Zwierzęta Laboratoryjne

Hodowane w Ośrodkach Naukowych

w Polsce

Zebrała i opracowała: Elżbieta Krysiak

Wydanie niniejszej publikacji zostało dofinansowane przez Komitet Badań Naukowych.

Dziękujemy za pomoc techniczną w przygotowaniu i opublikowaniu materiałów instytucjom:

• Centrum Onkologii - Instytut im. Marii Skłodowskiej - Curie, Warszawa

• Instytut - Centrum Medycyny Doświadczalnej i Klinicznej PAN, Warszawa

Opracowanie obecne jest trzecim wykazem zwierząt laboratoryjnych hodowanych w Polsce opracowanym z inicjatywy Komisji Biologii Zwierząt Doświadczalnych Polskiej Akademii Nauk na podstawie materiałów uzyskanych z ankiet rozesłanych do znanych nam ośrodków. Opracowanie to pomyślane jest jako źródło informacji, gdzie i jakie zwierzęta laboratoryjne są hodowane i dostępne do badań doświadczalnych w kraju. Stwierdzone pewne luki i zaniedbania w stosowanym nazewnictwie, jak też niedobory w wiedzy o kontroli genetycznej i statusie zdrowotnym zwierząt, skłoniły nas do wyposażenia obecnego wykazu w przedstawione w formie krótkich artykułów podstawowe informacje z tego zakresu.

Opracowanie zawiera również wykaz instytucji oraz standardowe skróty, uprzednio przyjęte lub zaproponowane obecnie, dotyczące ich nazw lub nazwisk osób hodujących zwierzęta. Te standardowe skróty - kody powinny być używane zgodnie z zaleceniami Międzynarodowego Komitetu ds. Standaryzacji Genetycznego Nazewnictwa Zwierząt Laboratoryjnych do oznaczania podszczepów i do tworzenia symboli stad niekrewniaczych. Opracowanie podobnie jak poprzednie wykazy składa się z tabel, w których wymienione są szczepy wsobne i kongeniczne, stada niekrewniacze myszy i szczurów, myszy transgeniczne oraz inne gatunki zwierząt laboratoryjnych hodowanych w Polsce. W tabelach podano również informacje o pochodzeniu zwierząt, liczbie pokoleń, systemie kojarzeń, stosowanych metodach kontroli genetycznej i zdrowotnej.

Mamy nadzieję, że opracowanie to przyczyni się do dalszego uporządkowania opisu zwierząt przeznaczonych do badań doświadczalnych, tak aby dane te zbliżyły się do wymagań światowych.

Przewodnicząca Komisji

Biologii Zwierząt Doświadczalnych PAN

Prof. Alina Czarnomska

Nazewnictwo najczęściej używanych modeli zwierząt laboratoryjnych.

Alina Czarnomska, Jadwiga Brylińska

Obserwowana w Polsce duża dowolność w posługiwaniu się i brak zrozumienia sensu symboli nadawanych zwierzętom laboratoryjnym skłania do przypomnienia reguł obowiązujących w tym zakresie.

Próby ujednolicenia nazewnictwa, początkowo tylko szczepów wsobnych myszy, sięgają roku 1919. W Polsce opracowania mające zapoznać badaczy z obowiązującymi regułami podjęto już w latach siedemdziesiątych [2,4]. Dzięki staraniom ICLAS opracowano i opublikowano podobne zalecenia dotyczące stad niekrewniaczych [6]. W latach późniejszych w miarę tworzenia coraz to nowych modeli zwierząt opracowywano reguły tworzenia także dla nich nazw i symboli.

W obecnym opracowaniu pragniemy przypomnieć zasady tworzenia i odczytywania symboli i nazw najczęściej w Polsce używanych myszy i szczurów laboratoryjnych.

Nazewnictwo szczepów wsobnych myszy i szczurów

Za szczep wsobny uważamy grupę zwierząt reprezentujących jeden gatunek, charakteryzujących się jednorodnością genetyczną i homozygotycznością. Pierwszy wykaz wsobnych szczepów myszy przygotowany zgodnie z ujednoliconymi zasadami mianownictwa opracowanymi przez Snella ukazał się w czasopiśmie Cancer Research w 1952 r. [3] Publikacja ta zawierała reguły dotyczące nadawania nazw szczepom wsobnym oraz wykaz symboli kodowych będących skrótem nazwisk osób lub nazw instytucji utrzymujących te szczepy. Dalsze podobne wykazy publikowane były regularnie co cztery lata aż do 1985 r.

Zasady nazewnictwa wsobnych szczepów szczurów oparte na tych samych założeniach co zasady nazewnictwa wsobnych szczepów myszy opublikowane zostały przez Festinga i Staats w 1973 r [7]. Według tych zasad szczep wsobny powinien być oznaczony jedną lub kilkoma dużymi literami alfabetu łacińskiego

Np. AKR, BALB/c, C3H, BN (myszy), AUG (August), LEW (Lewis), SHR (Spontaneous Hypertensive Rat), WAG (Wistar Albino Glaxo).

Mieszańce uzyskiwane ze skrzyżowania dwóch szczepów wsobnych powinny według zasad mianownictwa opracowanych przez Staats w 1964 r. [14] zawierać w swoim symbolu informację dotyczącą ich pochodzenia. Na pierwszym miejscu umieszcza się zawsze symbol szczepu, z którego pochodzi samica a następnie rozdzielony znakiem „x” symbol szczepu samca użytego do kojarzeń. Oba zamyka się w nawiasie, po którym wpisuje się numer pokolenia.

Np. (C57BL/6 x DBA/2)F1

Przy oznaczaniu mieszańców używa się też często symboli skróconych.

Np. (C57BL/6 x DBA/2)F1 = B6D2F1

Podszczepy stanowią grupy zwierząt wyodrębnione ze szczepu wsobnego mogące się od niego różnić genetycznie w wyniku działania czynników przypadkowych lub zamierzonych. Podszczep oznaczamy wprowadzając do symbolu szczepu rodzicielskiego (wyjściowego) odpowiedni symbol podszczepu, który zwykle stanowi skrót (kod) nazwiska badacza lub nazwy ośrodka, w którym podszczep został wyhodowany. Kod ten powinien być wyrażony jedną lub kilkoma literami, z których tylko pierwsza może być literą dużą. Wyjątkowo dopuszcza się utrzymanie tradycyjnego oznaczenia jako symbolu podszczepu cyfry lub małej litery np. DBA/1 i DBA/2, BALB/c.

