenia, (np. przy rozdziale enancjomerów lub hydrolizie estrów związków z kilkoma chiralnymi atomami węgla). Poniżej podano kilka takich przykładów.

Rys. V-24. Hydroliza octanu drugorzędowego alkoholu przez Bacillus sp.

0x08 graphic
Na rys. V-24 przedstawiono rozdział racematu drugorzędowego alkoholu przez stereospecyficzną hydrolizę jego octanu przez Bacillus sp. W tym przypadku konieczne okazało się zamaskowanie terminalnej polarnej grupy karboksylowej t-butanolem. Wydajność enancjomeru R wynosi w tej reakcji 94%.

Rys. V-25. Rozdział -pochodnych kwasu propionowego z wykorzystaniem esterazy z Bacillus sp.

Innym przykładem może być rozdział mieszaniny podstawionych enancjomerów -arylo- i -aryloksy- pochodnych kwasu propionowego (rys. V-25.). Pochodne te znane są dobrze jako leki przeciwzapalne (np. Naproxen) i agrochemikalia (np. Diclofop). Jednakże główną biologiczną aktywność wykazuje z reguły jedynie jeden z enancjomerów (np. S w przypadku Naproxenu). Cytowany przykład pokazuje możliwość zastąpienia konwencjonalnej metody rozdziału tych enancjomerów przez biotransformację z wykorzystaniem fragmentów komórek Bacillus sp. lub esterazy z nich izolowanej.

0x08 graphic

Rys. V-26. Hydroliza racemicznych estrów z chiralnymi atomami węgla przez Bacillus subtilis

0x08 graphic

Rys. V-27. Regioselektywna hydroliza estrów katalizowana przez subtilizynę

Kolejny przykład dotyczy hydrolizy racemicznych estrów kwasów i alkoholi z kilkoma chiralnymi atomami węgla (rys. V-26). Komórki Bacillus subtilis var. niger IFO 3108 zastosowano do hydrolizy racemicznej mieszaniny octanu trans/cis-2,trans-4-dimetylocykloheksanolu. W wyniku tej reakcji rozdzielono obydwa enancjomery, otrzymując alkohol trans-2,trans-4-dimetylocykloheksanolowy z wydajnością 94%.

Również endopeptydazy produkowane przez bakterie z rodzaju Bacillus mogą selektywnie hydrolizować estry. Na rys. V-27 przedstawiono przykłady reakcji regioselektywnej hydrolizy estrów karboksylowych katalizowanych przez subtilizynę. Estry dibenzylowe kwasu asparaginowego i glutaminowego są hydrolizowane przy pierwszym atomie węgla. Natomiast estry etylowe kwasu cytrynowego i 1,2,3-trikarboksylopropanu są hydrolizowane przy środkowym atomie węgla. Okazało się, że inne możliwe regioizomeryczne estry nie były wykrywane wśród produktów hydrolizy.

Subtilizyny, obok właściwej sobie specyficzności charakterystycznej dla endopeptydaz, wykazują również zdolność do hydrolizy estrów wielu aminokwasów. Najefektywniej hydrolizują estry niepolarnych N-acetylo- lub N-benzoilo- podstawionych L-aminokwasów. Natomiast nie hydrolizują estrów D-aminokwasów i stąd znalazły zastosowanie do rozdziału racemicznych mieszanin DL-aminokwasów.

5.5.9.2. Produkcja aminokwasów

Naturalnie występujące w świecie ożywionym L-aminokwasy, których roczne zapotrzebowanie przekracza 1000 ton (np. kwas L-glutaminowy i L-lizyna) produkuje się na drodze biosyntezy. Inne aminokwasy, zwłaszcza szeregu D-, które są niezwykle wartościowe dla przemysłu farmaceutycznego i agrochemicznego, otrzymuje się skojarzonymi metodami enzymatyczno-chemicznymi. Przykładem takiej metody może być produkcja D-aminokwasów poprzez stereospecyficzną (S-specyficzną) hydrolizę odpowiednich pochodnych hydantoiny. Pochodne te, stanowiące mieszaninę D- i L-enancjomerów, otrzymuje się znanymi metodami chemicznymi (np. metodą Bücherera-Berga). Z racematu tego można wydzielić D-aminokwas w procesie biotransformacji, wykorzystując komórki Bacillus brevis lub w procesie enzymatycznej transformacji używając hydantoinazy (dihydropirydyminazy - EC 3.5.2.2.) i hydrolazy N-karbamoilo-D-aminokwasowej (EC 3.5.1.77) produkowanych przez te same bakterie. (Rys. V-28.). Hydantoinazę produkuje również Bacillus stearothermophilus SD1.

