Wyznaczanie zakresu wprost proporcjonalnego przyrostu trójfenyloformazanu podczas oznaczania aktywności dehydrogenaz za pomocą testu TTC

Wprowadzenie

Ważnym czynnikiem decydującym o prawidłowości wykonywanego oznaczenia, jest stosowanie takiego czasu inkubacji próbek, w którym przyrost TF jest liniowy. Jedynie wówczas można podawać uzyskany wynik oznaczenia aktywności w przeliczeniu na jednostkę czasu.

W przypadku gdy wykres zależności aktywności dehydrogenaz od czasu inkubacji nie przecina początku układu współrzędnych, należy zmodyfikować oznaczenie zwiększając dwukrotnie ilość inkubowanych próbek. Inkubację połowy próbek kończyć po krótkim czasie (najczęściej 5÷10 minut) a inkubację pozostałych prowadzić dalej przez 15÷30 minut. W takim przypadku aktywność dehydrogenaz wyznacza się na podstawie stosunku ilości powstałego TF do czasu, w którym ten przyrost nastąpił:

Zabiegi wstępne

Przed przystąpieniem do właściwego doświadczenia wyznaczyć optymalne stężenie TTC, jakie należy stosować podczas oznaczania aktywności.

Odczynniki i sprzęt

• Roztwór wodny TTC o optymalnym stężeniu

• Roztwór wodny Na₂SO₃ 0,2%

• Alkohol metylowy cz.d.a.

• Statyw na probówki

• Probówki wirówkowe o pojemności 10 ml, 16 szt.

• Wirówka laboratoryjna

• Kolorymetr (x = 485 nm)

• Mikrodozymetr 8 ml

• Mikrodozymetr 1 ml

• Pipety 1 ml

Wykonanie doświadczenia

Do 12 probówek wprowadzić po 8 ml osadu czynnego oraz 1 ml roztworu Na₂SO₃, a następnie po 1 ml roztworu TTC o optymalnym stężeniu, zamknąć korkiem i energicznie wymieszać. Inkubować próbki w ciemności w temperaturze naturalnej dla analizowanej hodowli mikroorganizmów. Wyjmować po dwie próbki po upływie 10, 20, 30, 40, 50 i 60 minut inkubacji. Po wyjęciu szybko odwirować, odrzucić ciecz nadosadową i do pozostałego osadu wprowadzić 8 ml metanolu. Zanotować czas dodania metanolu. Energicznie wymieszać zawartość probówek. Próbki ponownie odwirować i oznaczyć ekstynkcję supernatantu.

Czas inkubacji liczyć należy od momentu zmieszania roztworu TTC z osadem czynnym do chwili przerwania reakcji enzymatycznej metanolem.

Opracowanie wyników

Sporządzić wykres zależności ekstynkcji od czasu inkubacji. Przeprowadzić dyskusję wyników.

---