Przykłady oznaczania podszczepów:

C3H/W, CBA/Kw, CFW/Han

W piśmiennictwie spotkać można czasem nazwy podszczepów ze złożonymi symbolami kodowymi, co pozwala na odtworzenie pochodzenia danego podszczepu.

Np.: C3H/AW - podszczep hodowany w Centrum Onkologii w Warszawie (W) sprowadzony z Instytutu Raka w Amsterdamie (A)

CBA/KwHan - podszczep hodowany w Hanowerze (Han) sprowadzony z Zakładu Genetyki Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie (Kw)

Nazewnictwo szczepów kongenicznych i koizogenicznych

Dwie linie szczepu wsobnego różniące się jednym zmutowanym genem określane są jako pary koizogeniczne. Natomiast szczepy kongeniczne różnią się krótkim odcinkiem jednego chromosomu a otrzymuje się je na drodze szeregu krzyżówek genetycznych połączonych z równoczesną selekcją. Jeśli różnica między dwoma szczepami kongenicznymi dotyczy odcinka chromosomu zawierającego locus zgodności tkankowej, szczepy te nazywamy kongenicznie opornymi CR (congenic resistant). Zwierzęta z takich dwóch szczepów odrzucają wzajemnie swoje przeszczepy tkankowe. Zasady nazewnictwa stosowanego dla szczepów CR opracował ich twórca Snell w 1958 r. [13] a opublikował J.Klein w 1973 r. [9] razem z wykazem dostępnych w owym czasie szczepów CR. Szczep kongeniczny oznaczamy symbolem złożonym z dwóch części przedzielonych kropką lub kreską poziomą. Część pierwszą stanowi pełny lub skrócony symbol szczepu tła genetycznego. Część druga zawiera skrócony symbol szczepu lub stada dawcy, albo też symbol określający gen wprowadzony ze szczepu dawcy. W przypadku szczepów koizogenicznych w części drugiej symbolu podaje się nazwę locus, w którym nastąpiła mutacja.

Przykłady:

B10.A - szczep tła C57BL/10 (B10), szczep dawca A

C3H.B10 - szczep tła C3H, szczep dawca C57BL/10 (B10)

C57BL/10-H-2^d - szczep różni się od szczepu tła haplotypem: H-2^d

C3H-p - szczep różni się od szczepu tła genem: p

C57BL/6J-ob - szczep różni się od szczepu tła genem: ob

Nazewnictwo szczepów wsobnych rekombinacyjnych (RIS - Recombinant Inbred Strains)

Serię szczepów wsobnych rekombinacyjnych stanowi zbiór szczepów wyhodowanych z losowo skojarzonych par zwierząt wybranych z drugiego pokolenia mieszańców z krzyżówki między dwoma znanymi szczepami wsobnymi nazywanymi tu szczepami przodków (progenitor strains) charakteryzującymi się odpowiednio brakiem lub ekspresją badanej cechy. Każdy nowy szczep RIS jest homozygotyczny w stosunku do jednego z dwóch alleli wniesionych przez przodków we wszystkich loci, w których przodkowie różnili się. W ten sposób w wyniku losowej rekombinacji niesprzężonych loci każdy szczep z danej serii RIS ma własną szczególną kombinację materiału genetycznego pochodzącego od obu szczepów rodzicielskich. Pierwszą serię szczepów wsobnych rekombinacyjnych wyhodował Bailey w 1971 r. [1] z krzyżówki BALB/c x C57BL/6 i oznaczył ją symbolem CXB składającym się ze skrótów nazw szczepów rodzicielskich rozdzielonych „X”. Ten system oznaczeń szczepów RIS przyjął się i jest obecnie powszechnie stosowany. Szczepy RIS stanowią doskonałe narzędzie do wykrywania nowych sprzężeń i mapowania loci genetycznych warunkujących cechy jednogenowe oraz do badań nad plejotropowym działaniem znanych genów (Swank i Bailey [15]). W ostatnich latach liczba serii szczepów RIS bardzo wzrosła.

Nazewnictwo szczepów kongenicznych rekombinacyjnych (RCS - Recombinant Congenic Strains)

Szczepy te zostały wyhodowane i opisane w 1986 r. przez Demanta i Harta [5]. Pomyślane są jako narzędzie do badania uwarunkowanych genetycznie cech ilościowych kontrolowanych przez kilka współdziałających (addytywnych) genów. Do takich cech zalicza się między innymi oporność i podatność na nowotwory. Schemat kojarzeń i charakterystykę tych zwierząt opisano m.in. w publikacji Demanta i Harta [5].

Dla oznaczania zwierząt pochodzących ze szczepów RCS Demant i Hart wprowadzili następujące symbole np.: seria linii pochodzących z krzyżówki myszy BALB/c x STS oznaczona została symbolem CcS składającym się ze skrótów nazw szczepów rodzicielskich (C=BALB/c, S=STS) rozdzielonych małą literą c. Dla określenia poszczególnych linii w danej serii zastosowano kolejne liczby np. CcS-1, CcS-2, CcS-17.

Zwierzęta transgeniczne

Wydaje się, że spośród wielu modeli wyhodowanych do badań biomedycznych zwierzęta transgeniczne spełniają wieloletnie dążenie, aby do badania różnych schorzeń nękających człowieka uzyskać modele wykazujące taki sam mechanizm procesu chorobowego. Udane próby przenoszenia materiału genetycznego między różnymi komórkami zachęciły do podjęcia badań nad opracowaniem metody pozwalającej na otrzymanie osobnika, który we wszystkich komórkach posiadałby obcy materiał genetyczny. Metodę taką, polegającą na mikrochirurgicznym wprowadzeniu odcinków DNA zawierających jeden badany gen do przedjądrza męskiego zapłodnionych jaj myszy, opracowali Palmiter i Brinster w 1982 r. i 1985 r. [11,12]. Ten udany eksperyment otworzył nowe możliwości. Do chwili obecnej opracowując i stosując różne nowe metody wyhodowano już wiele różnych linii myszy transgenicznych; pozwoliło to na wyjaśnienie mechanizmów licznych procesów biologicznych, których nie udawało się poznać dotychczas stosowanymi metodami.