Hydantoinaza działa stereospecyficznie, powodując rozerwanie jedynie pierścienia D-hydantoiny, w wyniku czego powstaje rozpuszczalna pochodna N-karbamoilowa D-aminokwasu. Przy odpowiednim pH nierozpuszczalna pochodna L-hydantoiny szybko ulega racemizacji, tak że wydajność procesu sięga 100% wydajności teoretycznej. W następnym etapie produkcyjnym otrzymany N-karbamoilo D-aminokwas poddaje się hydrolizie konwencjonalnymi metodami, lub enzymatycznie otrzymując w efekcie D-aminokwas. Na drodze biotransformacji hydantoiny na dużą skalę produkuje się obecnie D-(4-hydroksylofenylo)glicynę, która jest półproduktem do wytwarzania amoksycyliny, ważnego półsyntetycznego antybiotyku.

0x08 graphic

Rys. V-28. Rozdział pochodnych D,L-hydantoiny z wykorzystaniem enzymów bakterii Bacillus

Niektóre gatunki bakterii z rodzaju Bacillus zdolne są w odpowiednich warunkach do nadprodukcji aminokwasów i stąd mogą być używane do ich biosyntezy. I tak np. Bacillus subtilis w podłożach hodowlanych z dodatkiem prekursora (jakim może być 2-ketomaślan, D,L--hydroksymaślan bądź też D,L--aminomaślan) może nagromadzać L-izoleucynę, a w podłożach z L-homoseryną nagromadza L-treoninę.

6.5.8.3. Antybiotyki

Głównym półproduktem do otrzymywania szeregu półsyntetycznych penicylin (m.in. ampicyliny i amoksycyliny) jest kwas 6-aminopenicylanowy (kwas 6-AP). Otrzymuje się go przez biotransformację penicyliny G (benzylopenicyliny) lub penicyliny V (fenoksymetylopenicyliny). Oba te antybiotyki produkuje się na drodze biosyntezy w hodowlach pleśni Penicillium chrysogenum Do ich przekształcenia w kwas 6-AP wykorzystuje się immobilizowaną acylazę (amidazę) penicylinową (EC 3.5.1.11.) pozyskiwaną z bakterii Escherichia coli, Bacillus sphaericus, Bacillus megaterium lub innych drobnoustrojów (patrz rozdział 8, część VI).

6.5.8.4. Steroidy

Chemiczna synteza leków steroidowych wymaga dużej liczby operacji technologicznych. Skojarzenie typowych przekształceń chemicznych z procesami biotransformacji znacznie ograniczyło ich liczbę.

Duże znaczenie praktyczne w produkcji związków steroidowych ma reakcja odwodornienia w pozycji  pierścienia A. Do przekształcenia kortyzonu w prednizon (a także innych analogów kortykosteroidowych) można zastosować bakterie Bacillus lentus lub Bacillus sphaericus (Rys. V-29.). Dzięki działaniu -dehydrogenazy 3-oksosteroidowej (EC 1.3.99.4.) w sposób wybiórczy ulega odwodornieniu wyłącznie pierścień A, a ilość reakcji ubocznych jest niewielka w porównaniu do pojawiających się podczas stosowania do tego celu innych drobnoustrojów.

0x08 graphic

Rys. V-29. odwodornienie kortyzonu przez Bacillus lentus lub Bacillus sphaericus

0x08 graphic
Monooksygenazy wielu mikroorganizmów mogą regioselektywnie i stereospecyficznie hydroksylować steroidy. To, czy hydroksylowanie nastąpi w pozycji  lub  oraz w którym pierścieniu i przy którym atomie węgla zależy od użytego szczepu oraz w pewnym stopniu od budowy cząsteczki substratu. Bakterie Bacillus megaterium ATCC, jako jedne z nielicznych, hydroksylują progesteron przy 15 atomie węgla w pozycji  i  Monooksygenazy szczepu Bacillus megaterium KM hydroksylują progesteron w kilku pozycjach: 15 i , 6 oraz 11.

