Zwierzęta laboratoryjne i procedury doświadczalne

Zwierzę doświadczalne- każde zwierzę, które przygotowujemy do eksperymentu i przeprowadzamy go na nim (dotyczy zwierząt kręgowych, o bezkręgowcach raczej nie), np. przepiórka japońska, chomiki, szczury, myszy, świnka morska, królik, pies, kot, inne gatunki gryzoni, ssaki wyższe (małpy)

Zwierzę laboratoryjne- zwierzę wyhodowane w licencjonowanych hodowlach specjalnie do celów doświadczalnych

Badania z wykorzystaniem zwierząt laboratoryjnych:

• Środowisko- 25%

• Rolnictwo- 25%

• Przemysł- 40%

• Żywność (konserwanty)- 12%

• Gospodarstwo- 0,001%

USA- ok. 15mln procedur

EU- 11mln

Japonia- 5mln

Kanada- 2 mln

Szwajcaria> 1mln

Całkowita światowa liczba badań z użyciem zwierząt laboratoryjnych może przekroczyć 50mln rocznie.

• Eksperymenty zwierzęce

• Procedury (normalne zwierzęta doświadczalne)

• Procedury (zwierzęta modyfikowane genetycznie)

Do doświadczeń:

• Myszy, szczury- 83%

• Ryby, płazy, gady, ptaki- 15%

• Króliki- 0,7%

• Owce, krowy, świnie- 1,6%

• Psy, koty- 0,2%

• Naczelne- 0,12%

Badania biomedyczne:

• Rozwój nowych metod terapii i profilaktyki-28%

• Podstawowe badania biologiczne i medyczne- 31%

• Testowanie bezpieczeństwa niemedycznych produktów używanych w gospodarstwie, rolnictwie, przemyśle- 2%

• Hodowla zwierząt laboratoryjnych- 37%

• Rozwój nowych metod diagnozowania- 2%

Gatunki zwierząt- kierunki badań

Szczury, myszy, inne gryzonie…

• Szczepionka na błonicę

• Szczepionka na dur plamisty

• Badania nad starzeniem się i chorobą Alzheimera

• Badania nad nowotworami i żywieniem

• Dystrofia mięśni

• Badania nad chorobami nerek

• Badania kości

• Przeszczepy skóry

• Odkrycie penicyliny jako antybiotyku

• Szczepionka na polio

• Szczepionka na odrę

• Regulacja cholesterolu

• Hormonalne leczenie nowotworów

• Badania raka piersi

Chomiki (syryjski, europejski, chiński):

• Parazytologia

• Wirusologia

• Stomatologia

• Onkologia

• Immunologia

• Badania nad teratogennością

Króliki:

• Szczepionka przeciw wściekliźnie

• Pierwsza operacja zaćmy

• Przeszczepy rogówkowe

• Zależność między wirusami a rakiem

• Badania nad odpornością nabytą

• Badania cholesterolu

• Efekty starzenia się

• Choroby mięśni

• Testowanie bezpieczeństwa produktów

• Badania metabolizmu leków

• Badania żywieniowe (bardziej wrażliwe na niedobory żywieniowe niż rasy mniejszej)

Świnka morska:

• Diagnostyka chorób infekcyjnych

• Toksykologiczna

• Immunologiczna

• Doświadczalne wywoływanie szkorbutu

• Izolowanie organów (macica, jelito cienkie) do badań farmakologicznych

Pies (beagle):

• Badania sercowo-naczyniowe

• Techniki CPR (cardiopulmonary resuscitation)

• Badania wzroku (jaskra, zaćma)

• Badania procesów trawienia

• Terapeutyczne użycie insuliny

• Przeszczepianie szpiku kostnego

• Zszywanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych

• Badania procesów oddechowych

• Terapia anemii

• Badania nad cholesterolem

Małpy (marmozety, makaki):

• Szczepionka przeciw polio

• Na różyczkę

• Na WZW typu B

• Leczenie żółtej febry

• Odkrycie czynnika Rh we krwi

• Leczenie objawów choroby Parkinsona

• Badania nad AIDS, odrą, znieczuleniami, metabolizmem leków, chorobami przyzębia

Szympanse, goryle, orangutany- wykorzystywanie w badaniach zabronione

Krowy i świnie:

• Szczepionka przeciw ospie

• Przeszczepy narządów

• Badania cukrzycy

• Rozwój tomografii komputerowej

• Badania krążenia i chorób serca

• Badania osteoporozy i zapalenia stawów

Ptaki, ryby, gady:

