ZESTAW 12

1. Biosynteza glikogenu - przebieg, regulacja.

2. Izolowanie białek - metody, kryteria czystości.

3. Na⁺/K⁺ ATP-aza - budowa, rola.

Ad 1. Glukoza jest fosforylowana do glukozo-6-fosforanu w reakcji, która jest również pierwszą reakcją glikolizy z glukozy. Katalizuje ją odpowiednio: heksokinaza w mięśniu i glukokinaza w wątrobie. Glukozo-6-fosforan jest zamieniany w glukozo-1-fosforan (G-1-P) w reakcji katalizowanej przez fosfoglukomutazę. Sam enzym jest fosforyzowany w przebiegu reakcji, a grupa fosforanowa bierze udział w reakcji odwracalnej, w której związkiem pośrednim jest glukozo-1,6-bisfosforan. Następnie G-1-P reaguje z urydynotrifosforanem (UTP) i tworzy urydynodifosfoglukozę(UDPGlc) reakcję katalizuje pirofosforylaza UDP-glukozy. Uwolniony podczas tej reakcji PPi pochodzi z dwóch skrajnych reszt fosforanowych UTP.Reakcja ta jest łatwo odwracalna, jednak In vivo PPi szybko ulega hydrolizie do ortofosforanu pod wpływem obecnej w tkankach nieorganicznej pirofosfatazy. Praktycznie nieodwracalna hydroliza PPi jest czynnikiem napędzającym syntezę UDP-glukozy.Rozbudowa glikogenu polega na dołączeniu nowych reszt glukozylowych do jego nieredukujących reszt końcowych. Zaktywowane jednostki glukozylowe są przenoszone z UDP-glukozy na grupy hydroksylowe przy C-4 końcowych reszt glikogenu, tworząc wiązania a-1,4-glikozydowe. Uwalniany jest UDP. Reakcję katalizuje syntaza glikogenowa.

UDP-glukoza + glikogen (n-reszt) UDP + glikogen (n+1 reszt)

Syntaza glikogenowa dołącza reszty glukozylowe wyłącznie do łańcucha polisacharydowego zawierającego już co najmniej 4 reszty cukrowe- wymaga więc inicjatora(primer-czyt.prajmer ). Funkcje te pełni glikogenina-białko zawierające resztę oligosacharydu złożonego z jednostek Glc połączonych wiązaniami a-1,4-glikozydowymi.Przeprowadza ona autokatalizę, w której przyłącza 8 jedn. Glc. Donorem reszt Glc jest UDP-Glc. W tym momencie włącza się do działania synteza glikogenowa, która jest ściśle związana z glikogeniną. Gdy łańcuch zostanie przedłużony do co najmniej 11 reszt glukozowych, wówczas enzym rozgałęziający(amylo[14][16]-transglukozydaza) przenosi część łańcucha 14 (długości co najmniej 6 reszt glukozowych, zwykle 7) na sąsiedni łańcuch tworząc wiązanie 16 i ustanawiając w ten sposób punkt rozgałęzienia w cząsteczce.Przenoszony odcinek musi zawierać nieredukujący koniec i pochodzić z łańcucha złożonego z co najmniej 11 reszt, a nowo wytwarzane miejsce rozgałęzienia musi być oddalone o co najmniej 4 reszty od już istniejącego punktu rozgałęzienia. Rozgałęzienia wzrastają poprzez dalsze dodawanie jednostek 14 glukozylowych i dalsze rozgałęzienia. Wraz ze zwiększeniem liczby nieredukujących reszt końcowych zwiększa się w cząsteczce całkowita liczba miejsc zdolnych do reagowania, przyspieszając zarówno glikogenogenezę, jaki i glikogenolizę.Powstanie rozgałęzień zaś powoduje zwiększenie rozpuszczalności glikogenu. Regulacja: Główne enzymy kontrolujące metabolizm glikogenu to fosforylaza glikogenowa i syntaza glikogenowa. Zahamowanie glikogenolizy wzmaga efektywna glikogenogenezę. Syntaza glikogenowa występuje w 2 postaciach: ufosforylowanej(syntaza b- forma nieaktywna) i nieufosforylowanej.(syntaza a- forma aktywna).Pod wpływem działania kinaz m.in. kinazy-3, k-4, k-5 syntazy glikogenowej ,kinaz białek zależnych od Ca²⁺/kalmoduliny(jedna z nich to kinaza fosforylazowa, która aktywowana jest także przez kinazę A białek -PKA”włączaną” przez cAMP ) dochodzi do inaktywacji syntazy, czyli zmniejszenia szybkości syntezy. G-6-P jest allosterycznym aktywatorem syntazy b pozwalającym na synteze glikogenu pod wpływem ufosforylowanego enzymu.(Harper-str.223 wyd.III) Insulina pobudza wytwarzanie glikogenu w mięśniu - sprzyja defosforylacji syntazy b, która zachodzi zwykle pod wpływem aktywacji fosfatazy-1-białek(PP1). Pod jej działaniem także zostaje unieczynniona fosfataza a i przekształcona do formy b, czyli zmniejszona zostaje szybkość rozkładu glikogenu . Syntezę glikogenu wzmaga także wysokie stężenie glukozy we krwi, a hamuje wysokie stężenie glikogenu. Adrenalina(gł. w mięśniach) i glukagon(gł. w wątrobie) poprzez kaskadę cAMP powodują nasilenie rozkładu i jednocześnie zmniejszają syntezę glikogenu.