5.5.9.5. Inne przykłady biotransformacji

Bacillus megaterium PYR291 wykorzystywany jest do mikrobiologicznej syntezy kwasu 2-karboksypirolowego z pirolu.

Bacillus subtilis przekształca rapamycynę (antybiotyk o właściwościach immunosupresyjnych), do 24-hydroksyrapamycyny (terapeutycznego środka zapobiegającego odrzutom przy transplantacji organów).

0x08 graphic
Bacillus megaterium ATCC 13368 wykazuje zdolność do biotransformacji kwasu betulinowego (pentacyklicznego triterpenu, znalezionego w obfitości w zewnętrznej korze białej brzozy), związku o właściwościach antynowotworowych (antymelanoma - przeciw czerniakowi skóry), opóźniającego postęp infekcji spowodowanej wirusem HIV(2), a ponadto hamującego wzrost Staphylococcus aureus i Escherichia coli. Produkty transformacji kwasu betulinowego (m.in. pochodna 3-ketonowa otrzymana przez utlenienie grupy hydroksylowej C-3, lub pochodne hydroksylowe C-1 i C-11) wykazują aktywność cytotoksyczną (niszczą komórki ludzkiego czerniaka).

Bacillus cereus transformuje kwercetynę (pochodną flawonu, z grupy flawonoidów) do kwasu protokatechowego.

Opisano sposób otrzymywania alkoholu perililowego, karweolu i α-terpineolu z limonenu z wykorzystaniem Bacillus stearothermophilus, który efektywnie prowadzi proces transformacji w temperaturze 55-70°C.

0x08 graphic

5.5.10. Biodegradacja

Biodegradacja to biochemiczny rozkład związków organicznych na prostsze składniki chemiczne zachodzący przy udziale żywych organizmów. Termin ten w odróżnieniu od pojęcia mineralizacji używany jest na ogół w odniesieniu do ksenobiotyków - substancji obcych i szkodliwych dla środowiska naturalnego, syntetyzowanych sztucznie przez człowieka i nie występujących naturalnie w przyrodzie.

W układach drobnoustrojów wielogatunkowych proces biodegradacji niektórych ksenobiotyków sprzężony bywa z procesami asymilacji wytworzonych w jego efekcie prostszych składników. Jedne gatunki drobnoustrojów prowadzą proces biodegradacji do prostszych składników, a inne - wchodzące w skład takich wielogatunkowych układów - przyswajają powstałe przejściowo związki chemiczne.

Procesem pokrewnym do biodegradacji jest detoksykacja. Mianem tym niekiedy w literaturze określa się procesy, w wyniku których toksyczne dla środowiska substancje chemiczne są przekształcane w związki nietoksyczne, które z kolei dalej są biodegradowane, mineralizowane lub asymilowane.

6.5.5.1. Biodegradacja n-alkanów o długości łańcucha C9-C44

Znane są trzy główne drogi biodegradacji n-alkanów o długości łańcucha C9-C44: mono- lub diterminalna oksydacja, subterminalna oksydacja oraz poprzez alkeny. Bakterie z rodzaju Bacillus aktywnie mogą uczestniczyć w monoterminalnej lub subterminalnej degradacji tych związków. Zwłaszcza ich rola w biodegradacji n-alkanów o długości łańcucha powyżej C16 (tj. parafin, będących ciałami stałymi) jest niezwykle istotna. Tylko nieliczne drobnoustroje mogą degradować te węglowodory, będące składnikami wielu kosmetyków, maści leczniczych, smarów, a także stosowanych w produkcji świec i do pokrywania papieru oraz w wielu innych produktach codziennego użytku.

Problem biodegradacji n-alkanów o długości łańcucha powyżej C16 polega na tym, że katabolizowane są one wewnątrzkomórkowo i stąd w znacznym stopniu ich rozkład zależy od dostępu do komórki mikroorganizmu. Bakterie Bacillus subtilis problem ten pokonują, wytwarzając bioemulgator -surfaktynę, ułatwiający wnikanie cząstek n-alkanu do komórek i to nie tylko własnych, ale także innych mikroorganizmów żyjących w środowisku ich bytowania.