• Szczepionka na tężec

• Badania nad malarią

• Lek na chorobę beri-beri

• Użycie eteru jako znieczulenia

• Leczenie odmy

• Znaczenie witamin A,C,D

• Badania neurologiczne

• Badania nad rakiem wątroby

• Badania cukrzycy

• Badania choroby wieńcowej serca

Rozwój ustawodawstwa o ochronie zwierząt

Konwencja Europejska :

Zwierzęta muszą być „nabyte bezpośrednio lub [...] pochodzić z zarejestrowanych ośrodków hodowlanych”

(art. 21, ust. 1)

Konwencja zabrania używania do doświadczeń bezpańskich zwierząt udomowionych

(art. 21, ust. 3)

Statystyczne dane wykorzystania zwierząt muszą być publicznie dostępne

(art. 27, ust. 1)

Rozwój ustawodawstwa o ochronie zwierząt

• 1924 r. Anglia - pierwsza ustawa zawierająca zasady ochrony zwierząt w związku z eksperymentowaniem na nich

• Polska 22.III.1928 r. - rozporządzenie Prezydenta Rzeczpospolitej o ochronie zwierząt, działające na mocy ustawy, uzupełnione w 1959 r. rozporządzeniem Ministra Szkolnictwa Wyższego /w całości poświęcone zagadnieniom dokonywania doświadczeń na zwierzętach/

• Stany Zjednoczone - problemy doświadczeń na zwierzętach laboratoryjnych unormowane od 1978 r. przez Food and Drug Administration jako postanowienia dobrej praktyki laboratoryjnej (good laboratory practice - GLP) dotyczące badań nieklinicznych. Przepisy stosowane w ramach Europejskiego Programu Badań Biomedycznych.

Organizacje Międzynarodowe:

• Międzynarodowy Komitet do Spraw Zwierząt Laboratoryjnych ICLA 1956 r.

• normy prawne eksperymentowania na zwierzętach

• warunki utrzymania i hodowli zwierząt laboratoryjnych

• sposób przeprowadzania doświadczeń

• Międzynarodowa Rada do Spraw Wiedzy o Zwierzętach Laboratoryjnych - ICLAS 1979 r.

• Europejska Konwencja w sprawie ochrony zwierząt kręgowych, wykorzystywanych dla celów doświadczalnych i innych celów naukowych- 1986 r. Strasburg (11 państw założycieli Rady Europy)

USTAWA O OCHRONIE ZWIERZĄT z dnia 21 sierpnia 1997 r.- Przepisy ogólne:

Art. 1.1.

Zwierzę, jako istota żyjąca, zdolna do odczuwania cierpienia, nie jest rzeczą.

Człowiek jest mu winien poszanowanie, ochronę i opiekę.

Dziedziny, w których dopuszczalne jest wykorzystywanie żywych zwierząt:

Konwencja Europejska (art. 2)

• zapobieganie chorobom i utracie zdrowia ludzi i zwierząt

• edukacja chirurgiczna (kształcenie i szkolenie)

• fizjologiczne badania podstawowe

• ochrona środowiska

• badania naukowe

• medycyna sądowa (dochodzenia sądowe)

Czerwona księga Waszyngtońska- lista zwierząt zagrożonych wyginięciem

Zwierzęta:

• doświadczalne

• laboratoryjne

• dzikie(wolnożyjące)

• bezdomne

Zwierzęta- zwierzęta kręgowe, w tym dzikie lub zdolne do rozmnażania się formy larwalne z wyłączeniem formy płodowych i embrionalnych

Zwierzęta dzikie (wolno żyjące) - zwierzęta nieudomowione, żyjące w warunkach niezależnych od człowieka

Zwierzęta synantropijne-związane z ludźmi

Zwierzęta synurbijne- związane z wytworami „świata”

Zwierzęta bezdomne - zwierzęta domowe lub gospodarskie, które uciekły, zabłąkały się lub zostały porzucone przez człowieka, i co do których nie ma możliwości ustalenia ich właściciela lub innej osoby, pod której opieką trwale dotąd pozostawały;

Dopuszcza się wykorzystywanie do doświadczeń zwierząt:

-gospodarskich, dzikich, zagrożonych wyginięciem:

• jeśli doświadczenie ma na celu ich ochronę

• ich wykonanie jest niezbędne do osiągnięcia ważnego celu biomedycznego w przypadku gdy dany gatunek jest jedynym przydatnym do tego celu

