1. Najważniejsze fakty z historii rozwoju genetyki i biologii molekularnej, definicja inżynierii genetycznej, omówienie znaczenia badań z tego zakresu. (Nie pyta)

• 1866 G. Mendel ogłoszenie podstawowych praw genetyki

• 1944 Oswald Avery i Maclyn McCarty udowadniają, że nie białka, lecz DNA jest nośnikiem informacji genetycznej.

• 1956 A. Kornberg polimeraza DNA (enzym Kornberga)

• 1958 F. Crick Centralny Dogmat Biologiczny; przepływ informacji genetycznej DNA-RNA - białko

• W marcu 1953, mając 25 lat, wraz z Francisem Crickiem i Rosalind Franklin, opracował w Laboratorium Cavendisha model budowy przestrzennej podwójnej helisy DNA, za co, wraz z Crickiem i Maurice'em Wilkinsem, otrzymał Nagrodę Nobla w dziedzinie fizjologii za rok 1962.

• 1973 narodziny inżynierii genetycznej. Stanley Cohen i Herbert Boyer jako pierwsi przenieśli gen pochodzący od ropuchy do bakterii.

• 1983 opracowanie reakcji PCR przez Karego B Mullisa.

• 5 lipca 1996 owca domowa, pierwsze zwierzę sklonowane z komórek somatycznych dorosłego osobnika metodą transferu jąder komórkowych.

• 1990 – 2003 projekt HUGO. Zsekwencjonowanie ludzkiego genomu.

Inżynieria genetyczna, technologia genu, technologia rekombinacji DNA, klonowanie DNA lub manipulacja genetyczna to tworzenie nowych kombinacji materiału dziedzicznego poprzez włączanie cząsteczek kwasu nukleinowego wytworzonego jakimkolwiek sposobem poza komórką do wirusa, plazmidu lub innego systemu wektorowego tak aby umożliwić ich wprowadzenie do organizmu – gospodarza w którym naturalnie nie występują, lecz w którym zdolne są do ciągłego rozmnażania.

Zmienianie genetycznego czy dziedzicznego materiału jakiegokolwiek organizmu w celu wyeliminowania niepożądanych cech lub wytworzenia nowych korzystnych własności.

IG jest wykorzystywana do:

• Zwiększenia produkcji żywności pochodzenia roślinnego i zwierzęcego

• Ulepszania i unowocześniania lecznictwa

• Produkcji enzymów, szczepionek i innych lekarstw

• Wspomagania utylizacji odpadów przemysłowych i zanieczyszczeń środowiska.

2. Pojęcia genetyczne.

Ekspresja genu – wytwarzanie produktu genu, czyli polipeptydu, w wyniku transkrypcji i translacji lub RNA w wyniku jedynie transkrypcji (rRNA, tRNA)
Indukcja genu lub operonu – proces uruchamiający ekspresję pojedynczego genu lub szeregu genów wchodzących w skład operonu

Represja – proces wyłączenia transkrypcji genów lub operonów w zjawisku regulacji aktywności genów

Operon – zespół genów kodujących białka, zwykle biorą udział w jednym ciągu metabolicznym

Promotor – odcinek DNA o określonej sekwencji rozpoznawany przez polimerazę RNA zależną od DNA

Gen regulatorowy – gen kodujący białko regulatorowe

Represor – białko kodowane przez gen regulatorowy rozpoznające sekwencję nukleotydową operatora

Mutacja konstytutywna – mutacja dotycząca mechanizmu regulacji działania genu powodująca, że gen podlega ciągłej ekspresji

Operator – odcinek DNA o określonej sekwencji nukleotydowej mający powinowactwo do represora

3. Mechanizmy regulacji ekspresji genów u prokariontów (regulacja negatywna, operony laktozowy i tryptofanowy u E.coli regulacja pozytywna operon arabinozowy)

Regulacja negatywna – występuje takie białko – rep resor – które łączy się z operatorem na nici DNA uniemożliwiając prowadzenie transkrypcji. Pojawienie się induktora łączącego się z represorem uwalnia proces transkrypcji.
Regulacja pozytywna – przyłączenie się efektora do pewnej sekwencji DNA (zazwyczaj w pobliżu promotora) która powoduje zwiększenie ekspresji genu
Operon laktozowy to operon zawierający trzy geny struktury:

- lacZ, kodujący enzym beta-galaktozydazę hydrolizującą laktozę do glukozy i galaktozy;

- lacY, kodujący permeazę laktozową, odpowiedzialną za transport laktozy do komórki;

- lacA, kodujący transacetylazę beta-galaktozydazową zaangażowaną w transport laktozy wewnątrz komórki.

Istotą mechanizmu regulacyjnego operonu laktozowego jest zdolność łączenia się represora z odcinkiem operatorowym, warunkowana przez drobnocząsteczkowe związki chemiczne. W przypadku połączenia się allo-laktozy do białka regulatorowego (represora) nastąpi obniżenie zdolności represora do wiązania się z operatorem. Zatem represor nie będzie w stanie blokować sekwencji operatora i w rezultacie umożliwia przyłączenie się polimerazy RNA do promotora (transkrypcja genów).Przy braku laktozy represor uniemożliwia przyłączenie się polimerazy RNA i rozpoczęcie transkrypcji. Pojawienie się laktozy w środowisku zmienia strukturę cząsteczek represora, umożliwiając tym samym syntezę mRNA (oraz ekspresję genów kodujących enzymy rozkładające laktozę). Po wyczerpaniu substratu (laktozy), nie zmodyfikowane już cząsteczki represora znów łącza się z operatorem, przywracając wyjściową sytuacje.

Operon tryptofanowy - operon kodujący enzymy potrzebne do syntezy aminokwasu - tryptofanu. Składa się z operatora, promotora i pięciu genów struktury. Represor operonu tryptofanowego, kodowany przez gen trpR, jest produkowany w sposób ciągły. Gdy w komórce brak jest tryptofanu represor pozostaje nieaktywny i nie blokuje on transkrypcji genów struktury. Gdy stężenie tryptofanu w komórce wzrasta, jego cząsteczki łączą się z nieaktywnym represorem. Następuje wówczas zmiana konformacji represora, dzięki czemu staje się on aktywny (tryptofan jest tu korepresorem). Aktywny represor blokuje operator, co uniemożliwia związanie się polimerazy RNA z DNA i prowadzenie transkrypcji genów operonu tryptofanowego (jest to więc system reprymowalny). Stan taki utrzymuje się tak długo, aż stężenie tryptofanu w komórce się zmniejszy. Tryptofan jest stale potrzebny w komórce, zatem kiedy go zabraknie, nieaktywny represor nie wiąże się z operatorem, dzięki czemu geny operonu tryptofanowego ulegają transkrypcji.

4. Kataboliczna represja glukozowa

Gdy bakteria ma dostęp zarówno do glukozy jak i laktozy to korzystniejsze energetycznie dla niej jest wykorzystywanie glukozy, ponieważ glukoza może być natychmiast zużyta w metabolizmie, a laktoza musi zostać najpierw rozłożona w skomplikowanych reakcjach chemicznych. Dlatego też nie należy się dziwić, że powstał mechanizm tzw. represja kataboliczna, który umożliwia bakterii zużywanie na początku glukozy nawet gdy jest laktoza. Mechanizm represji katabolicznej opiera się na fakcie, że polimeraza RNA łączy się z promotorem w operonie lac dużo lepiej w obecności specyficznego białka CAP (catabolite gene activator protein, CRP – cyclic AMP receptor protein /inna nazwa/), które musi być związane ze specyficznym miejscem DNA położonym w pobliżu tzw.CBS (CAP binding site). Białko CAP wiąże się z tym miejscem jeśli do tego białka przyłączą się cząsteczki cAMP, co zachodzi przy braku glukozy. cAMP powstaje za pośrednictwem enzymu: cyklazy adenylowej, która jest aktywna tylko wtedy gdy jest ufosforlowana. Gdy w podłożu znajduje się glukoza, jest ona fosforyzowana zamiast cyklazy przez co nie powstaje cAMP. Białko CAP niezwiązane z cAMP zmienia kształt, nie wiąże się z CBS i synteza enzymów szlaku laktozowego zostaje spowolniona.

5. Izolowanie i oczyszczanie DNA z drobnoustrojów (genomowy DNA, plazmidowy DNA – ultra wirowanie w CsCL – EtBr, elektroforeza)

DNA genomowy występuje u bakterii w postaci pojedynczej, kolistej dwuniciowej cząsteczki DNA o skomplikowanej konformacji.

DNA plazmidowy – dwuniciowa cząsteczka DNA, która może replikować się niezależnie od DNA genomowego. Występuje w 3 konformacjach – liniowej, kolistej zrelaksowanej oraz kolistej superskręconej. Wielkość plazmidowego DNA nie przekracza 8% genomowego DNA. DNA plazmidowe można wyizolować w całości z komórki natomiast nie jest możliwe to w przypadku DNA genomowego gdyż cząsteczka ta jest zbyt wielka i ulega uszkodzeniu podczas izolacji.