Ad 2. Trzema podstawowymi metodami stosowanymi w analizie i oczyszczaniu białek są: elektroforeza, chromatografia, ultrawirowanie. Celem oczyszczania białka jest oddzielenie jednego określonego białka od innych zanieczyszczających białek zawartych w materiale wyjściowym. Pozwala nam to następnie na zbadanie struktury i właściwości oczyszczonego białka. Przed przystapieniem do oczyszczania należy dokonać wyboru źródła materiału wyjściowego tak, aby zawartość danego białka była jak najwyższa. Dlatego stosujemy tkankę, w której potrzebnego nam białka jest najwięcej. Jeżeli białko występuje w małej ilości, po jego oczyszczeniu możemy stosować techniki rekombinacji DNA i w ten sposób uzyskać jego większą ilość. Kolejnym etapem jest uwolnienie białka do roztworu (niepotrzebne, gdy mamy do czynienia z białkiem w płynie ustrojowym). Wykonujemy to przez:

• homogenizację-rozbicie tkanek i komórek. Białka związane z błona wymagaja dodatkowego etapu rozbicia błony zwanego solubilizacją.

• Liza osmotyczna- umieszczenie komórek w roztworze hipotonicznympęcznienie i rozerwanie komórek

Homogenizat należy poddać ultrawirowaniu, aby otrzymać frakcje komórkowe w których wystepuje interesujące nas białko, a następnie frakcję ta poddać dalszemu oczyszczaniu.

Do rozdzielania stosuje się jedna(lub więcej) z następujących własności białek:rozpuszczalność, masa cząsteczkowa, ładunek.Przy oczyszczaniu białek należy zwrócic uwagę na możliwość zniszczenia(inaktywacji lub denaturacji) białka w wyniku działania czynników fizycznych lub biologicznych należy pamiętać o:

-zbuforowaniu roztworu-odpowiednie pH

-temperatura<25^oC najczęściej 4^oC-unikniecie termicznej denaturacji

-ograniczenie aktywności proteaz-mogą one zostać uwolnione podczas homogenizacji z różnych partii komórki w tym celu do komórki dodaje się inhibitory proteaz.