Doświadczenie- każdą formę wykorzystania zwierzęcia do badań naukowych, testów i celów dydaktycznych, mogącą wywołać u niego ból, cierpienie, strach lub trwałe uszkodzenie w jego organizmie, w tym działania mające na celu lub mogące spowodować urodzenie się zwierzęcia cierpiącego na którykolwiek z tych stanów, także wtedy gdy wyeliminowano ból, cierpienie, strach lub skutki trwałego uszkodzenia przez skuteczne użycie odpowiedniego znieczulenia lub innych środków, z wyłączeniem metod najmniej bolesnego znakowania zwierząt; doświadczeniem jest również uśmiercenie zwierzęcia do badań naukowych, testów i celów dydaktycznych;

Znakowanie:

• chipy podskórne

• tatuaże (kiedyś psy)

• kolczyki(bydło, trzoda)

• obrączki

• nie znakuje się szczurów (czasem znakuje się tylko w celu policzenia: nacięcia na małżowinach usznych- setki, usuwanie paliczków u kończyn- tysiące)

Doświadczenie rozpoczyna się, gdy zwierzę po raz pierwszy zostało przygotowane do obserwacji, a kończy się, gdy zwierzę zostało przekazane pod opiekę albo uśmiercone. Zwierzę nie może być powtórnie wykorzystane do doświadczenia powodującego silny ból, strach lub cierpienie.

Zabrania się:

• stosowania środków lub procedur mających na celu pozbawianie zwierząt używanych do doświadczeń zdolności wydawania głosu;

• przeprowadzania dla celów dydaktycznych doświadczeń powodujących cierpienie zwierząt, jeżeli cel ten można osiągnąć w inny sposób;

• zakaz stosowania kosmetyków.

Krajowa Komisja Etyczna do spraw doświadczeń na zwierzętach:

• 12 członków, przedstawicieli nauk biologicznych, medycznych, rolniczych, weterynaryjnych, humanistycznych

• 3 przedstawicieli organizacji pozarządowych, których celem jest ochrona zwierząt

• kadencja trwa 4 lata

Metody alternatywne- metody badawcze lub dydaktyczne, które umożliwiają wyeliminowanie użycia żywych zwierząt, zmniejszenie ich liczby lub złagodzenie doświadczenia (badania epidemiologiczne, badania in vitro).

Zasada 3R: zasada humanitarnej metodyki doświadczalnej

1. Zastąpienie ( modelami badawczymi nie odczuwającymi cierpienia, metody in vitro, hodowle komórkowe i tkankowe, bezkręgowce)

2. Zmniejszenie liczby zwierząt (wykorzystywanie metod statystycznych)

3. Doskonalenie (zmniejszenie cierpienia zwierząt przez stosowanie mniej inwazyjnych metod)

Metody alternatywne: alternatywy doświadczeń związanych ze zwierzętami transgenicznymi:

• na ludzkich tkankach i komórkach (komórki macierzyste)

• mikromacierze DNA, chipy DNA

• modelowanie komputerowe ( mikrofluidy np. sztuczny układ krwionośny; zaawansowane technologie skanowania)

Czynniki wpływające na wynik doświadczenia:

1. Środowisko i klimat

2. Fazy życia (wiek, dojrzałość płciowa, cykl płciowy, ciąża, laktacja)

3. Klatki (rozmiar, materiał, kształt)

4. Ściółka (jakość, ilość, zmiany ściółki)

5. Eksperyment

6. Środowisko mikrobiologiczne

7. „Handling” stymulacja młodych ( jak człowiek oddziałuje dotykiem na młode→ dotykanie stymuluje rozwój)

8. Dieta (skład, ilość, system karmienia)

9. Przewożenie (transport)

10. Woda (jakość, ilość, dostępność)

11. Czynniki społeczne (zwierzę-zwierzę, zwierzę-klatka, zwierzę-człowiek)

Utrzymywanie zwierząt doświadczalnych

Zwierzęta doświadczalne w jednostkach doświadczalnych, jednostkach hodowlanych lub u dostawców powinny być utrzymywane:

1) w obiekcie zapewniającym odpowiednie dla danego gatunku warunki środowiskowe, w tym niezbędną swobodę ruchu, pożywienie i wodę oraz opiekę gwarantującą utrzymanie ich w zdrowiu;

2) w sposób umożliwiający zaspokajanie ich podstawowych potrzeb życiowych, uwzględniając specyfikę danego gatunku.