Etapy izolacji do preparatyki bakteryjnego DNA

1. Hodowla organizmu – otrzymanie odpowiedniej ilości biomasy

2. Dezintegracja komórki (zniszczenia struktury osłon zewnętrznych)

3. Oczyszczanie wyizolowanego DNA (oddzielenie od białek)

4. Zatężanie DNA

Ad.1) Hodowle prowadzimy poprzez zaszczepienie podłoża kilkoma ml hodowli bakteryjnej (hodowla wgłębna) . Stosuje się podłoża:

1. Zdefiniowane w których zawartość wszystkich składników jest dokładnie ustalona, jest to podłoże dostosowane do organizmów prototroficznych (zdolnych do syntezy wszystkich potrzebnych składników z podstawowych związków). Stosowane jest gdy chcemy określić wpływ dodatków do podłoża na wzrost, morfologię i aktywność mikroorganizmów

2. Podłoże niezdefiniowane np. LB zawierające

-trypton – źródło aminokwasów i peptydów

- ekstrakt drożdżowy – suszony preparat komórek drożdżowych

- źródło C w postaci polisacharydów

- NaCl

Po całonocnej hodowli, do osiągnięcia fazy S, osadza się komórki bakteryjne przez wirowanie

Ad.2) Metody dezintegracji ściany komórkowej

1. mechaniczne – bezpośrednie rozerwanie ścian komórkowych poprzez mielenie, rozcieranie, homogenizację – niewskazane w przypadku preparatyki chromosomalnego DNA – następują uszkodzenia

2. fizyczne – szok osmotyczny, gwałtowna dekompresja, wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie. Jeżeli zależy nam na preparatyce natywnego DNA metody te nie są zalecane

3. chemiczne – niszczenie ścian komórkowych przy użyciu detergentów, rozpuszczalników, kwasów; stosowany związek nie może niekorzystnie wpływać na produkt który chcemy uzyskać

4. biochemiczne – rozkład ściany komórkowej na drodze lizy enzymatycznej np. przy wykorzystaniu lizozymu, który rozkłada wiązanie β – 1,4 – glikozydowe powodując dezintegrację ściany komórkowej. Dodatkowo stosuje się dodatek EDTA chelatujący jony Mg²⁺ występujące w ścianie komórkowej, co wspomaga działanie lizozymu

Preparatyka i oczyszczanie:

Najczęściej stosowaną metodą do dezintegracji komórek w celu izolacji plazmidowego DNA jest liza alkaliczna. Biomasę komórek zawieszamy w buforze zapewniającym stałe pH, ochronę przed szokiem osmotycznym oraz związek kompleksujący jony dwuwartościowe( Mg – aby ‘unieszkodliwić’ nukleazy, Ca – do osłabienia ścian komórkowych). W kolejnym etapie komórki zawieszane są w buforze zawierającym lizozym, a następnie dodaje się alkaliczny roztwór SDS (dodecylosiarczan sodu)(w przypadku komórek G- można pominąć etap dodawania lizozymu gdyż maja one znacznie cieńszą ścianę).

SDS powoduje lizę komórek poprzez zniszczenie ścian oraz błon komórkowych co skutkuje uwolnieniem zawartości komórek poza nią, a także denaturuje genomowy DNA, białko, oraz częściowo plazmidowy DNA. Dodatek stężonego octanu potasu spowodował szybką zmianę pH z zasadowej na kwaśną, co skutkuje widocznym wytrąceniem białek oraz genomowego DNA oraz zapewnia przejście do roztworu plazmidowego DNA. Supernatant uzyskany po odwirowaniu takiej mieszaniny zawiera izolowany plazmid, RNA oraz resztki niewytrąconego białka. Aby pozbyć się resztek białka z lizatu ekstrahuje się ja za pomocą mieszaniny fenol/chloroform. Mieszanina ta nie rozpuszcza się w wodzie i tworzy oddzielną fazę organiczną. Na granicy faz zbiera się białko natomiast w warstwie wodnej znajdują się kwasy nukleinowe. W celu odbiałczania można stosować dodatek specyficznych enzymów proteolitycznych o dużej czystości ( nie mogą zwierać nukleaz) np. proteaza E, proteinaza K. Enzymy te specyficznie odcinają białka od kompleksów z kwasami nukleinowymi. Następnie dodatek alkoholu izoamylowego wytrąca kwasy nukleinowe oraz usuwa resztki fenolu i chloroformu z mieszaniny. Osad kwasów rozpuszczamy w octanie sodu, a następnie dodatek chlorku sodu i zimnego 96% etanolu wzmagają wytrącanie się kwasów nukleinowych podczas inkubacji. Ostatnim etapem w preparatyce plazmidowego DNA jest usuniecie RNA polegający na dodatku RNazy Po hydrolizie kwasu rybonukleinowego mieszaninę należy po raz kolejny odbiałczać, gdyż użyty enzym był białkiem. W tym celu ekstrahuje się próbkę w identyczny sposób jak poprzednio mieszaniną fenol/chloroform.

Ad.4) W celu zagęszczenia stosuje się wytrącenie 96% etanolem. Do fazy wodnej dodaje się etanol, wytrącony osad odwirowuje się , usuwa supernatant a osad suszy w wirowce próżniowej. Następnie wysuszony osad zwiesza się w buforze do przechowywania kwasów nukleinowych.

Wirowanie w gradiencie gęstości z użyciem soli cezu - CsCl do zatężania DNA. Bromek etydyny dodany do próbki interkaluje w strukturę dwuniciowych kwasów nukleinowych, co prowadzi do zmniejszenia jego gęstości. Jednak ilość interkalujacego EtBr do helisy jest zależna od formy plazmidu. Forma superskręcona, kowalencyjnie zamknięta DNA (cccDNA) włącza znacznie mniej bromku etydyny niż formy zrelaksowanego (OC) i liniowego DNA, więc ma większa gęstośc niż forma liniowa i zrelaksowana. Stosowany w tej metodzie chlorek cezu (CsCl) jest wysokocząsteczkową solą, której stężony (8 M) roztwór ma gęstość podobną do gęstości DNA (1,7 g/cm3). W wyniku wirowania w wysokich obrotach (45 tys. rpm, 48 godz) wytwarza się gradient CsCl (Rys. 1a), zaś DNA, w zależności od formy, przesuwa się w miejsce, w którym jego gęstość równa jest gęstości rozpuszczalnika. Dzięki uzyskanej przez EtBr różnicy w gęstości między formą ccc a formami liniowymi i zrelaksowanymi powstają dwa prążki DNA: cccDNA lokuje się bliżej dna probówki, a liniowe DNA nad nim. Znajdujące się w surowym lizacie komórkowym RNA osiada na dnie komórki, a białka unoszą się w stronę korka. Należy pamiętać, że ultrawirowanie w gradiencie chlorku cezu (CsCl) z bromkiem etydyny pozwala na różnicowanie DNA ze względu na jego strukturę i gęstość pławną, a nie wielkość cząsteczki kwasu nukleinowego. Jeśli w tej metodzie zastosowany zostanie szczep posiadający kilka plazmidów, niezależnie od wielkości ich cząsteczek, wszystkie znajdą się w jednym paśmie DNA, a do ich rozdzielenia konieczne będzie zastosowanie innych metod, np. wirowania w gradiencie alkalicznej lub neutralnej sacharozy, czy też elektroforezy w żelu agarozowym.

Elektroforeza w żelu to standardowa metoda rozdziału cząsteczek obdarzonych ładunkiem różniących się wielkością takich jak: DNA RNA czy białka. W inżynierii genetycznej technika ta ma wiele zastosowań, m. in. w analizie wielkości fragmentów restrykcyjnych, oczyszczaniu pojedynczych fragmentów do klonowania czy też do sekwencjonowania lub badania produktów PCR. Rozdział DNA odbywa się względem wielkości cząsteczek DNA, im większa tym wolniej przeciska się przez sieć agarozy i wolniej wędruje w żelu.

6. Endonukleazy restrykcyjne (występowanie, rodzaje i zastosowanie)

Endonukleazy restrykcyjne są enzymami wytwarzanymi przez bakterie w celu ochrony przed inwazją obcego DNA (np. wirusowego). Enzymy te atakują DNA wirusa – jest ono fragmentowane. Bakterie do ochrony przed własnymi enzymami restrykcyjnymi metylują fragmenty DNA rozpoznawane przez restryktazy za pomocą specjalnych enzymów – metylaz, przez co ich DNA jest zabezpieczone przed fragmentacją.

Istnieją 3 różne sposoby rozcinania DNA (nie w temacie ale może się przydać)

1. Nierównomierne rozcięcie „na ukos” pozostawiające niesparowany koniec 5’ (tzn. na końcu 5’ pozostaje krótki jednoniciowy odcinek wysunięty przed koniec 3’ rejonu dwuniciowego). Pozostają wtedy końce kohezyjne (lepkie), które umożliwiają dwóm dowolnym fragmentom DNA, uzyskanym z użyciem tego samego enzymu restrykcyjnego, utworzenie komplementarnych par zasad. Końce takie mogą być następnie połączone kowalencyjnie przez ligazę (mówimy że nastąpiła ligacja). Nową cząsteczkę DNA, utworzoną przez połączenie fragmentów DNA nazywamy cząsteczką zrekombinowanego DNA.

2. Nierównomierne rozcięcie pozostawiające niesparowany koniec 3’.

3. Rozcięcie obu nici w tym samym miejscu z utworzeniem tępych końców rozciętego DNA. Cząsteczki o tępych końcach można łączyć za pomocą ligazy, ale reakcja ta przebiega trudniej niż w przypadku łączenia lepkich końców.