W czasie oczyszczania należy kontrolować skuteczność każdego etapu wykrywając obecność białka.Mozna tego dokonać poprzez kontrolę aktywności biologicznej białka.Obecność badanego białka należy kontrolować na każdym etapie oczyszczania W pierwszym etapie oczyszczania często stosuje się tzw.precypitację siarczanem amonu-wykorzystuje się tu fakt zmniejszania się rozpuszczalności białek w obecności dużego stężenia soli. Przy odpowiednio duzym stężeniu białka wypada z roztworu(ulega precypitacji)zjawisko wysolenia. Stężenie to jest różne w zależności od białka dlatego można tą metodę stosować tez do frakcjonowania białek.Precypitację stosuje się tez w celu zagęszczenia roztworu białka, ponieważ po wytraceniu można je rozpuścić w mniejszej objętości.

Dializa- jest metoda oczyszczania białek, pozwala na oddzielenie białek od cząsteczek o małej masie. Dializy dokonuje się za pomocą błony półprzepuszczalnej;pory w takiej błonie pozwalają na przejście cząsteczek o masie do 10kDa. Większe cząsteczki są zatrzymywane w woreczku dializacyjnym. Nie pozwala na frakcjonowanie białek, ale umożliwia usuniecie np.soli. podczas dializy należy kilkakrotnie zmieniać otaczający roztwór.

Ultrawirowanie frakcjonowane- jest metoda izolowania całych frakcji białek według organelli, w których występują. Obecnie ze wzgl. Na rozwój innych technik rzadziej stosowane; powinno być poprzedzone homogenizacja tkanki, frakcjonowanie prowadzi się przeważnie w temp.4^oC (w celu ograniczenia do minimum enzymatycznej degradacji składników komórkowych)Wirowanie im wyższą siła działamy, tym dłużej prowadzimy wirowanie.Należy pzmietać, że uzyskane podczas ultrawirowania frakcje nie są zazwyczaj wolne od innych organelli, dlatego należy je poddac dalszemu oczyszczaniu. Ultrawirowanie jest etapem wstępnym do oczyszczania białka. Pozwala na uzyskanie frakcji komórkowej, w której interesujące nas białko występuje. Wirowanie można przeprowadzic także metodą:

Wirowanie równowagowe w gradiencie gęstości(sacharozy)- często stosuje się je do dalszego oczyszczania organelli;wykorzystuje się różnice w ich gęstości a nie ciężkości. Surową frakcję organelli nakładamy na wierzch wypełniającego probówkę wirówkową gradientu gęstego roztworu(zwykle sacharozy).roztwór jest najbardziej stężony przy dnie.Organelle przemieszczają się w dół probówki do pozycji równowagowej. Po rozdziale należy sprawdzić czystość różnych preparatów organelli: morfologicznie, oznaczając aktywność enzymów markerowych(charakterystycznych dla danej frakcji)

TECHNIKI STOSOWANE DO ROZDZIAŁU

Metody chromatograficzne:

Filtracja żelowa - (saczenie molekularne) rozdział cząsteczek odbywa się na podstawie ich wielkości i kształtu.Małą objętość roztworu białek nakłada się na szczyt kolumny wypełnionej porowatymi ziarnami. Małe cząsteczki przechodza przez kolumnę szybciej większe wolniej i na tej podstawie nastepuje rozdział. Można tez ją wykorzystać do wyznaczenia masy cząsteczkowej.

Chromatografia jonowymienna - rozdział białek odbywa się na podstawie ich wypadkowego ładunku.Białko związane z kolumną można z niej wymyć przez przemycie roztworem NaCl o wzrastającym stężeniu i odpowiednim pH.

Chromatografia powinowadztwa- wykorzystuje specyficzne, niekowalencyjne, o dużym powinowadztwie wiazanie się białka z cząsteczką zwaną ligandem.Najpierw ligand jest wiązany z nosnikiem w kolumnie a nastepnie przez kolumnę przepuszcza się roztwór białka.Określone białko wiąże się z ligandem natomiast pozostałe przechodzą przez kolumnę.Białko związane w kolumnie uwalnia się przez przemycie kolumny roztworem zawierającym ligand w wolnej postaci lub zmieniając właściwości buforu.