W jednostce doświadczalnej, jednostce hodowlanej oraz u dostawcy zapewnia się:

• Codzienną kontrolę warunków środowiska, dobrostanu i stanu zdrowia zwierząt

• Niezwłoczne usuwanie stwierdzonych nieprawidłowości lub powstałego u zwierząt bólu i cierpienia

Rozwój szczura laboratoryjnego

Rozwój prenatalny:

Dzieli się na 2 etapy:

1. Okres przedimplantacyjny- od chwili zapłodnienia do momentu implantacji

2. Okres poimplantacyjny- od momentu pojawienia się łożyska do chwili porodu

Rozwój postnatalny:

Dane o rozrodzie szczura laboratoryjnego:

Liczba młodych- 6-12 szt

Masa noworodków - 4-5 g

Wiek odsadzonych- 28 dni

Min. powierzchnia podłogi w klatce- 350cm²

Min. wysokość klatki- 14cm

Wiek zwierząt

Zwierzęta określonego gatunku rasy, szczepu, w tym samym wieku często różnią się między sobą masą ciała- wynik zmienności biologicznej (liczebność miotu, zagęszczenie w klatce, temperatura otoczenia). Wiek zwierząt wraz z określeniem masy ciała wydaje się najwłaściwszym kryterium doboru zwierząt.

Makroklimat i mikroklimat

• Pory roku

• Temperatura

• Gatunkowa strefa obojętności cieplnej tzn. zakres temp., w którym wytwarzanie i oddawanie ciepła jest optymalna (gryzonie laboratoryjne- 20-22ºC (±2ºC))

• Zależność między temp. otoczenia a: toksycznością preparatów, czasem trwania reakcji zwierząt, efektem działania preparatów

Gatunki zwierząt, grupy gatunków	Optymalny przedział temperatury (ºC)
Zwierzęta naczelne z Nowego Świata	20-28
Myszy, szczury, chomiki, myszoskoczki, świnki morskie, zwierzęta naczelne ze Starego Świata, przepiórki	20-24
Króliki, koty, psy, łasice, drób, gołębie	15-21
Świnie, krowy, bydło, owce	10-24

• Oświetlenie- regulacja doby świetlnej w stały, zwykle 12-godzinny dzienno-nocny rytm

• Wilgotność- optymalna wilgotność pomieszczeń- ok. 55% wilgotności względnej (±5%)

• Ciśnienie

• Skład, wymiana powietrza

• Zapach- naturalny, fekalia, mocz

• Dźwięki

• Klatki- liczebność (szczury 1-8; (3,4);(6,8)), izolacja- agresja, nadmierne zagęszczenie- stres

• Ściółka- wióry z drzew liściastych bez granulatów

Dźwięki

• Względne natężenie hałasu w pomieszczeniu, dla zwierząt nie powinno przekraczać 60dB

• Podczas przeprowadzania badań powinno być ograniczane do 35dB

• Dźwięki powyżej 60dB powodują u zwierząt wady słuchu i przy 130dB ból

• Szczególne niebezpieczeństwo niosą ze sobą dźwięki niesłyszalne dla człowieka o 17kHz, powodują one hamowanie lub pobudzanie aktywności, stres, przez co zmienia się ich reaktywność

CZYNNIKI ŚRODOWISKOWE

↓

GENOTYP

(25% wpływu na reaktywność modelu doświadczalnego)

↓

FENOTYP

↓

PRZYGOTOWANIE → DRAMATYP ← METODYKA

DO DOŚWIADCZEŃ DOŚWIADCZEŃ

↓

WYNIKI DOŚWIADCZENIA

Dramatyp- wszystko co dotyczy przygotowania doświadczenia, transportu, premedykacji, operacji, obserwacji (czyli wszystko to metodyka) czyli dramaturgia eksperymentu

Standaryzacja czynników środowiskowych dotyczy :

• metod i warunków hodowli zwierząt doświadczalnych;

• okresu przygotowawczego do eksperymentu;

• metod i technik eksperymentalnych.

Zwierzęta o ujednoliconym dramatypie (defined laboratory animals)- zwierzęta o ustalonej charakterystyce hodowane pod stałą kontrolą genetyczną i zdrowotną, w ściśle określonych warunkach środowiskowych.

Przygotowanie zwierząt do doświadczeń

• Transport

• Adaptacja

• Dobór zwierząt do grup doświadczalnych- zminimalizowana zmienność między grupami, zmienność w każdej grupie odpowiada zmienności w obrębie danej populacji (stada lub szczepu)

• Po transporcie→ zalecany okres kwarantanny (przed doświadczeniem) bez względu na czas podróży

Np. mysz, szczur 5-15 dni( najczęściej tydzień)

Metoda tworzenia grup doświadczalnych:

• losowa, np. przy użyciu tabel, liczb losowych- biometria

• przypadkowa

• selekcyjna- metoda doboru „genetycznie zbilansowanych osobników”

Status higieniczny zwierząt laboratoryjnych

Zasady oznaczania stanu zdrowotnego zwierząt laboratoryjnych

Zwierzęta laboratoryjne, u których występują łatwo wykrywalne objawy chorobowe oraz bezobjawowi nosiciele zakażeń patogennych nie nadają się do doświadczeń, szczególnie doświadczeń biomedycznych.