Są 3 klasy enzymów restrykcyjnych:

I klasa – enzymy zdolne do rozcinania i metyzacji DNA. Rozpoznają sekwencję i dokonują przecięcia w nieokreślonym miejscu w dużej odległości od niej (są mało specyficzne). Wymagają Mg²⁺, S-adenozylometioniny, ATP do działania. Są one mało przydatne.

II klasa – enzymy rozpoznają określoną sekwencję nukleotydową, przecinają obie nici DNA albo w obrębie tej rozpoznawalnej sekwencji albo w dokładnie określonym miejscu w pewnej odległości od sekwencji rozpoznawalnej. Do działania wymagają Mg²⁺.

III klasa – enzymy zdolne do rozcinania i metylacji DNA. Rozpoznają sekwencję i dokonuja przecięcia w nieokreślonym miejscu w bliskiej odległości od niej. Wymagają Mg²⁺ i ATP

Działanie endonukleaz restrykcyjnych przedstawia rysunek

EcoR1 5’–GAATTC- -3’  5’- -G^OH _PAATTC- -3’

3’—CTTAAG- - 5’ 3’- -CTTAA_p + _OHG- -5’

Izoschizomery (czyli enzym rozpoznający identyczne sekwencje nukleotydowe pochodzące z różnych mikroorganizmów).

Wszystkie enzymy restrykcyjne stawiają wysokie wymagania pod względem środowiska działania (buforu restrykcyjnego). Dla każdej grupy tych enzymów trzeba opracować specjalne roztwory buforowe zawierające jony Mg²⁺, o pH ok. 7 (czasami alkaliczne) i odpowiednim stężeniu soli (stężenie to jest regulowane przez dodatek KCl, CH₃COOK i innych). Jak ważne jest stężenie soli pokazuje przykład restryktazy EcoR1. W warunkach normalnych (bufor zawiera dużo soli) EcoR1 rozpoznaje sekwencje 6 nukleotydowe. Gdy działa on w buforze o niskiej zawartości soli to wykazuje aktywność z * (tzn. nie rozpoznaje 6 nukleotydowej sekwencji ale 4 nukleotydową, a więc znacznie częściej będzie przecinał łańcuch DNA).

EcoR1 5’-GAATTC- -3’ EcoR1* 5’-NAATTN- -3’

3’-CTTAAG- -5’ 3’-NTTAAN- -5’

Enzymy restrykcyjne znalazły zastosowanie w:

- identyfikacji mutacji i markerów polimorficznych

- sporządzaniu map fizycznych cząstek DNA

- wyodrębnianiu oraz klonowaniu fragmentów DNA.

7. Ligazy DNA z bakteriofaga T4 i E. coli

Ligaza DNA odpowiedzialna jest za kowalencyjne łączenie cząstek DNA. Enzym ten normalnie naprawia pęknięci w jednej nici dwuniciowego DNA, gdy na jej końcu 5’ znajduje się grupa fosforanowa. Ligazy są wykorzystywane w każdym żywym organizmie w procesie replikacji. Ligaza nie może łączyć lub zamykać w formę kolistą jednoniciowych fragmentów DNA. Wymaganie ligaz: na końcu 3’ musi znajdować się grupa OH a na 5’ grupa fosforanowa, łączone odcinki DNA muszą znajdować się w obrębie dwuniciowej helisy. Energia potrzebna do procesu ligacji pochodzi z ATP.Najczęściej używane ligazy to enzymy z bakterii E.coli oraz faga T4 (przy czym ligazy faga T4 wykorzystywane są częściej niż E.coli, ze względu na wyższą wydajność). Ligaza DNA z faga T4 naprawia pęknięcia w rdzeniu cukrowo-fosforanowym dwuniciowego DNA i może kowalencyjnie łączyć hybrydyzowane końce, co stanowi odwrócenie reakcji trawienia restrykcyjnego. Ligaza ta łączy fragmenty DNA mające tępe końce ze znacznie niższą wydajność niż lepkie końce. Aby ligaza łączyła tępe końce z większą wydajnością należy podwyższyć stężenie soli oraz dodać PEG (gikol polietylenowy).Ligaza z faga T4 potrafi tworzyc hybrydy DNA-RNA których nie potrafi ligaza z E. coli. Ligaza DNA z E.coli używa kofaktora NAD⁺ jako nietypowego źródła energii oraz i NH₄. NAD⁺ jest rozcinany do mononukleotydu nikotyno amidowego NMN i monofosforanu adenozyny AMP, po czym AMP jest kowalencyjnie przyłączony do końca 5’ fragmentu Okazaki przez wiązanie 5’-5’ pirofosforanowe.

Mechanizm działania ligaz:

Dzięki ATP (lub NAD⁺) tworzy się kompleks enzym-AMP, w którym AMP połączony jest z enzymem wiązaniem fosfoamidowym poprzez resztę aminową lizyny. Jednocześnie uwalniany jest pirofosforan. Zaktywowana reszta AMP jest następnie przenoszona z reszty lizyny na koniec 5’ łańcucha i powstaje kompleks adenylan-DNA. Kolejny etap to atak nukleofilowy grupy 3’OH na zaktywowany koniec 5’. Ten ciąg reakcji jest napędzany hydrolizą pirofosforanu, uwalnianego podczas tworzenia kompleksu enzym-adenylan.

8. Pozachromosomalne elementy genetyczne u drobnoustrojów (mitochondrialny DNA, plazmidy bakteryjne[rodzaje, cechy w nich kodowane, sposób działania antybiotyków i mechanizmy oporności])

Plazmidy – pozachromosomalne dwuniciowe cząsteczki DNA naturalnie występujące w komórkach wielu gatunków bakterii. Cechy zakodowane w plazmidzie nie są konieczne do rozwoju drobnoustroju w optymalnych warunkach.

Cechy fenotypowe zakodowane w plazmidach:

1. Oporność na działanie antybiotyków takich jak: ampicylina, kanamycyna, tetracyklina, streptomycyna, chloramfenikol, sulfonamidy.

2. Produkcja antybiotyków (gdy w środowisku jest konkurencja).

3. Degradacja związków organicznych (gdy nie ma skażenia środowiska, nie ma potrzeby).

4. Fermentacja cukrów.

5. Odporność na działanie metali ciężkich.

6. Produkcja enzymów restrykcyjnych i modyfikujących (ta cecha może i zazwyczaj jest zakodowana w chromosomie).

7. Produkcja kolicyn (substancje bakteriostatyczne wpływające na ograniczenie w środowisku konkurencji).

8. Produkcja enterotoksyn.

Ze względu na fenotyp, jaki plazmidy występujące u Enterobacteriaceae nadają komórkom gospodarza, wyróżnia się 3 grupy plazmidów:

A’) czynnik płciowy F – komórki bakteryjne z plazmidem F są dawcami genów plazmidowych

B’) czynniki R nadają komórkom odporność na leki i sole metali ciężkich a także na jeden lub kilka antybiotyków. Ze względu na łatwość rozprzestrzeniania się w populacji mają one duże znaczenie epidemiologiczne.

C’) czynniki kolicynogenne Col – warunkują syntezę substancji antybiotycznych, kolicyn.

Plazmidy mogą być:

- Pod ścisłą kontrolą – replikacja tych plazmidów zachodzi równocześnie z replikacją chromosomalnego DNA. Są one zazwyczaj dużych rozmiarów (ich masa jest większa niż 45 kbp), występują w niewielkiej liczbie (1-5).. Trudno je wypreparować ze względu na duże rozmiary i małą ilość kopii w cząsteczce.

- Pod luźną kontrolą – ich replikacja przebiega niezależnie od chromosomalnego DNA (duża liczba kopii nawet do 500, masa ich <10 kpb).

Istnieją też plazmidy kryptyczne, które nie wyróżniają się żadną łatwo rozpoznawalną cechą fenotypową. Możemy stwierdzić ich istnienie, bo pojawia się pasek na obrazie elektroforetycznym, ale obecność tych plazmidów nie demonstruje się charakterystyczną cechą.Ze względu na zdolność przenoszenia się do innych bakterii plazmidy możemy podzielić na: infekcyjne i nieinfekcyjne. Plazmidy infekcyjne przenoszą własny materiał genetyczny, mobilizują także chromosom gospodarza lub inne plazmidy pozbawione własności płciowych. Plazmidy nieinfekcyjne i niektóre czynniki R do swojego przenoszenia wymagają obecności innego plazmidu o właściwościach płciowych. Plazmidy koniugacyjne – wyposażone są w system przenoszenia informacji tra (transfer factor) między komórkami na drodze koniugacji.

Antybiotyk	Sposób działania	Mechanizm odporności
Ampicylina Ap^+, amp^+	Pochodna penicyliny zabija rosnące komórki zakłócając końcowy etap syntezy ściany komórkowej, hamuje działanie licznych enzymów błony cytoplazmatycznej.	Gen odporności bla koduje peryplazmatyczny enzym β-laktamazę, który przecina pierścień β-laktamowy w antybiotyku. Enzym ten jest wydzielany poza komórkę do podłoża hodowlanego w wyniku czego tworzy się strefa wokół rosnącej kolonii.
Tetracyklina tc^+, tet^+	Związek bakteriostatyczny, który hamuje namnażanie drobnoustrojów. Uniemożliwia on syntezę białek łącząc się z podjednostką 30S rybosomów.	Gen odporności tet koduje białko modyfikujące bakteryjną membranę co uniemożliwia transport antybiotyku do komórki. Białko spełnia funkcje blokujące – antybiotyk nie wchodzi do środka (a tylko tam działa).