Metody elektroforetyczne

PAGE - elektroforeza w żelu poliakryloamidowym, białka wprowadza się w porowaty żel i rozdziela w polu elektrycznym na podstawie ich wypadkowego ładunku ujemnego i masy cząsteczkowej. Małe cząsteczki o większym ładunku ujemnym migruja w żelu dalej niż czasteczki większe o mniejszym ładunku ujemnym.

SDS-PAGE -białka są denaturowane i otaczane ładunkiem ujemnym(na skutek wiązania z dodecylosiarczanem sodu SDS) ich rozdział jest oparty na różnicach w masie cząsteczkowej. Dodajemy:

1. b-merkaptoetanol-czynnik redukujący usuwa wszystkie wiazania disiarczkowe

2. silny detergent anionowy(SDS)-zrywa prawie wszystkie wiazania niekowalencyjne białka

Jedna cząsteczka SDS wiąże się ze szkieletem polipeptydowym denaturowanego białka dzięki hydrofilowemu łańcuchowi alkilowemu, przypada mniej więcej na 2 aa. Zdenaturowane białko wykazuje wypadkowy ładunek ujemny, który jest proporcjonalny do jego masy cząsteczkowej.Mieszanine białko/SDS nakłada się następnie na żel poliakryloamidowy jak w PAGE i przeprowadza elektroforezę.Metoda tą można rozróżnić białka różniące się od siebie o ok.2% masy(ok.100aa).Pozwala na oszacowanie stopnia czystości badanej próby, masy cząsteczkowej.

Ogniskowanie izoelektryczne- polega na elektroforetycznym rozdziale białek na podstawie względnej zawartości grup obdarzonych ładunkiem dodatnim i ujemnym. Kiedy białko znajdzie się w swoim punkcie izoelektrycznym, jego wypadkowy ładunek wynosi 0, co uniemozliwia dalszy ruch w polu elektrycznym.

Dwukierunkowa elektroforeza w żelu- połączenia ogniskowania izoelektrycznego i metody SDS-PAGE. Najpierw przeprowadza się ogniskowanie, a potem elektroforezę.Rozdział białek zarówno na podstawie ich masy, jak i ładunku.

KRYTERIA CZYSTOŚCI(HOMOGENNOŚCI) BIAŁEK

O jednorodności oczyszczonego preparatu białkowego wnioskuje się na podstawie kilku kryteriów:

Białko homogenie:

• Wędruje jako jedno pasmo lub prążek podczas elektroforezy dwukierunkowej(prowadzonej w różnych wartościach pH i na żelach o różnej gęstości)

• Podczas ogniskowania izoelektrycznego powinno wytrącać się w postaci jednego ostrego prążka w jednej tylko wartości pH-odpowiadajacej jego punktowi izoelektrycznemu

• W ultrawirówce analitycznej, w roztworach o różnej gęstości i lepkości powinno wędrować do dna probówki jako jeden prążek

• Podczas sączenia molekularnego(filtracji żelowej) powinno zachować się jak substancja o ściśle określonej masie cząsteczkowej

Kryteria homogenności są słuszne również dla białek oligomerycznych, ponieważ dysocjują na podjednostki . kontroluje się je w ściśle określonych warunkach oczyszczania.

Schemat uzyskiwania czystej frakcji białek z materiału biologicznego

1. Ekstrakcję białka z materiału biologicznego rozpoczynamy od homogenizacji tkanki w

zimnym ( ok. 4ºC ) buforze. Do buforu dodajemy inhibitory proteaz aby zapobiec proteolizie .

2. Wytrząsanie z H2O Ⴎ białka rozpuszczalne w H2O przechodzą do roztworu

3. Ekstrakcja białka do 1:1 etanol : chloroform

4. Wysalanie przy odpowiednim stężeniu soli ( wypada kilka białek )

5. Wsalanie

6. Wytrącanie w pJ ( kilka białek ). Pozbywamy się przy okazji znacznej ilości białek

balastowych.