Kategoryzacja zwierząt laboratoryjnych opracowana przy udziale organizacji międzynarodowych:

• WHO- World Health Organization

• FAO- Food and Agriculture Organization

• ILAR- Institute for Laboratory Animal Resources

• ICLAS- International Council for Laboratory Animal Science

Gnotobiologia

Nauka o życiu bez wpływu innych organizmów na badany organizm

Zwierzęta
Gnotobiotyczne	Agnotobiotyczne
GF	Mono-di-polibionty		SPF		Konwencjonalne CV
						CVI		CVII

Gnotobiotyczne- GN-(gnotos- znany, bio- życie)- zwierzęta, u których wszystkie wykrywalne formy życia są znane

GF(germ free)- wolne od wszystkich wykrywalnych form żywych organizmów, mikroorganizmów, pasożytów

• Hodowla w całkowitej izolacji od środowiska zewnętrznego, w izolatorach

• Zwierzęta otrzymuje się przez histerektomię aseptyczną w jałowych warunkach izolatora operacyjnego

• Młode karmi i wychowuje bezbakteryjna mamka w izolatorze hodowlanym

• Wszystkie materiały wprowadzone poprzez śluzę do izolatora są jałowe

• Obowiązuje stała kontrola mikrobiologiczna

Zwierzęta mikrobiologicznie zdefiniowane mono,di,polibionty- zwierzęta GF celowo zasiedlone jednym, dwoma lub wieloma określonymi rodzajami mikroorganizmów

Agnotobiotyczne- zwierzęta, u których wykrywalne formy życia są poznane częściowo lub zupełnie nieznane

Zwierzęta SPF (Specified Pathogen Free)- najwyższy poziom czystości mikrobiologicznej w grupie hodowli zwierząt agnotobiotycznych

• Wolne od określonych, swoistych dla danego gatunku patogenów, dopuszczalna jest mikroflora niepatogenna nabyta spontanicznie od środowiska lub od ludzi

• Bardzo wysoki standard higieniczny

• Odtworzenie hodowli odbywa się ze zwierząt GF

• Obowiązuje stała kontrola mikrobiologiczna

Zwierzęta konwencjonalne CV

CVI- kontrolowane, utrzymywane w warunkach częściowej izolacji (semi barier condition)- zwierzęta wolne od patogenów nie przechodzących przez łożysko, utrzymywane w warunkach wysokiego standardu higienicznego w strefie chronionej nie zawsze kompletną barierą higieniczną

CVII- hodowla otwarta- zwierzęta wolne od epizodycznych patogenów swoistych dla danego gatunku, utrzymywane w możliwej izolacji od środowiska zewnętrznego, do odtworzenia hodowli służą zwierzęta SPF i CVI

Kontrola zdrowia zwierząt SPF i konwencjonalnych

Badania kierunkowe w Polsce:

• 13 gatunków bakterii

• 9 gatunków wirusów

• Stwierdzić lub wykluczyć obecność Mycoplasma sp. i grzybów chorobotwórczych

• Zbadać obecność gatunków 8 endo i 2 ektopasożytów

Stopień patogenności większości mikroorganizmów wymienionych w listach ośrodków hodowlanych

1. zdecydowane patogeny

2. warunkowe patogeny; powodujące infekcje w warunkach immunosupresji (stłumienie odporności)

3. mikroorganizmy o niskiej patogenności

4. mikroorganizmy syntetyzujące zoonozy

5. wirusy o zróżnicowanej patogenności, powodujące infekcje utajone bez objawów klinicznych, wpływające na wynik doświadczeń związanych z układem immunologicznym

6. pasożyty zwykle niskiej patogenności, lecz patogenne dla zwierząt z niedoborami w układzie immunologicznym

Badania w kierunku wykrycia ektopasożytów

- wszystkie ektopasożyty (stawonogi)- wszy, pchły, roztocze niedopuszczalne w SPF, CV

- wszystkie grzyby chorobotwórcze- niedopuszczalne w SPF, CVI, CVII

Badania w kierunku wykrycia endopasożytów

- pierwotniaki- wiciowce, pełzaki, zarodziowce, orzęski

- robaki- przywry, tasiemce (formy larwalne, dorosłe), nicienie

Wg norm polskich niepożądane w SPF, CVI

Badania w kierunku wykrycia Mycoplasma sp.