9. Plazmidowe systemy wektorowe, opis konstrukcji pBR322

Wektor – cząsteczka DNA służąca do przenoszenia fragmentów DNA pomiędzy organizmami. Jednym z pierwszych opracowanych wektorów plazmidowych został nazwany pBR322. Zarówno on jak i jego pochodne mają dwa geny odporności na antybiotyki: ampicylinę i tetracyklinę. Jednym z pierwszych opracowanych wektorów był pBR322. Posiada on geny odporności na antybiotyki: tetracykilnę i ampicylinę. Jest on dobrym wektorem – małe rozmiary, dwa markery selekcyjne, wiele pojedynczych miejsc restrykcyjnych.

Opis konstrukcji wektora pBR322

Bardzo duży plazmid z 5 genami odporności poddano trawieniu różnymi enzymami restrykcyjnymi i transformowano nimi komórki E. coli. Wysiewając na podłoże z ampicyliną sprawdzano posiadane odporności. Izolowano plazmidy ze szczepów odpornych i przez elektroforezę wybrano najkrótszy plazmid. W ten sposób otrzymano nadal duży plazmid – 12 kbp. Fragment ten skojarzono ze znanym plazmidem pMB1 występującym w komórce w dużej liczbie kopii lecz nie posiadał odporności. Z tego połączenia powstał plazmid pMB3. Dokonano selekcji na podłożu z ampicyliną lecz najmniejszy plazmid był nadal zbyt duży. Dlatego też poddano go częściowemu trawieniu enzymem EcoRI*. Powstały fragmenty o wielkości 2700 bp, które utraciły odporność na antybiotyk (pMB8), więc znowu skojarzono je z innym plazmidem (pSC101 – zawiera gen odporności na tetracyklinę). Transformacja i wysiew na podłoże z tetracyklina a następnie izolacja najmniejszego plazmidu pozwoliły na uzyskanie plazmidu pMB9 o wielkości 5,3kbp z odpornością na tetracyklinę. Postanowiono ulepszyć plazmid poprzez skojarzenie go z plazmidem ColEI (wyizolowanego z E. coli zawierającego odporność na kolicynę do którego wstawiono gen odporności na ampicylinę). Plazmid ColEI jest dość duży jednak występuje w wielu kopiach. Celem było uzyskanie plazmidu z dwoma markerami selekcyjnymi. Po połączeniu plazmidów uzyskano zbyt duży plazmid do efektywnej transformacji, dlatego użyto enzymu EcoRI w celu wycięcia niektórych fragmentów. Tak uzyskano plazmid pBR312 z dwoma opornościami – tetracyklina i ampicylina. Po raz kolejny uzyto EcoRI* (inne warunki) i otrzymano mniejszy pBR313 po czym po raz kolejny za pomocą enzymów restrykcyjnych usunięto zbędne fragmenty uważając by nie uszkodzić genów odporności i uzyskano pBR322 o długości 4363 bp.

10. Omówienie budowy i charakterystyka właściwości dobrego plazmidowego wektora

Cechy dobrego plazmidu:

• Wektor plazmidowy powinien replikować się niezależnie od chromosomalnego DNA (autonomicznie)

• Mały rozmiar – im mniejszy rozmiar tym więcej kopii, im więcej kopii, tym więcej matryc dla transkrypcji mRNA. Łatwiej wprowadzić małe cząstki. Wydajność transformacji jest odwrotnie proporcjonalna do wielkości cząsteczki wprowadzanej. Małe wektory maja większą pojemnośc klonujacą.

• Wektor powinien zawierać markery pozwalające na wyróżnienie komórek, w których się znajduje.

• Cząsteczka DNA stanowiąca wektor powinna mieć pojedyncze miejsce rozpoznawane i cięte przez przynajmniej jeden z enzymów restrykcyjnych.

• Miejsce przecinania cząsteczki DNA wektora przez enzym restrykcyjny jest tym, w które wprowadzamy fragmenty obcego DNA. Nie powinno się ono znajdować w obrębie genu markerowego służącego do wyróżniania i selekcji komórek zawierających wektor, ani też w takim rejonie cząsteczki, którego uszkodzenie powodowałoby zaburzenie zdolności jej replikacji. Korzystne jest natomiast, jeżeli miejsce cięcia znajduje się w obrębie jednego z genów wektora, odpowiedzialnego za drugą, określoną, łatwo wyróżnialną cechę. Wprowadzenie fragmentu DNA w obręb genu powoduje jego uszkodzenie, co daje nam możliwość rozróżnienia wektorów zrekombinowanych od niezrekombinowanych.

• Pożądane jest, by wektor posiadał jeden lub kilka silnych promotorów, tak by wstawiając w ich sąsiedztwo fragment obcego DNA można było liczyć na wydajną ekspresję wprowadzonych genów.

• Dla szeregu eksperymentów pożądane jest, by wektor występował w komórce w dużej liczbie kopii lub by jego replikacja mogła zachodzić przy zahamowanej replikacji chromosomalnego DNA gospodarza.

• Wektory nie powinny zawierać genów, których rozpowszechnienie mogło by stanowić zagrożenie dla człowieka lub innych organizmów. Do niektórych doświadczeń wskazane jest stosowanie wektorów wyposażonych w specjalne właściwości, uniemożliwiające przeżycie wektora i klonowanego w nim fragmentu obcego DNA poza ściśle określonym gospodarzem.

• Powinien posiadać sygnały regulujące transkrypcje i translację.

11. Klonowanie z wykorzystaniem inercyjnej inaktywacji (defosforylacja DNA przy użyciu fosfataz CIP i BAP, jej zastosowanie).

Polega na uszkodzeniu jednego z dwóch genów oporności przez wprowadzenie wstawki, co umożliwia łatwą selekcję komórek, które przyjęły plazmid ze wstawką. Przykładem tej metody jest wektor pBR322 z dwoma genami oporności na antybiotyki. Zastosowane zostało ciecie przy pomocy Bam HI który rozpoznaje sekwencje w obrębie oporności na tetracyklinę. Cięcie linearyzuje cząsteczkę i można wprowadzić obcy fragment DNA. W tym przypadku obcy DNA jest DNA genomowym (korzystnie jest użyć ograniczone trawienie rozpoznające 4 nukleotydową sekwencję) Fragmenty łączone są za pomocą ligazy. Kolejny etap to transformacja komórek otrzymana mieszaniną plazmidów (możliwe że plazmid nie przyjął wstawki bo ligazy łącza wszystko jak leci). Bakterie wysiewamy na podłoże z ampicylina, bo w obrębie oporności na ten gen nie robiona była żadna operacja. Rosną komórki zarówno z plazmidem bez wstawki jak i te z wstawka (brak wzrostu komórek które nie przyjęły plazmidu). Na tym etapie nie można stwierdzić, które komórki przyjęły plazmid dlatego dokonujemy repliki komórek na nowe podłoże z tetracykliną i amplicyliną. Repliki kolonii można dokonać za pomocą stempla lub szablonu manualnie. (chodzi o to żeby na płytce z tetracykliną i ampicylina kolonie znajdowały się w tym samym miejscu aby można porównać ich wzrost). Po inkubacji na płytce z tetracyklina rosną tylko bakterie z plazmidem bez wstawki. Porównujemy płytki i wybieramy właściwe kolonie które nie wyrosły na podłożu z tetracykliną.

Fosfatazy:

CIP – cielęca jelitowa alkaliczna fosfataza i BIP – bakteryjna alkaliczna fosfataza

Powodują one defosforylację końca 5’P wektora rozciętego enzymem restrykcyjnym. Koniec 5’p zmienia się w 5’OH co uniemożliwia ligację wektora. Obce DNA nie jest potraktowane fosfatazą, ma koniec 5’P i może być połączone z wektorem przez ligazę. Defosforylacja zapobiega recyrkulacji plazmidowego wektora bez wstawki.

12. Omów grupy wektorów wywodzących się od pBR322.

Na podstawie pBR322 skonstruowano następujące systemy wektorowe:

- pAT153 – (3.7 kb) – powstał w 1980 roku. W porównaniu z pBR322 mniejszy o ok. 700 par zasad (wycięto 1 niekodujący fragment pU2) dzięki czemu liczba kopii w komórce zwiększyła się trzykrotnie, a także stało się niemożliwe niekontrolowane przekazywanie tego wektora między komórkami (np. na drodze koniugacji).

Problem niekontrolowanego przekazywania wektora między komórkami istniał w przypadku pBR322. pAT posiada większą niż pBR322 pojemność.

- pBR325 – (5.4 kb) – posiada dodatkowo trzeci marker selekcyjny (gen odporności w stosunku do chloramfenikolu). Zwiększył się rozmiar wektora bo dodany został gen odporności, zwiększyła się też pojemność.

- pBR328 – (4.9 kb) – nastąpiła rearanżacja wektora. Ma on trzy markery (oporność w stosunku do ampicyliny, tetracykliny i chloramfenikolu). Powstał przez skrócenie pBR325 o 650 par zasad.

- pMK2004 – (5.2) – dodany gen oporności na kanamycynę (ale chyba brak na chloramfenikol).

- pACYC177 – (3.7) – mały wektor. Zawiera gen oporności w stosunku do ampicyliny i kanamycyny.