Pierwszą próbą wprowadzenia standardowej nomenklatury dla myszy transgenicznych był system zaproponowany przez Institute of Laboratory Animal Resources, opublikowany w ILAR News w 1992 r. [8].

Proponowany symbol składa się z następujących części:

TgN(xxxxx)#Bri

gdzie: Tg - wskazuje, że linia myszy jest transgeniczna

N - transgen został wprowadzony przez niehomologiczną wstawkę (xxxxx) - oznaczenie wstawki

# - kolejny numer danej linii

Bri - kod laboratorium, w którym otrzymano daną linię myszy

Przykład: TgN(Mt1TK)1Bri

Oznaczenie to informuje, że linia myszy jest transgeniczna (Tg), wstawka jest niehomologiczna (N), integrowany gen zawiera sekwencje regulatorowe mysiej metallothioneiny (Mt1) oraz gen strukturalny wirusowej kinazy tymidynowej (TK), myszy wyhodowano w laboratorium Brinstera (Bri) i jest to pierwsza linia transgeniczna w tym laboratorium oznaczona nazwą standardową.

Nazewnictwo stad niekrewniaczych

Zasady ujednoliconego nazewnictwa stad niekrewniaczych (outbred stocks) zostały opublikowane po raz pierwszy w 1972 r. przez Festinga i wsp. [6] a pierwszy wykaz zarejestrowanych stad opracował Loosli w 1974 r. [10].

Stado każdego gatunku ssaków laboratoryjnych hodowane co najmniej przez 4 pokolenia w zamkniętej populacji z maksymalnym unikaniem kojarzeń krewniaczych może zostać zarejestrowane i otrzymać swój symbol. Jest to jednak możliwe tylko wtedy, kiedy stosowany system kojarzeń gwarantuje utrzymywanie zmienności biologicznej stada przez szereg lat na takim samym poziomie. Za stado uznać można:

• Uprzednio wsobny szczep po czterech pokoleniach hodowli systemem kojarzeń z unikaniem pokrewieństwa, jeśli system ten był zamierzony i ma być kontynuowany

• Mieszańce F1 dwóch różnych szczepów wsobnych

• „Syntetyczne”, heterozygotyczne populacje pochodzące z mieszańców F1, względnie segregujące mieszańce F2, pod warunkiem, że będą stale odtwarzane z wyjściowych szczepów wsobnych

Odpowiednia wielkość zamkniętej populacji oraz stosowanie określonych systemów kojarzeń stad niekrewniaczych są niezbędnymi elementami charakterystyki stada. Niedopuszczalne jest prowadzenie jakiejkolwiek kierunkowej selekcji.

Symbol stada powinien składać się z 2 - 4 dużych liter poprzedzonych kodem hodowcy lub ośrodka, w którym stado jest utrzymywane. Kod składający się z 1 - 3 liter, z których tylko pierwsza jest duża, oddzielony jest dwukropkiem od symbolu stada.

Przykłady:

Han:NMRI

Ssc:AH

Najważniejszym znakiem rozpoznawczym dla odróżnienia symbolu szczepu wsobnego od symbolu stada niekrewniaczego jest kod hodowcy umieszczony przed symbolem stada i oddzielony od niego dwukropkiem.

Zasady oznaczania stanu zdrowotnego zwierząt laboratoryjnych

Zwierzęta laboratoryjne nie tylko te, u których występują łatwo wykrywalne objawy choroby ale również bezobjawowi nosiciele zakażeń patogennych nie nadają się do doświadczeń, szczególnie do doświadczeń biomedycznych. Bezobjawowe zakażenia mikroorganizmami chorobotwórczymi mogą znacznie skomplikować interpretację wyników badań lub je wręcz zafałszować. Mając na celu wyeliminowanie takich zagrożeń opracowano przy współudziale organizacji międzynarodowych (WHO - World Health Organization, FAO - Food and Agriculture Organization, ILAR - Institute for Laboratory Animal Resources, ICLAS - International Council for Laboratory Animal Science) następującą kategoryzację zwierząt laboratoryjnych:

1. Zwierzęta gnotobiotyczne:

• germ free (GF) - wolne od wszystkich wykrywalnych mikroorganizmów

i pasożytów

• 
  monobionty zwierzęta GF celowo zasiedlone jednym,

• dibionty dwoma lub wieloma określonymi rodzajami

• polibionty mikroorganizmów

2. Zwierzęta SPF (Specified Pathogen Free)

3. Zwierzęta konwencjonalne

• CV-I - kontrolowane, utrzymywane w warunkach częściowej izolacji (semi barrier condition)

• CV - hodowla otwarta

Opracowano też wykazy mikroorganizmów, które powinny być wykluczone u zwierząt danej kategorii i gatunku.

Odrębnym zagadnieniem w dziedzinie nazewnictwa zwierząt laboratoryjnych jest oznaczanie odpowiednimi symbolami ich stanu zdrowotnego. Wyróżniając się określonymi właściwościami środowiskowymi a nie genetycznymi znajdują się właściwie poza zakresem działania Komitetu Standaryzacji Genetycznej Nomenklatury Myszy. Jednak wobec konieczności ustalenia dla nich zasad nazewnictwa grupa pracowników z Jackson Laboratory przedstawiła w 1967 r. pierwszą propozycję, która zasadniczo obowiązuje i jest stosowana do dnia dzisiejszego.

Uzgodnione z Towarzystwem Gnotobiotycznym zasady są następujące:

Zalecono stosowanie symbolu GN dla zwierząt gnotobiotycznych, SPF dla zwierząt wolnych od wybranych specyficznych dla danego gatunku zakażeń, CV dla zwierząt konwencjonalnych.

Symbolami SPF lub GN można określać tylko te zwierzęta, które są pod stałą kontrolą mikrobiologiczną.