Surfaktyna wytwarzana jest przez liczne szczepy bakterii Bacillus subtilis hodowane w podłożach zawierających różne frakcje ropy naftowej, niezależnie od obecności innych składników. Dodatek surfaktyny do podłoży hodowlanych Bacillus subtilis O9 zwiększa biodegradację alifatycznych węglowodorów ropy naftowej z 21 do 36%, a w przypadku węglowodorów aromatycznych z zera do 41%. Poprawa biodegradacji węglowodorów alifatycznych dotyczy głównie długołańcuchowych n-alkanów takich, jak n-C17 i n-C18.

0x08 graphic

Rys. V-30. Surfaktyna - biosurfaktant wytwarzany przez bakterie Bacillus subtilis

Surfaktyna, zwana też subtilizyną (nie mylić z enzymem subtilizyną) jest cyklicznym lipopeptydem (Rys. V-30). Jest najefektywniejszym poznanym biosurfaktantem; w stężeniu 20mg/dm3 redukuje napięcie powierzchniowe wody z 72 do 27mN/m.

0x08 graphic

Rys. V-31. Mono- i subterminalna oksydacja n-alkanów o długości łańcucha C9-C44

Monoterminalna oksydacja n-alkanów (Rys. V-31) inicjowana jest działaniem monooksygenazy metanowej (EC 1.14.13.25). Enzym ten, dość szeroko rozpowszechniony w świecie drobnoustrojów, u niektórych z nich (np. Bacillus megaterium) sprzężony bywa z całym systemem cytochromu P-450, co znacznie podnosi skuteczność jego działania. Z kolei subterminalna oksydacja n-alkanów inicjowana jest działaniem mechanizmu hydroperoksydazy (którego przypuszczalnym składnikiem jest dioksygenaza z podpodklasy EC 1.14.99.). Bakterie i pleśnie dysponujące tym mechanizmem wprowadzają grupę hydroksylową do łańcucha n-alkanu zazwyczaj przy 2 atomie węgla, rzadziej przy 2, 3 lub 4 (np. grzyby strzępkowe z rodzaju Fusarium, Penicillium, lub bakterie Bacillus coagulans, Bacillus lentus). Bacillus macerans zdolny jest hydroksylować 4, 5 i 6 atom węgla. Natomiast mieszane kultury Bacillus i Streptomyces hydroksylują długie n-alkany w dowolnym miejscu, co jest korzystne z punku widzenia ich dalszego katabolizmu. Stwierdzono ponadto, że Bacillus coagulans, Bacillus lentus, Bacillus macerans i Bacillus stearothermophilus mogą prowadzić disubterminalną oksydację n-alkanów o długości łańcucha powyżej C16.

6.5.5.2. Biodegradacja związków amidowych

Pochodne aromatycznych amidów (anilidów) i fenylokarbamidów (fenylomocznika) są powszechnie stosowanymi pestycydami. W związku z tym, ich biodegradacja jest ważnym problemem ze względu na wpływ, jaki mogą wywierać na środowisko naturalne i pośrednio na człowieka. Biodegradację tych związków prowadzą m.in. bakterie Bacillus firmus i Bacillus sphaericus. Hydrolizę wiązania amidowego w tego typu pochodnych aromatycznych katalizuje arylo-acyloamidaza (amidohydrolaza arylo-acyloamidowa, EC 3.5.1.13.) wytwarzana przez te bakterie. W wyniku jej działania na anilidy, powstaje kwas karboksylowy i anilina (Rys. V-32).

0x08 graphic

Rys. V-32. Schemat hydrolizy związków anilidowych

0x08 graphic
Bakterie Bacillus firmus i Bacillus sphaericus wykorzystując arylo-acyloamidazę są w stanie biodegradować wiele herbicydów i fungicydów o budowie opartej o anilidy i fenylokarbamidy (Rys. V-33.).

Rys.V-33. Biodegradacja pestycydów anilidowych i fenylokarbamidowych przez Bacillus firmus lub Bacillus sphaericus

6.5.5.3. Biodegradacja innych związków

Bakterie z rodzaju Bacillus uczestniczą w biodegradacji wielu innych ksenobiotyków, ponad te, które wymieniono powyżej. Przykładowo Bacillus pumilus dzięki wytwarzaniu hydratazy cyjanidowej (EC 4.2.1.66) detoksyfikuje środowisko z niezwykle toksycznego cyjanowodoru. Niektóre szczepy tego gatunku bakterii mogą ponadto biodegradować nitryle (dzięki wytwarzaniu hydratazy nitrylowej - EC 4.2.1.84).