13. Omówienie rodziny wektorów plazmidowych typu pUC.

pUC został skonstruowany z pBR 322. Zawiera tylko jeden marker selekcyjny –Ap⁺, w miejsce drugiej oporności wstawiono fragment genu operonu laktozowego ,,lac Z” – kodujący fragment białka β-galaktozydazy – enzymu rozkładającego laktozę. Wektory te współpracują ze szczepami E. coli, które mają uszkodzony gen β-galaktozydazy, czyli takie które nie są zdolne do rozkładu laktozy. Uszkodzenie dotyczy tzw. α – peptydu, który łączy 2 homodimery w tetramer (dopiero tetramer jest aktywny). Selekcji rekombinantów dokonujemy na podłożach z X-gal, IPTG i amplicyliną. Pod wpływem β-galaktozydazy X-gal zmienia zabarwienie z bezbarwnego na niebieski. JPTG – działa jak allolaktoza – induktor operonu laktozowego, jest jednak niemetabolizowany. Zamiast X-gal można stosować S-gal, kolonie barwią się na czarno w przeciwieństwie do X-gal jest odporny na czas sterylizacji. Wektor ten posiada także tzw. polilinker – chemicznie syntezowany oligonukleotyd zawierający miejsca restrykcyjne dla różnych enzymów, inaczej nazywany jest też MSC (miejsce wielokrotniego kolonowania)(wstawiony polilinker w obrębie genu lac Z’ nie uszkadza ciągłości genu, dopiero wstawka sprawia że gen jest nieaktywny). Obce DNA jest wstawiane w obrębie polilinkera. Zmutowane komórki E. coli, które przyjęły wektor bez wstawki, rosną na podłożu z amplicyliną, X-gal i JPTG na niebiesko(sprawny gen lac Z’ dający komplementarność z genami operonu z E. coli, rozkładanie X-galu -> niebieska barwa powstała w wyniku rozkładu X-galu). Natomiast jeżeli przyjęły wektor z wstawką w obrębie polilinkera zakłócona zostaje ciągłość genu β-galaktozydazy – na podłożu wyrosną kolonie białe.

14. Plazmidowe wektory usprawniające proces oczyszczania klonowanego produktu.

Przy produkcji np. leków ułatwienie pozyskania produktów możemy proadzić już na poziomie molekularnym.
System Ni-NTA stosujemy metkę histydynową. Służy ona do wydzielenia produktu, zwykle nie zakłóca aktywności białek. Produkt jest zakodowany dodatkiem histydyn – 6 histydyn poprzedza polilinker w wektorze, czyli miejsce wstawki genu. Za polilinkerem znajduje się kodon STOP. Te dodatkowe 6 histydyn znajduje się na N końcu. Metka może znajdować się również na C - końcu gdy jest wstawiona za polilinkerem. Po transformacji produkt jest kumulowany we wnętrzu komórki. Komórki dezintegruję się a lizat poddaje chromatografii na specjalnej kolumnie z niklem. Białko z metka wiąże się z niklem a reszta białek przechodzi przez kolumnę. Na końcu prowadzi się Lucję zametkowanego białka specjalnym buforem, białka wylatują z kolumny.
System pMAL – oparty o metkowanie, nazwa od wektora w którym go zastosowano. Metkę stanowi białko MBP wykazujące powinowactwo do maltozy. Amyloza nierozpuszczalna w wodzie zbudowana z maltoz jest wykorzystywana do formowania złoża. Lizat komórkowy wprowadzamy na kolumnę z amylozą. Białko zatrzymuję się na zasadzie powinowactwa. Elucje prowadzi się roztworem maltozy. Miedzy białkiem MBP a docelowym białkiem znajduje się specyficzna sekwencja aminokwasowa rozpoznawana przez specyficzna proteazę, która ja rozcina. Później do rozdzielenia białek stosować można ultra wirowanie, chromatografie powinowactwa lub kolumnową.

System IMPACT-CN – stosowana jest metka teinowa. Gen tego białka pochodzi z drożdży i wykazuje powinowactwo do chityny. Może być na C- i N- końcu. Docelowe białko eluujemy 2- merkaptaetanolem. Dodatkowo można przeprowadzić dializę w celu pełnego oczyszczenia. Kosztowny system do produktów wytwarzanych w niewielkich ilościach.

15. Wektory niskokopiowe typu „run-away”.

Ich stosowanie jest zalecane w przypadku, gdy produkt syntezy ich genów jest szkodliwy dla gospodarza. Jednymi z takich wektorów są wektory ,,run-away”, które w zależności od warunków hodowli są wysokokopiowane albo niskokopiowane (niezdolne do wydajnej ekspresji). Najczęściej stosowanym parametrem regulującym liczbę kopii jest temperatura. Występują one w niskiej liczbie kopii przy temp. = 37^oC, natomiast stają się wysokokopiowe w temp.= 40 - 42^oC. Te wektory są odpowiednie dla klonowania genów produktów, które są szkodliwe dla komórek gospodarza. Hodowlę aż do wejścia komórek w fazę stacjonarną prowadzi się w temp. 37^oC, by uzyskać jak największą liczbę komórek. Po osiągnięciu fazy stacjonarnej podnosimy temp. do 40 – 42^oC i uwolniona zostaje replikacja tych wektorów i intensywna ekspresja pożądanych przez nas genów. Inna metodą jest umieszczenie pożądanego genu w rejonie promotora operonu laktozowego i dodać laktozy lub IPTG dopiero w fazie logarytmicznego wzrostu.

16. Wektory o identyfikacji sygnałów transkrypcyjnych (promotorów i terminatorów) (nie pyta)

Aby sprawdzić czy klonowany fragment zawiera sekwencją regulacyjną (promotor, operator) stosujemy następujące systemy:

Działanie jego jest oparte na genie nadającym oporność w stosunku do tetracykliny. Wstawiamy 8 nukleotydową sekwencję ( w której 6 nukleotydów stanowi sekwencję rozpoznawaną przez EcoR1) pomiędzy promotor genu tetracykliny a właściwą sekwencje kodującą tetracyklinę. Wstawienie 8 nukleotydów było wystarczające, aby uniemożliwić ekspresję genu oporności na tetracyklinę. Jeśli wprowadzimy taki wektor do E.coli to nie możemy oczekiwać wzrostu na podłożu z tetracykliną. Jeśli jednak w tym miejscu (po rozcięciu EcoR1) wstawimy fragment obcego DNA zawierającego sekwencję promotorową, to może zostać uruchomiona transkrypcja genu oporności w stosunku do tetracykliny, zajdzie translacja i zostanie wytworzony produkt genu. Jeśli otrzymamy wzrost na podłożu zawierającym tetracyklinę, to możemy stwierdzić, że fragment włączony zawiera sekwencję promotorową. W ten sposób można też kontrolować wydajność promotora. Stosując różne dawki tetracykliny można zbadać siłę promotora, poziom ekspresji tego genu. Przy wyższej ekspresji można oczekiwać, że bakterie wytrzymają wyższe dawki tetracykliny.

Niekiedy zależy nam na obecności sekwencji promotorowych i terminatorowych. Pomiędzy regionami regulacyjnymi (regionem promotorowym i operatorowym) wstawiamy polilinker. Ekspresja genu „lac z” następuje pod wpływem sekwencji regulatorowych z promotora operonu arabinozowego . Dodatek arabinozy uruchamia ekspresję genu β-galaktozydazy arabinozy. Ten system musi współpracować ze specjalnie przygotowanymi szczepami E.coli które mają uszkodzony gen lac z w operonie laktozowym. Chcemy sprawdzić czy wstawiany przez nas fragment zawiera sekwencję promotorową. By się o tym przekonać transformanty wysiewamy na podłożu z arabinozą i x-Galem. Wrosną tylko komórki zawierające promotor, co będzie widoczne w postaci niebieskich kolonii (uruchomiona transkrypcja β-galaktozydazy). Jednak nie wiemy czy był to promotor operonu arabinozy czy promotor ze wstawki. Aby to sprawdzić niebieskie kolonie wysiewa się na podłożu nie zawierającym induktora (arabinozy). Jeśli zachodzi transkrypcja to znaczy, że dodany został promotor i nastąpiła ekspresja niezależna od induktora (komórki pozostają niebieskie).

Jeśli natomiast zostanie wstawiony terminator, to komórki wysiane na podłoże z arabinozą i X- Galem pozostaną bezbarwne, gdyż nie może nastąpić ekspresja β-galaktozydazy.

17. Bacillus subtilis jako organizm – gospodarz, wektory do klonowania w tych bakteriach

Bacillus subtilis to bakteria gram +, która wydziela produkty biosyntezy poza komórkę. Nie stwierdzono jej szkodliwego działania na organizm człowieka (w przeciwieństwie do E. coli, która wydziela szkodliwą enterotoksynę). Problemem jest to, iż nie znaleziono w niej dobrego plazmidu. Rozwiązaniem jest stosowanie plazmidów Streptococcus aureus, które mogą transformować B. subtilis oraz nadają jej oporność na antybiotyki. Plazmidy te mają dużą pojemność klonującą, jednakże posiadają tylko jeden marker selekcyjny (nie można stosować techniki klonowania na zasadzie inercyjnej inaktywacji). Dlatego skonstruowano sztuczne plazmidy aby można użyć techniki inercyjnej inaktywacji(np. plazmid pBD6 8,8kbp, markery streptomycyna i kanamycyna). Drugim problemem jest trudność w uzyskaniu komórek kompetentnych, ponieważ posiadają grubą ścianę komórkową.