Obok symbolu szczepu lub stada dodaje się w nawiasach kwadratowych następujące informacje:

• stan zdrowotny: CV, CV-I, SPF, GN

• rok, w którym zwierzęta przeszły do danej jednostki lub zostały przeprowadzone w stan gnotobiotyczny

• kod osób, które uzyskały dany stan zdrowotny zwierząt lub ośrodka, w którym zostało to dokonane.

Przykład:

BALB/c[SPF]

WAG[SPF95W]

CBA[GN72Lac] - myszy szczepu CBA przeprowadzone w stan gnotobiotyczny w 1972 r. w Laboratory Animal Centre.

Piśmiennictwo:

1. Bailey D.W.: Recombinant inbred strains. Transplantation, 1971, 11, 325-327

2. Brylińska J., Czarnomska A.: Zasady nazewnictwa zwierząt laboratoryjnych. Zwierzęta Lab., 1979, 16 (1-2), 55-62

3. Committee on Standardized Nomenclature for Inbred Strains of Mice. Standardized Nomenclature for Inbred Strains of Mice. Cancer Res., 1952, 12, 602-613

4. Czarnomska A.: Mianownictwo wsobnych szczepów myszy laboratoryjnych. Zwierzęta Lab., 1970, 8 (1-2), 83-88

5. Demant P., Hart A.A.M.: Recombinant Congenic strains - A new tool for analyzing genetic traits determined by more than one gene. Immunogenetics, 1986, 24, 416-422

6. Festing M, Kondo K, Loosli R., Poiley S.M., Spiegel A.: International standardized nomenclature for outbred stocks of laboratory animals. ICLA Bulletin, 1972, 30, 16-17

7. Festing M., Staats J.: Standardized Nomenclature for Inbred Strains of Rats. Transplantation,, 1973, 16, 221-245

8. ILAR News, 1992, 34, 4, 45

9. Klein J.: List of congenic lines of mice. Transplantation, 1973, 15, 137-153

10. Loosli R.: Outbred stocks of laboratory animals: First European Listing. ICLA Bulletin, 1974, 35, 17-22

11. Palmiter R.D., Brinster R.L., Hammer R.E., Traumbauer M.E., Rosenfeld M.G., Birnberg N.C., Evans R.M.: Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein- growth hormone fusion genes. Nature, 1982, 300, 611-615

12. Palmiter R.D., Brinster R.L.: Transgenic mice. Cell, 1985, 41, 343-345

13. Snell G.D.: Histocompatibility genes of the mouse: II. Production and analysis of isogenic resistant lines. J.N.C.I, 1958, 21, 843-877

14. Staats J.: Standardized nomenclature for inbred strains of mice Third listing. Cancer Res., 1964, 24, 147-168

15. Swank R.T., Bailey D.W.: Recombinant inbred lines: Value in the genetic analysis of biochemical variants. Science, 1973, 181, 1249-1252

Kontrola genetyczna zwierząt laboratoryjnych

Alina Czarnomska, Marta Gajewska, Marek Woszczyński, Jadwiga Brylińska

Podstawowymi wymaganiami, których spełnienie jest niezbędne aby wyniki badań z użyciem zwierząt laboratoryjnych były wiarygodne i powtarzalne są stałe, optymalne dla gatunku warunki środowiskowe, odpowiedni stan higieniczny zwierząt oraz ich jakość i jednorodność genetyczna.

Dotychczas wyhodowano wiele szczepów wsobnych, stad niekrewniaczych oraz różnych specjalnych modeli zwierząt charakteryzujących się unikatowym zestawem cech uwarunkowanych genetycznie stanowiących o ich przydatności do określonego typu doświadczeń i testów. Wybór właściwych zwierząt jest jednym z podstawowych czynników warunkujących uzyskanie wartościowych i powtarzalnych wyników badań.

Niezależne hodowle szczepów zwierząt w różnych ośrodkach naukowych doprowadziły do powstania szeregu podszczepów, które mimo stwierdzonych różnic genetycznych zachowały nazwy szczepów wyjściowych uzupełnione symbolem podszczepu [9].

Mimo ścisłego przestrzegania zasad hodowli zawsze należy liczyć się z możliwością powstania i utrwalenia się mutacji. Osobnym zagadnieniem jest sprawa kontaminacji genetycznej, której najczęstszymi przyczynami są: zła organizacja pracy w zwierzętarni, braki w wyszkoleniu personelu, złe „nawyki” hodowlane, niewłaściwe prowadzenie dokumentacji oraz brak dozoru i kontroli.

Wynikiem ewentualnych zmian genetycznych w najlepszym razie może być zauważalna przez hodowcę zmiana cech fenotypowych takich jak np. kolor sierści. Jednak zmiana większości genetycznie uwarunkowanych cech biologicznych często wykrywana jest dopiero w trakcie doświadczenia, gdy wpływa na jego przebieg i w sposób istotny na jakość otrzymanych wyników.

W celu wczesnego wykrywania ewentualnych zmian genetycznych w populacji hodowanych zwierząt w wielu ośrodkach, również krajowych, w latach osiemdziesiątych zaczęto wprowadzać programy monitorowania genetycznego zwierząt dostosowane do potrzeb, zadań i możliwości ośrodka [3,4,13,14,15].

W praktyce genetyczne monitorowanie polega na kontroli utrzymania autentyczności hodowanych szczepów.

W zależności od stosowanych metod oznaczania oraz funkcji oznaczonych markerów podzielono je na kilka podstawowych grup: markery immunologiczne, biochemiczne, cytogenetyczne, morfologiczne oraz stosowane ostatnio coraz częściej markery DNA (mikrosatelitarne).

Monitorowanie genetyczne na podstawie wybranych markerów cech jakościowych.

Markery immunologiczne

W monitorowaniu genetycznym zwierząt laboratoryjnych najczęściej stosowane są antygeny zgodności tkankowej, kodowane przez geny głównego kompleksu zgodności tkankowej MHC oraz antygeny różnicowania limfocytów np.: Thy1.