Bakterie Bacillus subtilis (dzięki posiadaniu odpowiedniej monooksygenazy) zdolne są do eliminacji grupy nitrowej z trudno degradowalnych nitrowych pochodnych fenoli. Na szczególną uwagę zasługują 2- i 4-nitrofenole, które zaliczane są do głównych substancji zanieczyszczających środowisko naturalne. Np. 4-nitrofenol jest często obecny w ściekach przemysłowych, a także w glebie jako produkt hydrolizy wielu insektycydydów. Wykazano, że niektóre drobnoustroje glebowe przy współdziałaniu z bakteriami Bacillus subtilis mają zdolność do degradacji tego uciążliwego ksenobiotyku. Znaleziono również Bacillus sp., który w warunkach tlenowych intensywnie degraduje 2,4,6-trinitrotoluen.

Niektóre gatunki bakterii z rodzaju Bacillus biorą udział w biodegradacji związków aromatycznych. Znaleziono u nich m.in. dehydrogenazy cis-dihydrodiolowe (z pod-podklasy EC 1.3.1), które pozwalają przywracać aromatyzację pierścienia utraconą w wyniku działania dioksygenaz hydroksylujących. Dehydrogenaza cis-1,2-dihydrobenzeno-1,2-diolowa (EC 1.3.1.19) występująca u bakterii Bacillus działa zwłaszcza skutecznie na pochodne dihydrodiolowe toluenu. Z kolei Bacillus macerans wytwarza 2,3-dioksygenazę protokatechanową, która powoduje ekstradiolowe rozerwanie pierścienia w kwasie protokatechowym.

0x08 graphic

Rys.V-34. Biodegradacja fenantrenu przez Bacillus sp.

Z gleby wyizolowano Bacillus sp., który utylizuje fenantren, traktując go jako jedyne źródło węgla. Bakterie biodegradują także naftalen, bifenyl, antracen i kilka innych aromatycznych związków. Ustalono, że pośrednimi metabolitami degradacji są: kwas 1-hydroksy-2 naftalenowy, który dalej jest metabolizowany poprzez o-ftalan i dalej szlakiem ftalanowym poprzez kwas protokatechowy (Rys.V-34).

Termofilny Bacillus pallidus wykazuje uzdolnienia do biodegradacji izopropanolu oraz acetonu, przy czym wyróżnia się odpornością na wysokie stężenia tych rozpuszczalników, sięgające nawet 24g/dm3. Oba rozpuszczalniki są całkowicie usuwane z podłoży hodowlanych bakterii po 160-175 godzinach. Rezultaty te wskazują na potencjalne możliwości stosowania Bacillus pallidus w procesach bioremediacji podgrzanych ścieków przemysłowych zawierających rozpuszczalniki typu izopropanol i aceton.

Bacillus subtilis biodegraduje p-aminoazobenzen, składnik wielu barwników azowych stosowanych w przemyśle tekstylnym i często zanieczyszczający ścieki przemysłowe. Proces ten jednocześnie jest przykładem kometabolizmu - p-aminoazaobenzen jest kometabolizowany przez bakterie w obecności glukozy w podłożu jako źródła węgla. W wyniku biodegradacji powstaje anilina i p-fenylenodiamina, co wskazuje na rozszczepienie podwójnego wiązania w azobenzenie. Podobnie Bacillus cereus zdolny jest do biodegradacji wiązania azowego i stąd uczestniczy w rozkładzie wielu barwników azowych.

Ponadto niektóre gatunki bakterii z rodzaju Bacillus degradują pirydynę oraz kwas nikotynowy, traktując je jako źródło węgla, azotu i energii.

Przedstawione kierunki wykorzystania bakterii z rodzaju Bacillus wskazują na ich bardzo istotną rolę w biotechnologii. Należy jednocześnie pamiętać, że występując we wszystkich rejonach świata w różnorodnych naturalnych środowiskach uczestniczą w rozkładzie martwych tkanek, biorą udział w obiegu biogennych pierwiastków oraz stanowią naturalną ochronę roślin przed patogennymi drobnoustrojami. Szczególnie istotna jest możliwość przemysłowego wykorzystania właściwości ich komórek do wytwarzania wielu poza- i wewnątrzkomórkowych enzymów i innych metabolitów wtórnych.