7. Adsorbcja na żelu fosforanowo - wapniowym

8. Elucja z żelu

9. Wysalanie

10. Wsalanie

11. Oczyszczanie końcowe i analiza .

Na każdym etapie oczyszczania należy kontrolować obecność badanego białka

Ad 3. ATP-azą Na⁺/K⁺ inaczej pompą sodowo-potasową określa się ważny enzym, który bierze udział w aktywnym transporcie kationów potasowych i sodowych. Hydrolizuje on ATP tylko wtedy, gdy obok Mg²⁺ niezbędnego dla wszystkich ATPaz znajduja się dodatkowo jony Na⁺ i K⁺ . ATPaza jest integralna częścią pompy Na⁺-K⁺ a poziom jej aktywności jest ilościowo skorelowany z poziomem aktywności pompy.

Budowa: Pompa składa się z dwóch podjednostek a i b, tworzących w błonie tetrametr a₂b₂. Łańcuch a ma przynajmniej 8 helis transbłonowych. Duża część łańcucha a łącznie z miejscem aktywnym ATPazy umieszczona jest po cytozolowej stronie błony. Mała część łańcucha a eksponowana na zewnętrznej powierzchni błony komórkowej zawiera miejsce wiążące dla inhibitorów- steroidów kardiotonicznych. Łańcuch b o pojedynczej helisie transbłonowej wydaje się nieistotny zarówno dla aktywności ATPazy, jak i dla procesu transportu jonów Na⁺ i K⁺.

Miejsce wiązania inhibitora jednostki cukrów

steroidowego

Strona cytozolowa

Miejsce wiązania ATP

Schemat podjednostkowej struktury i topologicznej orientacji pompy Na⁺ - K⁺

Rola: Większość komórek zwierzęcych ma w porównaniu ze środowiskiem zewnętrznym duże stężenie jonów K⁺ i małe jonów Na⁺ . Gradienty jonowe wytwarzane są przez specyficzny system transportu, nazywany pompa sodowo-potasową. Gradient obu tych jonów kontroluje w komórkach zwierzęcych objętość komórki, warunkuje pobudzenie nerwów i mięśni oraz siłę napędową aktywnego transportu cukrów i aa.

Schemat przepływu jonów

ATPaza jest fosforylowana w obecności jonów Na i Mg. Miejscem fosforylacji jest boczny łańcuch specyficznej reszty asparaginianu. Powstały intermediat b-aspartylofosforylowy (E-P) jest nastepnie hydrolizowany w obecności K⁺. Do reakcji fosforylacji nie są potrzebne K+, do defosforylacji nie są potrzebne ani Na+, ani Mg2+ .Fosforylacja zależna od Na⁺ i defosforylacja zależna od K⁺ nie są jedynymi krytycznymi reakcjami enzymu. Pompa również przekształca się w co najmniej 2 różne konformery(E1 i E2). W hydrolizie ATP i równoczesnym transporcie K⁺ i Na⁺ przez pompę biorą udział przynajmniej 4 stany konformacyjne. W tym jednokierunkowym cyklu kosztem hydrolizy 1 ATP transportowane są wbrew gradientowi stężeń 3 Na⁺ i 2 K⁺.

Ważną cecha pompy jest to, że ATP nie ulega hydrolizie dopóki nie odbywa się transport jonów Na i K. zatem energia zmagazynowana w ATP nie ulega rozproszeniu, elektrony nie przepływają w łańcuchu oddechowym dopóki nie towarzyszy temu wytwarzanie ATP. Pompa w obecności bardzo stromych gradientów jonowych może działać odwrotnie- powodować syntezę ATP, np. gdy erytrocyty są inkubowane w środowisku zawierającym znacznie większe niż zwykle stężenie Na⁺, a dużo mniejsze K⁺.

---