Wykorzystanie genów głównego kompleksu zgodności tkankowej do kontroli jakości i jednorodności szczepów znalazło szerokie zastosowanie z uwagi na:

• wysoki stopień polimorfizmu

• rola, jaką odgrywają w badaniach immunologicznych

• konieczność monitorowania szczepów szczególnie cennych z racji genotypu MHC (szczepy kongenicznie oporne)

• skuteczność i łatwość wykrywania kontaminacji.

Do oznaczania genów MHC stosuje się metody transplantacyje, metody serologiczne i metody komórkowe.

W metodzie transplantacyjnej najczęściej wykorzystywane są przeszczepy skóry. Test ten pozwala na identyfikację różnic genetycznych w obrębie kompleksu genów zgodności tkankowej oraz na kontrolę jednorodności genetycznej szczepu. Problemy dotyczące metodyki i interpretacji wyników zostały opisane już w 1951 r. przez Billinghama i Medawara [1]. Metoda jest czuła i skuteczna, ujemną jej stroną jest konieczność ponad 100 dniowej obserwacji badanych zwierząt. W około 10 - 15% przypadków odrzucenie przeszczepu spowodowane jest przyczynami technicznymi lub zakażeniem bakteryjnym. Niekorzystną stroną metody transplantacyjnej jest jednak przede wszystkim to, że musi być wykonana in vivo, a zatem powinna być stosowana jedynie w wyjątkowych przypadkach.

Test hemaglutynacji i reakcja cytotoksyczna zależna od komplementu są podstawowymi metodami serologicznymi, w których zastosowanie odpowiednich przeciwciał pozwala na identyfikację antygenów zgodności tkankowej charakteryzujących poszczególne haplotypy MHC [5].

Test cytotoksyczny może służyć zarówno do identyfikacji antygenów MHC jak i do określania antygenów różnicowania limfocytów: Ly, Lyb, TL, Thy1.

Spośród licznych wariantów tego testu najczęściej stosuje się zaproponowany przez Pincusa i Gordona [11] test mikrocytotoksyczny na płytkach Terasaki przy użyciu limfocytów z węzłów chłonnych jako komórek docelowych i świeżej surowicy królika jako źródła komplementu.

Markery biochemiczne

Markerem biochemicznym jest uwarunkowana genetycznie cecha fenotypowa, którą można określić za pomocą technik biochemicznych. W praktyce markerami biochemicznymi są izoenzymy i białka nieenzymatyczne kodowane przez polimorficzne, strukturalne geny. Mnogość oznaczanych markerów biochemicznych i występowanie kodujących je genów na różnych chromosomach przesądzają o ich istotnym znaczeniu dla potrzeb kontroli genetycznej. Każdy szczep wsobny ma ustalony genetyczny profil markerów biochemicznych, który pozwala odróżnić go od innych szczepów i podszczepów. Szczegółowy opis metod stosowanych do oznaczania markerów biochemicznych zawarty został w podręczniku „Zwierzęta Laboratoryjne - Metody Hodowli i Doświadczeń” [16]. Wśród najczęściej stosowanych markerów biochemicznych wymienić można: dehydrogenazę jabłczanową - Mod1(mysz),  łańcuch hemoglobiny - Hbb (mysz), białko pęcherzyków nasiennych - Sup1 (szczur), esterazę - 1 - Es-1 (szczur).

Markery cytogenetyczne

Rozwój cytogenetyki umożliwił wprowadzenie monitorowania genetycznego zwierząt na podstawie analizy ich kariotypu. Zaobserwowano, że zabarwione w odpowiedni sposób chromosomy wykazują specyficzny dla siebie i charakterystyczny dla gatunku układ poprzecznych prążków wzdłuż ramion chromosomów umożliwiający identyfikację par chromosomów i ułożenie kariotypu komórki.

Analizując kariotypy zwierząt ze szczepów wsobnych wykazano szereg morfologicznych cech chromosomów dotyczących m.inn. kształtu, intensywności zabarwienia i wielkości prążków C widocznych po zabarwieniu heterochromatyny okolicy centromeru. Stwierdzono wyraźne różnice w morfologii prążków C pomiędzy poszczególnymi parami chromosomów kariotypu danego gatunku. Cechą charakterystyczną dla wszystkich myszy jest brak prążka C w chromosomie Y. U myszy istnieją również różnice rozkładu heterochromatyny centromerycznej charakterystyczne dla poszczególnych szczepów. Obserwacje te pozwalają na rozróżnianie myszy z niektórych szczepów wsobnych za pomącą badania prążków C.

Również markery chromosomowe powstałe w wyniku translokacji mogą służyć do identyfikacji szczepu. Ich brak lub heterozygotyczność mogą świadczyć o kontaminacji np. myszy szczepu AKR Rb(6;15) posiadające marker powstały w wyniku fuzji centromerycznej chromosomów 6 i 15 łatwo odróżnić badaniem cytogenetycznym od myszy ze szczepu AKR wyjściowego bez tego markera.

Jednakże wykorzystanie markerów cytogenetycznych do monitorowania genetycznego zwierząt z racji czasochłonności, trudności technicznych i wysokich wymagań dotyczących kwalifikacji personelu możliwe jest tylko w specjalistycznych laboratoriach do typowania szczególnych przypadków.

Markery morfologiczne - geny umaszczenia.

Do tej grupy markerów należy wiele cech uwarunkowanych ekspresją jednego genu dotyczących umaszczenia, charakteru okrywy włosowej, nieprawidłowości w budowie szkieletu, które w większości przypadków mogą być rozpoznawane i testowane bez użycia specjalistycznego wyposażenia. Najczęściej w praktyce stosuje się kontrolę genów umaszczenia. Kontrolę taką u myszy albinotycznych przeprowadza się stosując krzyżówki ze zwierzętami ze szczepów barwnych o znanym recesywnym genotypie. W przypadku myszy najczęściej używany jest szczep DBA/2 o genotypie aabbCCdd (a - nie agouti, b - obecnie Tyrp1^b - brązowy, C - obecnie Tyr - nie albinotyczny, d - obecnie Myo5a^d - rozcieńczony). Na podstawie oceny umaszczenia mieszańców F1 wnioskuje się o genotypie zwierzęcia z badanego szczepu. Ponadto na podstawie umaszczenia myszy w pokoleniu F1 można wnioskować o czystości genetycznej szczepów użytych do krzyżowania. Wszystkie zwierzęta pierwszego pokolenia mieszańców powinny być jednakowo umaszczone. Wystąpienie segregacji świadczy o kontaminacji szczepu.