Obecnie sklasyfikowany jako Peanibcillus polymyxa

Obecnie sklasyfikowany jako Geobacillus stearothermophilus

Polisacharyd zbudowany z cząsteczek fruktozy połączonych wiązaniami - 2,6 i - 2,1

Wg nowej taksonomii szczep ten zaliczany jest wraz z innymi kwasolubnymi termofilami do rodzaju Alicyclobacillus

Stosunek GC definiuje się wzorem (G+C)/(G+C+A+T) i jest zazwyczaj wyrażany w %

enzymy, które wydzielane są z komórek do otaczającego je środowiska nazywane są zewnątrzkomórkowymi lub pozakomórkowymi

Obecnie sklasyfikowany jako Brevibacillus brevis

Proteazy, w efekcie hydrolizy białek sojowych nadają tej tradycyjnej potrawie odpowiednie walory smakowe. Natto zawiera kwas γpoliglutaminowy oraz fruktany typu lewan. Uważa się, że potrawa posiada właściwości zdrowotne, z uwagi na lityczne właściwości białek wydzielanych przez bakterie i obecność kwasu dipikolinowego. Stwierdzono też działanie antykancerogenne i obniżające ciśnienie natto, dlatego, wciąż rozwija się i doskonali szczepy stosowane do jego produkcji.

Wyliczono, że w ciągu roku jedna firma biotechnologiczna wytwarza ok. 1023 komórek tych bakterii

Status GRAS przyznawany jest przez Światową Komisję Żywności i Leków (Food and Drug Administration)

Chaperony (chaperon (fr. przestarzałe): przyzwoitka, starsza opiekunka młodej kobiety) to tzw. białka opiekuńcze, które chronią inne białka przed denaturacją, biorą udział w transporcie białek przez błony biologiczne oraz nadają cząsteczkom białek natywną konformację przestrzenną.

Możliwość wprowadzania obcych genów do komórek stwierdzona została po raz pierwszy przez Spizizena (USA, 1958 r.) właśnie dla bakterii B. subtilis. Odkrycie to było kamieniem milowym w rozwoju współczesnej biologii molekularnej. Zjawisko transformacji komórek obcymi genami, które wprowadza się m.in. przy pomocy specjalnie konstruowanych cząsteczek zwanych plazmidami, jest obecnie powszechnie wykorzystywane przez biotechnologów do otrzymywania szczepów o znaczeniu przemysłowym.

Cyklodekstryny (CD) - nieredukujące, cykliczne D-glukozylopolimery zawierające 6, 7 i 8 jednostek glukozowych (odpowiednio ,  i γ CD). Stosowane są w produkcji żywności (np. jako stabilizatory smaku), farmaceutyków (stabilizacja i/lub zwiększenie rozpuszczalności leków), pestycydów, kosmetyce i innych.

Inaczej restryktazy - enzymy z grupy endonukleaz przecinające nić DNA w miejscu o specyficznej sekwencji. Pierwszy enzym restrykcyjny z bakterii Bacillus wyizolowany został z B. amyloliquefaciens (szczepu H) i nosi nazwę BamH I

fałdowanie (ang. folding) białek polega na nadawaniu im odpowiedniej konformacji przestrzennej (ułożeniu łańcucha polipeptydowego w przestrzeni), która jest niezbędna dla aktywności katalitycznej enzymów .

czyli wytwarzania m-RNA na matrycy DNA

3

26


Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Biotechnologiczna rola bakterii Bacillus , Ekologia
Znaczenie bakterii w przemyśle(1)
Bakterie Bacillus
zał 7 Znaczenie bakterii
ZNACZENIE BAKTERII W PRZYRODZIE I GOSPODARCE CZŁOWIEKA, Edukacja xD, Biologia, Referaty
znaczenie bakterii
Przeglad i znaczenie bakterii
Referat Rozmieszczenie głównych gałęzi przemysłów w Polsce i ich znaczenie gospodarczex
99 Przeglad i znaczenie bakterii
Tadeusz Maciej Ciołek Dwa znaczenia terminu autorytet w bystroniowskim modelu kultury ludowej

więcej podobnych podstron