18. Wektory bifunkcjonalne (wahadłowe, shuttle, wektor pHV33).

Są to wektory mogące funkcjonować w komórkach kilku gospodarzy, np. E. coli i B. subtilis. Są one stosunkowo dużych rozmiarów, dlatego mają małą pojemność klonującą. Muszą posiadać 2 miejsca inicjacji replikacji – po jednym dla każdego gospodarza. Przykładem takiego wektora jest pHV14. Nadaje on oporność na ampicylina i chloramfenikol w E. coli, natomiast w B. subtilis tylko oporność na chloramfenikol. Selekcja transformantów B. subtilis – na podłożach z chloramfenikolem. Transformanty E. coli na podłożu z amplicyliną. Wadą tych wektorów jest ich niestabilność. Wstępne namnożenie w E. coli pozwala na zasadzie inercyjnej inaktywacji sprawdzić czy została przyjeta wstawka. W Bacillus sprawdzamy już tylko czy jest plazmid. Po co taka zamiana? W B. subtilis produkt wydzielany poza komórkę.

19. Plazmid drożdżowy 2μm, wektory stosowane do klonowania w drożdżach (pYAC) wektory bifunkcjonalne E. coli uzasadnienie celowości klonowania w E.coli.

Czasami istnieje konieczność klonowaia genów kodujących produkty, które wymagają obróbki potranslacyjnej. Mogą to przeprowadzić tylko organizmy eukariotyczne, takie jak Saccharomyces cerevisiae.

Zalety S. cerevisiae:

- dobrze poznany genetycznie i fizjologicznie, łatwy do namnożenia

- wyizolowano i scharakteryzowano silne promotory,

- naturalnie występuje w nich plazmid 2µm

- zdolny do wywarzania wielu białek potranslacyjnych

- naturalnie wydziela poza komórkę kilka białek, dlatego skonstruowano system klonujący umożliwiający selekcję obcego białka – ułatwia to oczyszczanie produktu

- jest organizmem bezpiecznym

Plazmid 2µm – naturalnie występuje w drożdżach, może być wykorzystywany do konstrukcji wektorów ekspresyjnych. Może tworzyć strukturę II rzędową, w kształcie hantelka. Replikuje się niezależnie od genomowego DNA. Mały (6kbp) plazmid występujący w wielu kopiach. Wadą tego plazmidu jest to, że jest on plazmidem kryptycznym – nie nadaje gospodarzowi cech fenotypowych umożliwiających jego łątwą selekcję. Dodatkowo drożdże są odporne na działanie antybiotyków, dlatego nie można stosować genów oporności na antybiotyki jako markerów selekcyjnych.Dlatego też klonowanie w drożdżach wymaga stosowania mutantów auksotroficznych, czyli organizmów niezdolnych do wzrostu na podłożach minimalnych. Uszkodzony może być gen Leu-2 kodujący dehydrogenazę 3-izopropylojabłczanową, czyli enzym uczestniczący w konwersji kwasu pirogronowego do leucyny. Organizm gospodarza ma uszkodzony ten gen, natomiast plazmid do transformacji ma ten gen aktywny – nadaje organizmowi gospodarza zdolność do wzrostu na podłożach minimalnych. Oprócz leucyny mogą być uszkodzone geny syntezy innych aminokwasów np. waliny, tryptofanu. Transformacja komórek drożdżowych jest stosunkowo trudna, dlatego stosuje się wektory wahadłowe mogące być klonowane zarówno w E. coli jak i w S. cerevisiae. Przykładem takiego wektora jest YEp13 – wektor episomalny (integruje się z genem drożdży co umożliwia jego wypreparowanie). Posiada 2 markery selekcyjne dla E. coli. Dlatego najpierw stosuje się wstępną transformację E. coli na podłożach selekcyjnych. Wstawka w obrębie genu oporności na tetracyklinę. Wstępna selekcją na podłożu z ampicylina a potem na podłożu z tetracyklina (inercyjna inaktywacja) do określenia w których komórkach znajduje się plazmid z wstawionym genem. Następnie plazmid izoluje się i transformuje się nim komórki S. cerevisiae w celu uzyskania produktu. (Dodatkowym zabezpieczeniem szczepów służących do klonowania jest wprowadzenie do komórek biorcy mutacji typu nonsens – powstaje kodon STOP w obrębie jakiegoś genu. Do plazmidu wstawia się gen supresorowy – gen kodujący takie tRNA które potrafi dostarczyć do kodonu nonsensowego aminokwas tak ze translacja nie jest przerywana co znosi efekt wcześniejszej mutacji.)

Zalety wstępnego klonowania w E. coli: szybszy wzrost bakterii, łatwiejsza transformacja, wyzsza wydajnośc transformacji, łatwiejsza selekcja transformantów, łatwiejsza izolacja plazmidów, łatwiejsza do degradacji ściana komórkowa.

Sztuczny chromosom drożdżowy pYAC Yeast Artificial Chromosome – posiada bardzo dużą pojemność klonującą (do kilkuset bp) maja nawet 11,4kbp. Posiada wszystkie elementy potrzebne do powielania w komórce: miejsce początku replikacji, centromer zapewniający segregacje chromosomów siostrzanych, telomery stabilizujące końce. Po dodaniu wstawki prowadzimy ligacje z tępymi końcami. Ligaza może połączyć 2 ramiona lewe i 2 prawe (tandemy). Gospodarz powinien być pozbawiony naturalnie występującego plazmidu 2 μm, gdyż może on ulegać rekombinacji z pYACem. Markerami selekcyjnymi są geny URA3 i TRP1 (niezbędne do produkcji uracylu i tryptofanu). Plazmid współpracuje z komórkami które maja uszkodzone geny URA3 i TRP1. Posiada też gen supresorowy ADE2 gdzie możliwe jest wstawienie DNA. W komórkach ze zmutowanym genem produkcja adeniny zatrzymuje się na pewnym etapie i produkt tego etapu gromadzony jest w komórce nadając jej czerwona barwę (czyli plazmid z wstawka uszkadzająca gen supresorowy, czerwone kolonie drożdży które przyjęły DNA).

20. Niestabilność plazmidów (segregacyjna i strukturalna)

Niestabilność segregacyjna – utrata całego plazmidu przy przejściu z generacji na generację przy podziałach komórkowych. Wynika często z uszkodzenia genu odpowiedzialnego za przekazywanie plazmidu (gen PAR). Przyczyną może być multimeryzacja plazmidu – zmiesza się liczba kopii plazmidu jako niezależnej cząsteczki.

Prawdopodobieństwo utraty plazmidu:

P=2(0,5)ⁿ

P – prawdopodobieństwo utraty plazmidu

0,5 – wynik podziału komórek bakteryjnych

n – liczba kopii plazmidu w komórce

2 – powstają dwie komórki potomne

Im wyższa liczba kopii plazmidu tym mniejsze prawdopodobieństwo utraty plazmidu.

Sposoby zapobiegania

Ograniczanie ilości generacji bez presji selekcyjnej – dodatek antybiotyku np. w bioreaktorze binokularnym zmusza komórki do utrzymania plazmidów z genami oporności na antybiotyki.

Zastosowanie wektora integracyjnego – w komórkach drożdżowych wektory episomalne mają zdolność do integrowania się z DNA chromosomalnym na zasadzie krzyżowej rekombinacji, minimalizuje to szansę zgubienia wektora przy przejściu z generacji na generację.

Zastosowanie wektora ,,run away” – przy niższej temp. intensywność replikacji jest mniejsza, zatem mamy mniejszą liczbę plazmidów, które wywierają mniejszą presję na komórkę gospodarza – zmieszamy chęć gospodarza do utraty plazmidów, dopiero po osiągnięciu fazy stacjonarnej zwiększamy temp. i uruchamiamy intensywną ekspresję genów.

Zastosowanie wektorów z mechanizmem indukowanej ekspresji np. z genami operonu lac. Do momentu osiągnięcia maksymalnego namnożenia, następnie indukujemy ich ekspresję za pomocą laktozy lub IPTG.

Zastosowanie wektorów z genem racemazy alaninowej – D-alanina jest składnikiem ściany komórkowej bakterii, w pożywkach mamy L-alaninę, racemaza przekształca wersję L w D. Organizm gospodarza ma uszkodzony gen racepazy, aktywny gen jest w plazmidzie, zatem by rosnąć na podłożach z L-alaniną bakterie muszą utrzymać plazmid.

Niestabilność strukturalna – polega na zmianie struktury plazmidu w obrębie naszego docelowego genu albo w obrębie sekwencji odpowiedzialnej za replikację plazmidu. Zmiany to:

- insercja – wstawienie/ dodanie, wstawienie choćby jednego nukleotydu zmienia naturę odczytu, przestaje być syntezowane aktywny produkt

- delecja – wypadnięcie choćby jednego nukleotydu również powoduje przesunięcie ramki odczytu

- reorganizacja struktury (transpozony) – transpozony to ruchome elementy genetyczne, jeśli wstawi się on w obrębie genu kodującego produkt, to synteza produktu zostanie zakłócona.

21. Definicja wirusa, bakteriofaga lambda, możliwości zastosowania jako wektora klonującego.

Wirusy (def. Wg Luria)– twory, których genom zbudowany jest z jednego rodzaju kwasu nukleinowego odtwarzającego się w żywych komórkach z wykorzystaniem komórkowego aparatu metabolicznego. W wyniku namnożenia wirusa w komórkach zachodzi tworzenie wyspecjalizowanych cząstek – wirionów – zawierających genom wirusowy i mogących w tej postaci być przeniesiony do innych komórek.