Markery mikrosatelitarne w kontroli genetycznej zwierząt szczepowych.

Postepowanie, podobnie jak w przypadku innych markerów, polega przede wszystkim na stworzeniu profili genetycznych dla poszczególnych, podlegających kontroli szczepów wsobnych. Markery mikrosatelitarne precyzyjnie zmapowane i równomiernie rozproszone w genomie są stosunkowo proste do analizowania.

W badaniach stosuje się najczęściej technikę nieizotopowego PCR i ocenę długości amplifikowanych alleli na żelu agarozowym o wysokiej rozdzielczości. Przy wyborze markerów należy brać pod uwagę następujące kryteria:

• położenie na różnych chromosomach

• odpowiedni poziom polimorfizmu

• obecność unikalnych alleli charakteryzujących poszczególne szczepy

• łatwość rozdziału otrzymywanych fragmentów na żelu agarozowym o wysokiej rozdzielczości

• prawidłowo przebiegającą reakcję PCR

Przy zastosowaniu metody analizy markerów mikrosatelitarnych można przy niewielkim nakładzie kosztów i w raczej krótkim czasie przeprowadzać okresową kontrolę genetyczną hodowanych zwierząt przez porównywanie uzyskiwanych wyników z uprzednio opracowanymi profilami.

Metoda ta, w Polsce nowa, stosowana jest już w wielu ośrodkach światowych zarówno w celu kontroli genetycznej zwierząt, jak też do badania ich genomu i do doświadczeń z wykorzystaniem analizy sprzężeń [7].

Monitorowanie genetyczne na podstawie analizy cech ilościowych.

W monitorowaniu genetycznym prowadzonym na podstawie analizy cech ilościowych najczęściej wykorzystuje się wskaźniki reprodukcyjne i morfometryczne. Prawidłowo prowadzona dokumentacja hodowlana zawiera zwykle informacje dotyczące:

• czasu od skojarzenia do wydania pierwszego miotu

• odstępów czasowych między kolejnymi miotami

• liczby urodzonych młodych

• liczby odchowanych młodych

Powyższe dane mogą służyć do wyliczania wskaźników reprodukcyjnych np. indeks hodowlany (C), średnia liczebność miotu w danej populacji w różnych okresach od urodzenia [2,8]. Szczepy wsobne charakteryzują się zwykle niską wydajnością hodowlaną w przeciwieństwie do stad niekrewniaczych i mieszańców F1. Istotny nieoczekiwany wzrost wartości współczynników reprodukcyjnych może być sygnałem alarmowym sugerującym przeprowadzenie szczegółowej kontroli genetycznej, gdyż może świadczyć o kontaminacji szczepu.

Spośród wielu grup wskaźników morfometrycznych w rutynowym monitorowaniu szczepów wsobnych najczęściej stosuje się określanie wskaźników osteometrycznych: pomiary żuchwy [6], czaszki [10], kości udowej. Do niedawna powszechnie rekomendowany był test mandibularny zaproponowany przez Festinga i Lovella [6].

Wszystkie badania genetyczne prowadzone na podstawie analizy cech ilościowych muszą być zawsze uzupełniane i potwierdzone innymi metodami. Dlatego też obecnie wraz z rozwojem biologii molekularnej umożliwiającej monitorowanie genetyczne zwierząt na poziomie DNA stosowanie cech ilościowych jest coraz bardziej ograniczane.

Kontrola genetyczna stad niekrewniaczych.

Najtrudniejszym zadaniem w hodowli stad niekrewniaczych jest utrzymanie zmienności genetycznej zwierząt na możliwie stałym poziomie przez wiele pokoleń. Systemy kojarzeń i liczebność stad muszą być tak dobrane aby współczynnik wsobności (inbredu) był niższy niż 1% na pokolenie. W populacjach mniejszych niż 100 par niezbędne jest stosowanie wybranych metod kojarzeń rotacyjnych lub tak zwanej metody maksymalnego unikania kojarzeń krewniaczych. W celu zachowania stałego spektrum genetycznego populacji niekrewniaczych w 1981 r. Rapp i wsp. [12] z Centralnego Instytutu Hodowli Zwierząt w Hanowerze wprowadzili metodę tak zwanej liniowej optymalizacji w doborze zwierząt do kojarzeń. Przy zastosowaniu tej metody niezbędna jest jednak charakterystyka wielu wybranych cech ilościowych i jakościowych hodowanych zwierząt, ustalenie normy populacji i charakterystycznej frekwencji klas wartości. Metoda liniowej optymalizacji jest bardzo pracochłonna i kosztowna. W hodowlach, gdzie nie jest możliwe wprowadzenie metody liniowej optymalizacji, można uzyskać ograniczenie i utrzymanie na możliwie jednakowym poziomie zmienności stada prowadząc znaną z genetyki populacyjnej selekcję stabilizującą. Przy jej zastosowaniu do dalszej hodowli wybieramy tylko te osobniki, u których wartości badanych cech mają najniższe odchylenie od normy populacji.

Jak już na wstępie powiedziano w hodowli stad niekrewniaczych niezbędne jest ustalenie normy populacji oraz stosowanie jednego ze znanych systemów kojarzeń rotacyjnych lub metody hodowli z tak zwanym maksymalnym unikaniem inbredu (kojarzeń krewniaczych).

