Ćwiczenie 7 4.01.2013r.

Laboratoryjne aspekty przemiany lipidowej- oznaczanie stężenie cholesterolu i TG

Jakościowa i ilościowa ocena frakcji lipoproteinowych. Izolowanie frakcji lipoproteinowych z wykorzystaniem metody strąceniowej i elektroforezy.

Stężenie lipidów całkowitych waha się w granicach 4-10g/L

• Prawidłowe stężenie FL w surowicy krwi wynosi 1,7-3,9 mmol/L (130-300 g/dl)

• Stężenie WKT w surowicy na czczo prawidłowo mieści się w zakresie 300-700 μmol/L

Podstawowe składniki lipidowe w organizmie człowieka: TG, Ch, FL

Lipoproteidy- kompleks białek (apolipoprotein) z lipidami powierzchniowymi (FL i Ch) i rdzeniowymi (TG i estry Ch). Stanowią heterogenną grupę cząsteczek różniących się składnikiem lipidowym, białkowym, miejscem syntezy, metabolizmem.

Podział lipoprotein

• 
  Chylomikrony miejsce nałożenia

• VLDL pre-β1

• IDL β-pre-β2 lipidy białka

• LDL β

• HDL α

Ruchliwość elektroforetyczna

Lipoproteina LDL

• Jest zbiorem heterogennych cząsteczek. U zdrowych ludzi z niezaburzonym metabolizmem dominują LDL duże tzw lekkie LDL (fenotyp A LDL). Przewaga małych gęstych LDL charakteryzuje fenotyp B. Małe gęste przebywają dłużej w krążeniu, przez co są bardziej podatne na modyfikację oksydacyjną. Fenotyp B jest charakterystyczny dla chorób takich jak: cukrzyca typ 2, insulinooporność, zespół metaboliczny, otyłość

• Spełniają ważne funkcje: dostarczają Ch do komórek celem regeneracji (20-30%). LDL są pobierane do komórek drogą receptorową (receptor LDL)

HDL

Istnieje odwrotna zależność między stężeniem HDL w osoczu a ryzykiem rozwoju miażdżycy. Cząsteczki HDL są izolowane metodą ultrawirowania w gradientach gęstości 1,063-1,121 g/ml składają się z niepolarnego rdzenia zwierającego estry Ch, małe ilości TG, a apolipoproteiny oprócz apoB.

Może być produkowany przez enzymy które ↑ cząsteczkę np. LCAT (acetylotransferaza lecytyna:cholesterol). Nowe powstające cząsteczki dostarczane są do krwiobiegu jako dyskoidalne małe cząsteczki, natomiast przy udziale…

Ultrawirowanie

Referencyjna metoda separacji lipoprotein przez długotrwałe ultrawirowanie w roztworze soli o różnych gęstościach przy których jeden rodzaj lipoproteiny flotuje, reszta sedymentuje

VLDL

IDL

LDL

Lp(a)

HDL 2 rich

HDL 2 pour

Elektroforeza lipoprotein

• Metoda półilościowa

• Uwidacznia różnice w szybkości wędrówki lipoprotein np. szerokie pasmo β, odpowiadające β-lipoproteinom jest charakterystyczne dla hiperlipidemii typu III

• Nośnik: agarowa,żel poliakrylamidowy

• Ocena densytometryczna

• Frakcje lipoprotein rozdzielone metodą:

• Chylomikrony

• Β-lipoproteiny (LDL)

• Pre-β-lipoproteiny (VLDL, IDL)

• Α-lipoproteiny (HDL)

Cholesterol- steroidowy związek syntezowany w tkankach (szczególnie w wątrobie) dostarczany z pożywieniem.

• Transportowany do krwi przez lipoproteiny 70% w LDL, 25% w HDL, 5% VLDL

• Ch całkowity- HDL+LDL+VLDL

• 35-40% Ch całkowitego jest w postaci wolnej, 60-75% występuje w postaci zestryfikowanej

• Wskazanie do oznaczenia

• Ocena ryzyka zagrożenia miażdżycą

• Monitorowanie leczenia lekami ↓ stężenie cholesterolu we krwi

• Wartości prawidłowe 150-200mg/dl (4,1-5,2 mmol/l)

• <200mg/dl pożądany

• >200-239 mg/dl granicznie wysoki

• >240 mg/dl wysoki

Metody oznaczanie Cholesterolu

• Metoda Libermana-Burcharda

• Kolorymetryczna

• Niewykorzystywana obecnie

• Metoda Abella-Kendalla

• Modyfikacja powyższej metody

• Metoda referencyjna

• Metoda enzymatyczna z esterazą i oksydazą cholesterolową

• Testy paskowe

HDL

• Metody strąceniowe: HDL-Ch oznaczany jest w nadsączu po strąceniu lipoprotein zawierających apo-B (LDL, VLDL) jonami Mn2+ i heparyną lub Mg2+ i kwasem fosforowolframowym. Ma pewne ograniczenia, może być wykorzystywana tylko przy wartościach TG< 4,6mmol/L. Przy hipertriglicerydemii >4,6mmol/L strącenie VLDL i LDL jest niekompletne