Bakteriofagi czyli fagi są wirusami infekującymi bakterie. Mogą charakteryzować się prostym, litycznym cyklem życia lub bardziej złożonym, ściśle uregulowanym wykorzystującym integrację z genomem gospodarza. Zbudowane są z białkowego kapsydu, główki zawierającego genom wirusa oraz ogonka.

Bakteriofag λ – materiał genetyczny w postaci DNA, ok. 50 kbp, atakuje bakterie E. coli, jest łagodny (nie zawsze zabija komórki gospodarza). Genom faga λ ma tzw. rejon COS – 12 nukleotydowe jednoniciowe fragmenty na obu końcach liniowego genomu tworzące lepkie końce.

Szlaki rozwoju bakteriofaga λ

1. W normalnych warunkach – genom bakteriofaga λ integruje się z genomem E. coli, powstaje komórka lizogeniczna z profagiem (forma wirusa). Profag jest przekazywany z generacji na generację, nie szkodzi komórce bakteryjnej. W cyklu lizygenicznym ekspresji ulega 1 gen fagowy kodujący represor, który hamuje ekspresję wszystkich innych genów wirusa. (Komórka w fazie lizygenicznej odporna jest na inne infekcje wirusowe).

2. Ze szlaku łagodnego można przejść do szlaku zjadliwego w wyniku: temp., UV.

Powstaje wiele kopii genomu λ, które są upakowane w białkowe kapsydy. Wytwarzane są enzymy powodujące lizę komórki. Szlak lityczny w hodowli możemy obserwować w postaci łysinek (stref przejaśnień) na podłożu stałym. Semiłysinki (występują pojedyncze komórki bakterii) są wynikiem spowolnionego wzrostu w wyniku obciążenia energetycznego gospodarza – rozwój faga. Nie sa one skutkiem lizy komórek.

Wektory fagowe

 konstruowane tak, by zachodził tylko cykl lityczny (szukamy łysinek)

 by wektory fagowe nie włączały się do dowolnego szczepu musi być zabezpieczenie w postaci mutacji typu nonsens w kluczowych fragmentach koniecznych do realizacji szlaku rozwojowego co uniemożliwia cykl lityczny. Tylko w tzw. szczepach supresorowych – mogących znosić efekt tej mutacji za pomocą genów supresorowych możliwy jest rozwój faga.

 pojemność klonująca – 75 – 105% wielkości genu bakteriofaga

22. Fagowe wektory klonujące wtrąceniowe i wymienialne ( zasada In vitro upakowania rekombinowanego DNA w wirusowych otoczkach białkowych).

1. Wektory wtrąceniowe w obrębie zmienianego genomu faga wprowadza się dodatkową informację genetyczną bez usuwania jakiegokolwiek fragmentu genomu – nie wycina się fragmentu odpowiedzialnego za cykl lizogeniczny. Wektor o małej pojemności.

2. Wektory wymienialne – usunięte są fragmenty nieistotne dla cyklu litycznego za pomocą odpowiednich enzymów restrykcyjnych (np. fragment odpowiadający za integracje z DNA w cyklu lizygenicznym), następnie wstawiamy obcy DNA. Możemy uzyskując wektor o wielkości 75 – 105% genomu faga. Otrzymany w ten sposób wektor musimy następnie upakować by był użyteczny. Ma szersze zastosowanie i większą pojemność klonującą.

Procedura upakowania wektorów fagowych In vitro

Przy założeniach, że wektor ma 30 kbp a genom faga 50kbp to wielkość wstawki wynosi 7500bp (przy 75%) do 22500bp (przy 105%) (75% x 50 kbp = 37,5kbp 37,5kbp – 30kbp = 7,5kbp itd.) Jeśli wstawka spowoduje ze wielkości te będą mniejsze niż 75% lub większe niż 105% wielkości genomu to materiał genetyczny nie ulegnie upakowaniu. Czyli pusty wektor nie ulegnie upakowaniu – brak łysinek.

Są dwie procedury upakowania In vitro:

1. Jednoszczepowa

Chcemy uzyskać białka, które mają służyć jako opakowanie rekombinowanych cząstek DNA. Stosuje się w tym celu odpowiednie szczepy lizogeniczne, które nie mogą przeprowadzać lizy. Uszkodzony szczep nie może replikować, ale może produkować białka i enzymy niezbędne do upakowania wektora. Białka te gromadzą się wewnątrz zainfekowanych komórek bakteryjnych.

2. Dwuszczepowa

Wystepują dwa szczepy E. coli zainfekowane dwoma różnymi fagami λ. W jednym szczepie uszkodzony jest gen kodujący białko E (odpowiedzialny za konstrukcję główki) – w tym szczepie powstają dziurawe główki. W drugim szczepie jest uszkodzone białko D – odpowiedzialne za pakowanie białek w kapsydzie. Produkty obu szczepów są akumulowane w komórkach zainfekowanych bakterii. Następnie pobieramy białka z obu komórek – otrzymujemy ekstrakt do upakowania (dezintegracja komórek za pomocą lizy, zamrażania i rozmrażania).

23. Biologiczne zabezpieczenia przed ucieczką rekombinowanego DNA z laboratorium (mutacje nonsens w wektorach)

Zabezpieczeniem chroniącym przed ucieczka rekombinowanego DNA z laboratorium jest stosowanie mutacji nonsensowych w wektorach. Polega ono na wstawieniu kodonu stop w obrębie rekombinowanego genu co w normalnych warunkach zatrzymuje translację. W laboratoriach stosuje się specjalne mutanty zawierające gen supresorowy – gen kodujący takie tRNA które potrafi dostarczyć do kodonu nonsensowego aminokwas tak ze translacja nie jest przerywana co znosi efekt wcześniejszej mutacji. W analogiczny sposób można zabezpieczyć się przed ucieczką szczepu z laboratorium.

24. Charakterystyka bakteriofaga M13, jego cykl rozwoju, wektory konstruowane w oparciu o tego bakteriofaga.
    
    
    

M13 jest łagodnym fagiem, który nigdy nie prowadzi do lizy komórki. Fag ten zbudowany jest z nitkowatej osłonki białkowej, wewnątrz której zawarty jest jednoniciowy, kolisty DNA (6407bp). M13 wnika do komórki E. coli przez bakteryjny pilus białkowy. Jednoniciowy DNA występujący w cząstce wirusowej w zainfekowanej komórce ulega replikacji poprzez kolistą dwuniciową formę replikacyjną RF zawierającą nici ,,+” i ,,-” (forma RF może się replikować na zasadzie toczącego się koła). Do nowych cząstek wirusowych pakowana jest tylko nic ,,+”. Cechą charakterystyczną M13 jest to, że nie zabija on bakterii będącej gospodarzem, co umożliwia wyhodowanie dużych ilości fagów M13 i łatwe ich izolowanie. Infekcja jest widoczna w postaci semiłysinek – uwalniający się fag nie niszczy komórki (bo podłozny kształt) tylko spowalnia metabolizm.

Cykl życiowy faga M13:

1. Rozpoznanie miejsca receptorowego na komórce

2. Utworzenie pilusa – kanału którym wstrzykiwany jest materiał genetyczny

3. Dosyntetyzowanie drugiej nici – powstaje forma dwuniciowa RF

4. Replikacja DNA – potomne RF dwuniciowe na zasadzie toczącego się koła z wytworzeniem jednoniciowego DNA

5. Jednoniciowy DNA pakowany jest w osłonki wirusowe i dojrzałe cząstki fagów są wydalane na zewnątrz komórki

Fag ten jest atrakcyjny ze względu na występowanie w formie jednoniciowej. Komórki, które przyjmą faga M13 będą się wolniej namnażać, powstaną na płytkach z podłożem stałym koliste obszary o spowolnionym wzroście – semiłysinki . W obszarze wektorowego DNA faga jest niewiele do usunięcia.

Sposób przygotowania wektorów z faga M13 :

DNA faga poddano trawieniu Pst I rozpoznającym 10 miejsc restrykcyjnych w obszarze międzygenowym (wstawienie obcego fragmentu nie narusza funkcjonowania wektora). W obszarze międzygenowym można wstawić fragment zawierający początek genu β-galaktozydazy (promotor i operon) z polilinkerem (identyczny jak w pUC18 i 19). Tak przygotowany wektor przecina się w jednym miejscu jego dwuniciowej kolistej formy replikacyjnej (RF) za pomocą enzymu restrykcyjnego, w obrębie polilinkera. Następnie z rozciętym wektorem łączy się (reakcja ligacji) dwuniciowe fragmenty obcego DNA uzyskane po trawieniu tym samym enzymem, którego użyto do rozcięcia wektora. Selekcji dokonuje się na podłożach z X-Galem i IPTG. Powstają semiłysinki, w których widoczne są kolonie rosnące na niebiesko (efekt ekspresji genu β – galaktozydazy) – są to komórki , które przyjęły wektor bez wstawki, bezbarwne są komórki które przyjęły wektor z wstawką. Przykład wektora z M13 – M13mp18

25. Fagemidowe systemy wektorowe, charakterystyka i zastosowanie.

Fagemidy powstały z połączenia wektora fagowego z plazmidowym.