Piśmiennictwo:

1. Billingham R.E., Madawar P.B.: The technique of free skin grafting in mammals. J.Exper.Biol., 1951, 28, 385-402

2. Brylińska J.: Zastosowanie wskaźników reprodukcyjnych i morfometrycznych do kontroli zmienności genetycznej myszy i szczurów ze stad niekrewniaczych. Zwierzęta Lab., 1985, 22(1-2), 3-7

3. Czarnomska A., Kuśnierczyk P., Strządała L., Sitarz M., Woszczyński M., Krysiak E., Zborowska E., Leszczyńska - Czech J., Zioło E., Pajtasz E., Rak J., Kwaśniewska E., Mraz - Dulemba M., Radzikowski Cz.: Genetic monitoring of inbred strains and congenic lines of mice maintained at six scientific centres in Poland. Zwierzęta Lab., 1987, 24(1-2), 29-38

4. Czarnomska A., Sitarz M., Zborowska E.: Kontrola genetyczna myszy laboratoryjnych. II.Analiza wybranych markerów morfologicznych i immunologicznych u myszy z 23 szczepów wsobnych. Zwierzęta Lab., 1983, 20(1-2), 55-66

5. Demant P.: Histocompatibility genes and their use in genetic control of laboratory mice. In: A.Spiegiel, S.Erichsen, H.A. Solleveld (eds.), Animal quality and models in biomedical research. 7^th ICLAS Symposium, Utrecht 1979, Stuttgart - New York: Gustav Fischer Verlag, 299-306

6. Festing M.F.W., Lovell D.P.: Routine genetic monitoring of commercial and other mouse colonies in UK using mandible shape; five years of experience. In: A.Spiegiel, S.Erichsen, H.A. Solleveld (eds.), Animal quality and models in biomedical research. 7^th ICLAS Symposium, Utrecht 1979, Stuttgart - New York: Gustav Fischer Verlag, 341-348

7. Gajewska M., Łukasiewicz D., Rutkowski R., Wirth - Dzięciołowska E: Markery mikrosatelitarne w rutynowym monitorowaniu genetycznym myszy szczepów wsobnych. Doniesienie zjazdowe „Zwierzęta laboratoryjne w nowym tysiącleciu”, 2002, streszczenia str. 18

8. Hedrich J.H.: Principles in genetic monitoring. In H.J.Hedrich (ed.), Genetic monitoring of inbred strains of rats. Stuttgart - New York: Gustav Fischer Verlag,, 1990, 8-10

9. Hsu C-K.: Genetic monitoring. In J.G.Fox, B.J.Cohen, F.M.Loew (eds.), Laboratory animal medicine. New York: Academic Press Inc., 1984, 603-612

10. Pietrowicz D., Lindner P., Wojda K.: Analysis of the usefulness of certain craniometric features in genetic identification of laboratory rats. Z.Versuchstierkd., 1982, 24, 257-261

11. Pincus J.H., Gordon R.C.: A microassay for the detection of murine H-2 antigens. Transplantation, 1972, 12, 509-513

12. Rapp K.G., Burow K., Kluge R.: Monitoring of outbred populations. Zwierzęta Lab., 1981, 18, 2, 25-33

13. Sitarz M., Woszczyński M., Czarnomska A.: Charakterystyka wsobnych szczepów myszy pod względem markerów biochemicznych Mod-1, Gpd-1, Idh-1, Pgm-1, Gpi-1s. Zwierzęta Lab., 1990, 27, 1, 45-52

14. Woszczyński M, Krysiak E., Czarnomska A.: Opracowanie i wdrożenie programu rutynowego monitorowania genetycznego szczepów wsobnych myszy na podstawie wybranych grup markerów różnicujących. Zwierzęta Lab., 1990, 27, 2, 9-16

15. Woszczyński M., Sitarz M., Czarnomska A.: Wstępne wyniki kontroli genetycznej szczurów AUG/W, L-E/W, M520/W, SPRD/W, WAG/W, BN/W. Zwierzęta Lab., 1990, 27, 2, 17-26

16. Zwierzęta Laboratoryjne - Metody Hodowli i Doświadczeń. J.Brylińska, J.Kwiatkowska (red.) Rozdział 6: Kontrola genetyczna. Universitas, 1996, 81-103

Monitorowanie zdrowia zwierząt laboratoryjnych

Marek Woszczyński, Elżbieta Krysiak

Jednym z warunków zmniejszenia liczby zwierząt potrzebnych do właściwego wykonania doświadczenia jest używanie zwierząt o znanym standardzie zdrowotnym. Ma to istotny wpływ na jakość i powtarzalność otrzymywanych wyników. Dlatego też już w latach pięćdziesiątych pod patronatem organizacji międzynarodowych (WHO, FAO, ILAR, ICLAS) wprowadzono podział zwierząt na różne kategorie zdrowotne i opracowano wykazy mikroorganizmów, które powinny być wyeliminowane u zwierząt danej kategorii i gatunku. Również w Polsce podjęto próby standaryzacji zdrowotnej zwierząt używanych do doświadczeń. Jedną z nich było wydane w 1977 r. przez Krajową Spółdzielnię Hodowli Drobnego Inwentarza zobowiązanie prywatnych hodowców do okresowego badania hodowanych zwierząt w kierunku wykrycia bakterii z grup Salmonella, Shigella, Pasteurella pneumotropica, Mycobacterium tuberculosis oraz grzybów i świerzbowców. Z inicjatywy Sekcji ds. Zwierząt Laboratoryjnych SITR - NOT we współpracy z Instytutem Zootechniki w Balicach wydano „Karty Informacyjne do Założeń Technologicznych Produkcji Zwierzęcej: Zwierzęta Laboratoryjne". Oprócz zaleceń dotyczących niezbędnego sprzętu, wyposażenia technicznego i obsługi zwierzętarni znajduje się tam rozdział mówiący o kategoriach zdrowotnych zwierząt i ustalona na podstawie międzynarodowych przepisów lista mikroorganizmów, które powinny być wyeliminowane w ich hodowli. Obecnie podział ten został nieco zmodyfikowany (patrz rozdział" Nazewnictwo..."); uwzględniono np. nie trzy, ale dwie kategorie zwierząt konwencjonalnych:

• Zwierzęta konwencjonalne, kontrolowane pod względem zdrowotnym, utrzymywane w warunkach częściowej bariery sanitarnej

• Zwierzęta konwencjonalne hodowane w warunkach otwartych.