• Metody bezpośrednie- zastosowanie związku czynnego powierzchniowo, wybiórczo opłaszczonego klasy lipoprotein nieoznaczone w teście

LDL

• Metodą referencyjną jest wyizolowanie frakcji LDL metodą ultrawirowanie. Metoda kosztowna i czasochłonna dlatego powszechnie wylicza się ze wzoru Friedewalda

LDL (mmol/L) = Ch - HDL - TG/2,2

LDL (mmol/L) = Ch - HDL - TG/5

Stężenie TG ≤4,6mmol/L / 400mg/dl aby móc oznaczać tą metodą

• Może być oznaczony metodą bezpośrednią

• <100mg/dl optymalny

TG

<150 mg/dl prawidłowe

150-199 mg/dl umiarkowanie wysokie

200-499 mg/dl wysokie

>500 mg/dl bardzo wysokie

• Metody enzymatyczne oparte na oznaczaniu wolnego glicerolu powstającego po hypolitycznym rozkładzie wiązań estrowych TG

• Ocena zagrożenia miażdżycą

• Ocena zaburzeń lipidowych w chorobach narządowych

TG glicerol + KT

Lipaza

Glicerol + ATP G3P + ADP

GK

G3P + O2

GPO

Materiałem biologicznym służącym do oznaczeń Ch i jego frakcji jest krew pobrana na EDTA (osocze) lub skrzep (surowica). Próbki są stabilne 3dni w temp +4stC lub 4 miesiące w temp -70stC.

Możliwy wygląd surowicy:

Przejrzysta/ lekko opalizująca

Test zimnej flotacji:

• Metoda jakościowa, wskazująca niektóre zaburzenia gospodarki lipoproteinowej związane z ↑ stężenia TG. Umożliwia różnicowanie egzogennej triglicerydemii od endogennej

• Osocze/surowica w +4stC na 12-24h a następnie ocena wyglądu

• Jednolicie mętna surowica wskazuje na obecność frakcji VLDL, a kożuch na chylomikrony

DYSLIPIDEMIE/DYSLIPOPROTEINEMIE Klasyfikacja hiperlipoproteinemii wg Fredricksona elektroforeza bibułowa i ultrawirowanie
Typ	Wygląd surowicy	TG	CHL	CHM	LDL β	VLDL pre-β	HDL α	CHL/TG	EF
I	mleczna/kożuch	↑↑↑	N/↑	↑↑↑	↓	↓	↓	<0,2	CHM
IIa	klarowna	N	↑↑↑		↑↑↑			>1,5	nadmiar LDL
IIb	klarowna, opalizująca	↑↑	↑↑		↑	↑		>1,5	nadmiar LDL+VLDL
III	mętna/opalizująca	↑↑	↑↑		↑	↑	↓	ok.1	flok. IDL
IV	mętna	↑↑↑	N/↑			↑↑	↓	<0,2	nadmiar VLDL
V	mleczna/kożuch	↑↑↑	↑↑	↑		↑		0,15-0,6	CHM+nadmiar VLDL

Przygotowanie do badań

• w okresie poprzedzającym badanie (1-2 tygodnia) należy zachować normalną dietę, utrzymywać stałą masę ciała oraz prowadzić zwyczajny tryb życia

• 2-3 dni przed badaniem bez alkoholu

• ostatni posiłek 14-16 h przed pobraniem krwi

• krew pobierany na czczo

• nie wolno przyjmować leków wpływających na gospodarkę lipidową

• unikamy dłuższego niż 3 min ucisku stazy

• badania przy braku choroby, urazu itp.

• 30 min - przed badaniem pacjent powinien pozostać w spoczynku.

Pełny lipidogram - na czczo, Ch całkowity- po posiłku może być.

Biologiczne źródła zmienności pomiarów

• dieta

• otyłość

• palenie tytoniu

• ćwiczenia fizyczne

• spożywanie alkoholu.

Kliniczne źródła zmienności stężenia lipidów

• zawał serca

• udar mózgu

• nadciśnienie

• niewydolność nerek

• cukrzyca

• zakażenia

• niektóre leki

• ciąża.

Błędy wynikające z pobierania próbek

• głodówka - 14-16 h do TG

• przedłużająca się głodówka - wzrost cholesterolu i triglicerydów o ok. 18% i ok. 22% spadek HDL

• pozycja ciała - HDL , LDL rosną o 10%, triglicerydy o 12%

• różnice między surowicą a osoczem - w surowicy ok. 3% wyższe niż dla osocza

• złe koagulanty obniżają ilość lipoprotein.

3

---