Mycoplasma sp.- patogen warunkowy, egzystuje często u organicznych drobnych gryzoni jako komensal, nie dając klinicznej postaci choroby. Ujawnia się u starszych zwierząt w warunkach immunosupresji, pod wpływem stresujących czynników eksperymentu oraz w doświadczeniach długoterminowych. Wg norm polskich niepożądane w SPF, CVI.

Wirusy

Testy przeprowadza się na ogół raz w roku oceniając 20-30 surowic otrzymanych ze zwierząt z jednego pomieszczenia hodowlanego. Z gryzoni laboratoryjnych wyizolowano około 30 gatunków wirusów (najwięcej dotyczy naturalnych zakażeń myszy).

Obecność niektórych wirusów w organizmie zwierząt wpływa niekorzystnie na:

- tempo przemian metabolicznych

- immunosupresję organizmów

- ocenę wyników transplantacji nowotworów

Program kontroli zdrowia zwierząt laboratoryjnych- uwzględniane czynniki

• kategoria zdrowotna i warunki hodowli zwierząt

• rodzaj doświadczeń, do których będą służyły zwierzęta

• stopień zagrożenia przeniesienia infekcji z innych populacji gryzoni

• przewidywane role danych patogenów w określonym doświadczeniu

• względy ekonomiczne

• zaplecze techniczne- możliwość stosowania określonych technik diagnostycznych

Monitorowanie zdrowia zwierząt laboratoryjnych

• Kontrola wirusologiczna- metody serologiczne- test ELISA, test immunofluorescencyjny (IFA), test zahamowania hemaglutynacji (HI), metody biochemiczne i molekularne

• Kontrola bakteriologiczna- posiewy z wybranych narządów, badania histopatologiczne

• Kontrola parazytologiczna- metody mikroskopowe, test ELISA i PCR

• Kontrola mykologiczna

• Badania anatomopatologiczne

Skala inwazyjności badań na żywych kręgowcach

Przy określaniu stopnia inwazyjności należy uwzględnić:

• Gatunek zwierzęcia- poziom organizacji kognitywnej i emocjonalnej- różna tolerancja tych samych procedur przez różne gatunki

• Zastosowanie humanitarnego zakończenia (humane endpoints)

• Możliwość kompensacji cierpień w przypadku inwazyjnych doświadczeń, po których zwierzęta mają pozostać przy życiu

Skala inwazyjności badań na żywych kręgowcach

• STOPIEŃ 1 - Procedury nieinwazyjne

• STOPIEŃ 2 - Procedury powodujące lekki chwilowy ból, stres lub długotrwały lekki dyskomfort

• STOPIEŃ 3 - Procedury powodujące umiarkowany ból/stres

• STOPIEŃ 4 - Procedury powodujące silny ból/stres i zwykle nieodwracalne uszkodzenie ciała i funkcji psychicznych

• STOPIEŃ X - Niedopuszczalne procedury powodujące skrajne cierpienia, np. podanie kurary, substancji zwiotczających mięśnie- uduszenie przy pełnej świadomości, głodzenie, topienie, wywoływanie choroby popromiennej

Zabiegi muszą być prowadzone w warunkach znieczulenia i premedykacji.

Hodowla zwierząt laboratoryjnych

Polega na dwóch podstawowych działaniach: selekcji i doborze osobników do kojarzeń. Genetycznym efektem są zmiany w częstości występowania określonych genów i genotypów w populacji, w wyniku czego powstają nowe szczepy, rasy, stada i mieszańce.

Rasy

Pierwotnie w zoologii, w zależności od przyjętych kryteriów podziału wyróżniono:

• Rasy geograficzne- kategoria zastąpiona we współczesnej systematyce przez podgatunek

• Rasa fenotypowa- grupa o wspólnym fenotypie, termin używany do dziś, nazywany rasą lub odmianą

• Rasa ekologiczna- populacja zajmująca dany biotop

• Rasa fenologiczna- populacja o zsynchronizowanym cyklu biologicznym

Selekcja

Termin określający wybór zwierząt (roślin) do rozmnażania, powoduje zmiany frekwencji genów w populacji. Różnicuje on zwierzęta (rośliny) pod względem szansy pozostawienia potomstwa. W wyniku selekcji prowadzonej w stadzie zwierząt wyodrębnione zostają dwie grupy zwierząt: wyselekcjowane i wybrakowane.

Wyróżnia się selekcję naturalną i sztuczną.

Dobór naturalny (selekcja naturalna)

-Jeden z mechanizmów ewolucji biologicznej, prowadzący do ukierunkowanych zmian w populacji zwiększający ich przeciętne przystosowanie (adaptacja) do warunków środowiska poza okresem wymierania.