Podział na kategorie zdrowotne bywa różny w różnych krajach i zależy np. od specyfiki regionu i dostępnych metod diagnostycznych. Również wykazy mikroorganizmów, które powinny być wykluczone w hodowli danej kategorii zwierząt ulegają zmianom w zależności od rozwoju nowych technik diagnostycznych i poznawania nowych, uprzednio nieznanych, gatunków bakterii czy wirusów. Ze względu na wyhodowanie różnych szczepów myszy z niedoborami immunologicznymi zakres kontroli rozszerza się o gatunki mikroorganizmów nie znajdujących się w wykazach opracowanych dla zwierząt immunokompetentnych.

Aktualne zalecenia dotyczące zakresu kontroli mikrobiologicznej zwierząt laboratoryjnych są publikowane regularnie przez organizacje takie jak ICLAS (International Council for Laboratory Animal Science) czy SOLAS (Society for Laboratory Animal Science).

Większość zakażeń obecnych u zwierząt laboratoryjnych hodowanych w odpowiednich dla danego gatunku warunkach środowiska przebiega bez wyraźnych objawów klinicznych, jednak ma znaczący wpływ na przebieg i wyniki doświadczeń a w konsekwencji prowadzi do konieczności powtarzania badań. Powoduje to czasem znaczne zwiększenie liczby użytych zwierząt. Na przykład zakażenie wirusem MHV (wirus zapalenia wątroby) może wywoływać m.in. zahamowanie wydzielania immunoglobulin, zwiększenie aktywności fagocytów, zwiększenie wrażliwości na inne mysie patogeny (Eperythrozoon coccoides, K wirus, Schistosoma mansoni), zmianę aktywności enzymów wątrobowych, zwolnienie procesu regeneracji wątroby po częściowej hepatektomii, może też powodować anemię, leukopenię i trombocytopenię. Subkliniczna infekcja MHV może przekształcić się w ciężką postać choroby połączoną z wysoką śmiertelnością po zabiegu tymektomii, podaniu kortyzonu, cyklofosfamidu, chemioterapeutyków, naświetlaniu radioaktywnym i po zastosowaniu halotanowej narkozy. Zakażenie Mycoplasma pulmonis może też wywołać kliniczną postać choroby połączoną ze znaczną śmiertelnością szczególnie w długotrwałych eksperymentach, Powoduje to zafałszowanie wyników wielu badań dotyczących układu oddechowego. Mycoplasma pulmonis może wywołać zwiększenie aktywności komórek NK oraz zmniejszenie humoralnej odpowiedzi na SRBC u szczurów. Zarówno Mycoplasma pulmonis jak i wirus zapalenia wątroby mogą być czynnikiem kontaminujacym guzy przeszczepialne i hodowle tkankowe. Infekcje układu płciowego mogą być przyczyną zmniejszenia parametrów reprodukcyjnych hodowanych zwierząt.

Przy opracowywaniu programu kontroli zdrowia (jej częstości i spektrum kontrolowanych mikroorganizmów) należy brać pod uwagę następujące czynniki:

• Kategorię zdrowotną i warunki hodowli zwierząt

• Rodzaj doświadczeń, do których będą służyły zwierzęta

• Stopień zagrożenia przeniesienia infekcji z innych populacji gryzoni

• Przewidywana rola danych patogenów w określonym doświadczeniu

• Względy ekonomiczne

• Zaplecze techniczne - możliwości zastosowania określonych technik diagnostycznych

Monitorowanie zdrowia powinno obejmować kontrolę mykologiczna, parazytologiczną, bakteriologiczną i wirusologiczną oraz badanie anatomopatologiczne.

W kontroli wirusologicznej obecnie stosuje się najczęściej metody serologiczne takie jak test ELISA, test immunofluorescencji (IFA) i test zahamowania hemaglutynacji (HI) oraz metody biochemiczne i molekularne przy identyfikacji wirusa LDV (Lactic Dehydrogenase Elevating Virus).

W kontroli bakteriologicznej najczęściej stosuje się posiewy z wybranych narządów na podłoża namnażające a następnie identyfikację drobnoustrojów przy pomocy odpowiednich zestawów np. API SYSTEM. W niektórych przypadkach stosuje się również metodę PCR (np. do identyfikacji Helicobacter sp., Mycoplasma sp.), test ELISA (Mycoplasma sp., Clostridium piliformis) oraz w pewnych przypadkach np. przy wystąpieniu charakterystycznych zmian w wątrobie w chorobie Tyzzera, wywoływanej przez Clostridium piliformis, badanie histopatologiczne.

W kontroli parazytologicznej najczęściej stosuje się metody mikroskopowe a w niektórych przypadkach test ELISA i PCR.

Zwierzęta sprzedawane przez ośrodki hodowlane powinny mieć zawsze certyfikat zdrowia uwzględniający zakres i częstość prowadzonej kontroli.

Na przykład certyfikat z Jackson Laboratory zawiera:

• Wykaz badanych mikroorganizmów z podziałem na wirusy, bakterie i mykoplazmy, pasożyty zewnętrzne i wewnętrzne

• Rodzaj próby - np. surowica, posiew z jelita, posiew z nosogardzieli

• Metodę - np. ELISA, PCR, posiew na odpowiednie podłoże

• Częstotliwość badań wykonywanych w kierunku identyfikacji konkretnych mikroorganizmów

• Wyniki ostatnich 4 badań (okres jednego roku) - liczba wyników pozytywnych w stosunku do liczby zbadanych zwierząt

• Numer (symbol) kontrolowanego pomieszczenia lub zespołu pomieszczeń

Zalecane piśmiennictwo:

1. Infectious diseases of mice and rats. National Academy Press, Washington, D.C., 1991

2. Recommendations for the health monitoring of rodent and rabbit colonies in breeding and experimental units. Laboratory Animals, 2002, 36, 20-42

3. List of pathogens for specification in SPF laboratory animals. SOLASA, 1988

4. Veterinary public health reports. Guidelines for breeding and care of laboratory animals. ISS/WHO/FAO-CC/IZSTe/94.23, 1994

5. Karty Informacyjne do Założeń Technologicznych Produkcji Zwierzęcej: Zwierzęta Laboratoryjne. Instytut Zootechniki, Kraków, 1983

1

16

---