-Miarą sukcesu w doborze naturalnym jest dostosowanie (fitness), można je rozpatrywać na poziomie osobników lub poszczególnych gatunków.

-Organizmy posiadające korzystne cechy mają większe szanse na przeżycie i rozmnażanie, co prowadzi do zwiększenia częstości występowania korzystnych genów w populacji

Dobór naturalny wg K. Darwina i A. Wallace'a jako główny mechanizm prowadzący do kierunkowych zmian w procesie ewolucji

Rodzaje doboru naturalnego ze względu na kierunkowość:

• Dobór stabilizujący- eliminuje osobniki o skrajnej intensywności cech

• Dobór kierunkowy- eliminuje osobniki o skrajnie małej lub dużej intensywności cech

• Dobór różnicowy- eliminuje osobniki o umiarkowanej intensywności cech, odpowiada to powstaniu dwóch nowych odmian/podgatunków lub gatunków w zależności od liczby badanych cech

• Dobór apostatyczny- prowadzący do dużego zróżnicowania osobników populacji w wyniku preferowania organizmów o cechach nieprzeciętnych

Sztuczna selekcja

Proces celowego, dokonywanego przez ludzi wyboru osobników do rozrodu ze względu na daną cechę użytkową. Proces powszechnie wykorzystywany w hodowli zwierząt. Pozwala ograniczyć heterozygotyczność populacji hodowlanych i uzyskać bardzo wiele odmian o pożądanych cechach np. krów o większej mleczności, sile u zwierząt pociągowych.

Dobór sztuczny

Jest szczególnym przypadkiem doboru naturalnego, gdzie dostosowanie jest warunkowane subiektywną oceną i działaniami hodowli. Zwykle produkuje osobniki o cechach nieprzeciętnych w warunkach naturalnych.

Metody hodowli

1. Kojarzenie w pokrewieństwie (chów wsobny, hodowla wsobna, kojarzenie krewniacze, hodowla inbredowa, inbreeding)- kojarzenie zwierząt spokrewnionych

2. Hodowla liniowa (line breeding)- określa kojarzenie w silnym (np. półrodzeństwie) ale nie ścisłym pokrewieństwie (np. syn × matka, ojciec × córka)

3. Krzyżowanie (outcross)- hodowla bez pokrewieństwa

Rasy

W zootechnice rozróżnia się 3 typy ras w zależności od stopnia ingerencji człowieka w ich powstanie. Wyróżnikiem ras są przede wszystkim cechy fenologiczne i fenotypowe:

• Rasy prymitywne- powstałe głównie w wyniku presji środowiskowej

• Rasy kulturalne- powstałe w wyniku doboru sztucznego

• Rasy przejściowe- powstałe w wyniku skrzyżowania ras prymitywnej i kulturalnej

POKREWIEŃSTWO - prawdopodobieństwo posiadania takiego samego genotypu przez osobniki mające wspólnych przodków.

WSOBNOŚĆ - współczynnik wsobności (inbredu) - prawdopodobieństwo homozygotyczności potomka wynikające z faktu pokrewieństwa rodziców.

Kojarzenie krewniacze (inbredowanie)

Polega na kojarzeniu zwierząt spokrewnionych przez wspólnych przodków (w stopniu wyższym niż wartość średniego spokrewnienia populacji). To główna z metod hodowlanych, powoduje wzrost homozygotyczności potomstwa oraz wyodrębnienie genetyczne zróżnicowanych linii hodowlanych. Zanika zmienność genetyczna, może nastąpić uzewnętrznienie się pewnych kombinacji genowych w populacji i ich utrwalenie wśród potomstwa. Do negatywnych następstw należy częste ujawnianie się recesywnych genów letalnych.

W zależności od stopnia spokrewnienia mierzonego wskaźnikiem pokrewieństwa (R) wyróżnia się:

• Kojarzenie krewniacze kazirodcze R>=0,5

• Kojarzenie krewniacze właściwe R>=0,125

• Kojarzenie krewniacze umiarkowane R<0,125

SZCZEP WSOBNY (inbred) - grupa zwierząt reprezentujących jeden gatunek, charakteryzujących się jednorodnością genotypową i homozygotycznością.

„Szczep może być uważany za wsobny (inbred), jeśli był hodowany systemem kojarzenia brata z siostrą przez 20 następujących po sobie pokoleń (F 20). Szczep tworzy linię złożoną z pojedynczych rodzicielskich par hodowlanych, obejmującą przynajmniej 20 kolejnych pokoleń. Kojarzenia rodzic x potomek mogą zastąpić kojarzenia brat x siostra pod warunkiem, że będzie do nich użyty młodszy z dwojga rodziców.”

Bank szczepu wsobnego

Wszystkie zwierzęta muszą pochodzić od wspólnej pary rodzicielskiej złożonej z brata i siostry tworzącej linię hodowlaną szczepu. Odległość każdego osobnika nie może być dalsza niż 3 pokolenia wstecz. W banku są: dziadkowie (1para), rodzice (kilka), wnuki, prawnuki

Reprodukcja wsobnych szczepów (myszy, szczury)

Stado reprodukcyjne- dla celów doświadczalnych zwierzęta ze wsobnego szczepu namnaża się w stadzie reprodukcyjnym metodą „świateł ulicznych”

Schemat kojarzenia wg świateł ulicznych

„białe światło”- 1 para- do hodowli

„czerwone światło”- 200 sztuk- do doświadczeń

Przy namnażaniu zwierząt przeznaczonych do doświadczeń stosuje się zasady:

1. Nie można kojarzyć ze sobą zwierząt pochodzących z różnych świateł

2. Nie można przeznaczyć do dalszej hodowli zwierząt pochodzących z „czerwonego światła”

3. Samce i samice mogą być ze sobą kojarzone poligamicznie

4. Samce i samice kojarzone ze sobą nie muszą być bratem i siostrą (większe wzajemne zainteresowanie)

Mieszańce- uzyskane ze skrzyżowania 2 szczepów wsobnych (symbol szczepu × symbol szczepu )F₁

Populacje mozaikowe- złożone ze zwierząt kilku szczepów wsobnych i ich dwukierunkowych mieszańców w tym samym wieku (osobniki pochodzące ze szczepów wsobnych, jak i ich mieszańce w określonej proporcji)

Podszczepy- grupy zwierząt wyodrębnione ze szczepu wsobnego mogące się różnić genetycznie w wyniku działania czynników przypadkowych lub zamierzonych

Szczepy kongeniczne- różnią się krótkim odcinkiem jednego chromosomu, otrzymywane na drodze szeregu krzyżówek genetycznych z równoczesną selekcją (szczepy kongeniczne C_R)

Szczepy koizogeniczne- dwie linie szczepu wsobnego różniące się jednym zmutowanym genem

Szczepy wsobne rekombinacyjne (RIS)- zbiór szczepów wyhodowanych z losowo skojarzonych par zwierząt wybranych z 2 pokolenia mieszańców z krzyżówki

Szczepy kongeniczne rekombinacyjne (RCS)- wyhodowane jako modele do badania uwarunkowanych genetycznie cech ilościowych kontrolowanych przez kilka współdziałających

STADO NIEKREWNIACZE (outbred stocks) - populacje złożone z osobników o różnych genotypach;

stado każdego gatunku ssaków laboratoryjnych hodowane co najmniej przez 4 pokolenia w zamkniętej populacji z maksymalnym unikaniem kojarzeń krewniaczych.

Rejestracja i symbol*) możliwe tylko wtedy, kiedy system kojarzeń gwarantuje utrzymanie zmienności biologicznej stada przez szereg lat na takim samym poziomie.

Za stado uważać można:

• uprzednio wsobny szczep po 4 pokoleniach hodowli systemem kojarzeń z unikaniem pokrewieństwa

• mieszańce F1 dwóch różnych szczepów wsobnych

• „syntetyczne”, heterozygotyczne populacje pochodzące z mieszańców F1, względnie segregujące mieszańce F2, pod warunkiem, że będą stale odtwarzane z wyjściowych szczepów wsobnych.

• niedopuszczalne jest prowadzenie jakiejkolwiek kierunkowej selekcji

Zwierzęta transgeniczne

Monitorowanie genetyczne na podstawie markerów cech jakościowych:

• Markery immunologiczne- najczęściej stosowane są antygeny zgodności tkankowej, kodowane przez geny głównego kompleksu zgodności tkankowej MHC oraz antygeny różnicowania limfocytów

• Markery biochemiczne- izoenzymy i białka nieenzymatyczne kodowane przez polimorficzne strukturalne geny

• Markery cytogenetyczne

• Markery morfologiczne- geny umaszczenia

• Markery mikrosatelitarne- w kontroli genetycznej zwierząt szczepowych

Monitorowanie genetyczne na podstawie cech ilościowych:

Wskaźniki morfotyczne i reprodukcyjne:

• Czas od skojarzeń do wydania pierwszego miotu

• Odstępy czasowe między kolejnymi miotami

• Liczba urodzonych młodych

• Liczba odchowanych młodych

• Wskaźniki osteometryczne: pomiary żuchwy, czaszki, kości udowej

---