Wektor plazmidowy pochodzący od pUC posiada element wspomagający z genomu bakteriofaga M13. Infekujemy kulturę bakteryjną fagiem wspomagającym by wygenerować jednoniciowe DNA. Powstały wektor posiada fragment wektora plazmidowego i fragment wektora fagowego. Fagemidy są stosowane przy wprowadzaniu mniejszej pojemności.

W tym Fagemidzie występuje fragment operonu laktozowego z polilinkerem w obrębie kodującym β- galaktozydazę oraz gen oporności na amlicykinę. Zachowuje się on jako wektor plazmidowy, gdyż replikuje dwuniciowy DNA. Nie ma w tym wektorze żadnego genu kodującego białka osłonki, a więc nie może powstać posiadający jednoniciowy DNA fag nitkowy. Infekujemy kolonię posiadającą ten wektor fagiem wspomagającym M13K07 (zmodyfikowany M13), aby dostarczyć informacji o białkach otoczkowych, które później posłużą do upakowania. (jego dwuniciowe DNA RF przechodzi w jednoniciowe). Zaletą systemów fagomidowych jest to, że posiada on cechy zarówno wektora plazmidowego jak i fagowego. Dzięki cechom wektora fagowego możliwe wprowadzenie dużych wstawek ( 75-105 % wielkości bakteriofaga λ) i upakowanie ich w kapsyd co umożliwia łatwe dostarczenie wektora do komórek biorcy i ich transformacje. Dzięki cechom wektora plazmidowego jest możliwa selekcja transformantów na podłożu z ampicylina i IPTG ( taka sama jak w przypadku wektora pUC).

26. Charakterystyka wektorów kosmidowych (klonowanie kosmidami trawionymi dwoma enzymami restrykcyjnymi, charomidy).

Są to cząsteczki DNA plazmidu do których dodano sekwencje cos pochodzące z DNA faga λ (stąd ich nazwa). Sekwencja cos jest niezbędna by DNA faga został upakowany w otoczkę białkową. Kosmidy posiadają wszystkie typowe cechy występujące w plazmidach łącznie z MCS i genami oporności na antybiotyki, a także sekwencje występujące w fagu λ – cos. Klonowanie przy pomocy kosmidów łączy metody związane z użyciem jako wektora zarówno faga λ jak i plazmidów. Kosmidowy DNA trawi się enzymami restrykcyjnymi i liguje z obcym DNA. Zrekombinowane kosmity są następnie pakowane w kapsydy λ, którymi infekuje się E. coli. Kosmity nie zawierają genów λ i dlatego po infekcji nie tworzą łysinek tylko rosną w postaci kolonii, co jest dla nas korzystniejsze ( ułatwiona selekcja rekombinantów ) . Selekcji dokonuje się na podłożach z dodatkiem ampicyliny, na której będą rosły kolonie zawierające zrekombinowane kosmidy. Można je powielić w taki sam sposób jak plazmidy. Zaletą kosmidów jest ich zdolność do przyjęcia bardzo dużych wstawek. Ponieważ kapsydy λ mogą przyjąć do 53 kpz, a kosmidy są bardzo małe (zwykle 8 kpz lub mniej) można klonować w nich wstawki wielkości do 44 kpz ( czyli dużo większe niż w przypadku fagemidów i wektorów fagowych). Można tu wstawiać wyłącznie wstawki które razem z wektorem stanowią co najmniej 75 % genomu faga λ. Mniejsze wstawki nie zostaną upakowane w osłonki(rozwiązanie problemu z pustymi plazmidami). Rozwiązaniem tego problemu są charomidy. Charomidy to połączenia wektorów kosmidowych z wektorami plazmidowymi. Zawierają wstawkę pochodzącą od pBR w około 23 powtórzeniach. Charmidy umożliwiają upakowanie mniejszych fragmentów (mniej niż 75 % genomu faga λ), które zostaną dopełnione tzw. „spacerami” (wypełniaczami), pochodzącymi od pBR, do minimalnej wielkości jaka jest wymagana do upakowania w osłonki kapsydu.

27. Łączenie DNA (terminalna transferaza, dorabianie homopolimerowych ogonków, linkery, adaptery).

Podczas pracy z DNA ulega ono fragmentacji. Powstałe fragmenty mogą mieć niezidentyfikowane końce, z którymi ligaza nie będzie w stanie sobie poradzić (ligaza nie połączy lepkich niekompetentnych końców). By temu zaradzić stosuje się następujące techniki:

1. Dorabianie homopolimerowych ogonów – stosuje się enzym zwany terminalną transferazą. Wydłuża ona koniec 3’, ale tylko gdy koniec 3’ jest jednoniciowy. Jeżeli mamy tępe końce to ten fragment trzeba poddać λ-egzonukleazy, która hydrolizuje jedną nić 5’ -> 3’ generując lepki koniec. Terminalna transferaza nie wymaga matrycy, dobudowuje homonukleotydy. W wyniku jej działania, wszystkie czasteczki otrzymuja nowy fragment na końcu 3’, każda z nich może mieć inną długośc, ważne by były chociaż częściowo komplementarne. Powstałe przerwy będą naprawione w komórkach przez systemy naprawcze.

2. Użycie linkerów – dwuniciowych oligoukleotydów, które zawierają sekwencję rozpoznawaną przez enzymy restrykcyjne. Warunkiem stosowania linkerów jest to, że w sekwencji klonowanego fragmentu DNA nie ma miejsca restrykcyjnego pasującego do linkera. Przecięcie linkera odpowiednim enzymem generuje lepkie końce.

3. Adaptery – jednoniciowe oligonukleotydy. Adapter jest komplementarny do końców, które nie mogły być połączone(nie są komplementarne do siebie). Przyłacza się do jednego końca, tworzy się lepki koniec który łączy się też z drugim końcem. Powstaje przerwa w której przez pewien fragment DNA jest jednoniciowe jednak zostanie ona naprawiona po wprowadzeniu ligowanego fragmentu do komórki (systemy naprawcze).

28. Biblioteki genów, czynniki warunkujące ich wielkość, równanie Clarka - Carbona.

Biblioteka genów – zestaw klonów, np. bakteryjnych lub cząstek DNA plazmidowych, fagowych, w którym to zestawie reprezentowany w formie fragmentów jest cały genom lub cały zestaw genów. W zależności od zastosowanego systemu wektorowego banki genów mogą być różnej wielkości. Biblioteka jest zapisywana w formie stron tworzących tomy : 25 kbp tworzy stronę a 1500 stron tworzy tom. Przykładowe wielkości biblioteki genów :

- bakteriofag λ – genom wielkości 50 kbp – 2 strony

- E.coli – genom wielkości 4,7 Mbp – 200 stron

- S. cerevisiae – genom wielkości 15 Mbp – 1/3 tomu

- człowiek – genom 3000 Mpb – 80 tomów

Wzór Clarka i Carbona opisuje matematyczne wielkość biblioteki genów = wymaganej liczbie rekombinantów (klonów). N to ilość niezbędnych rekombinantów , aby z prawdopodobieństwem P wyizolować gen X stosując system wektorowy o pojemności L z organizmu, którego wielkość genomu wynosi M.

Gdzie:

N – wymagana liczba rekombinantów

P – prawdopodobieństwo z jakim jesteśmy w stanie znaleźć w danym banku dany gen

X – wielkość szukanego genu

L – długość klonowanego fragmentu (zależy od pojemności klonującej danego systemu)

M – wielkość genomu

Wykorzystuje się dwa rodzaje bibliotek:

1. Biblioteki genomowego DNA - które przygotowuje się z genomowego DNA danego organizmu, np. genomową bibliotekę myszy można przygotować trawiąc DNA myszy enzymem restrykcyjnym tak, by uzyskać dużą liczbę fragmentów o identycznych końcach kohezyjnych. Fragmenty DNA należy następnie kowalencyjnie połączyć (poddać ligacji) z linearyzowanymi (rozciętymi w jednym miejscu) cząsteczkami wektora plazmidowego lub wirusowego. Biblioteka taka powinna zawierać wszystkie sekwecje jądrowego DNA myszy i można ją będzie przeszukiwać w celu wyłowienia z niej i następnie zbadania mysiego genomu, będącego obiektem naszych zainteresowań. Każdy klon w takiej bibliotece jest nazywany klonem genomowego DNA. Nie każdy klon genomowego DNA zawiera kompletny gen, ponieważ w wielu przypadkach enzym restrykcyjny co najmniej 1 raz rozetnie DNA w obrębie genu.

2. Biblioteki cDNA – przygotowuje się je wykorzystując odwrotną transkryptazę retrowirusa do zsyntetyzowania DNA komplementarnego do całkowitego mRNA komórki. Jednoniciowy cDNA jest następnie przekształcany w dwuniciowy DNA i wprowadzany do wektora. Każdy klon w tak przygotowanej bibliotece to klon cDNA. W przeciwieństwie do poprzedniej biblioteki, ta zawiera tylko te sekwencje DNA, które ulegają ekspresji jako mRNA. Z różnych tkanek zwierzęcych, w których dochodzi do ekspresji odmiennych zestawów genów, uzyskuje się różne biblioteki cDNA.

Schemat konstrukcji biblioteki genów:

Populacja komórek , tkanka wektor

Izolowanie izolowanie

mRNA wielkocząsteczkowy DNA

odwrotna transkrypcja

cDNA rozcinanie nukleazą

modyfikacja częściowe trawienie

fragmenty DNA modyfikacje końcowe (fosfatazy CIP, BAP)

ligacja

zrekombinowany DNA

transformacja E.coli

amplifikowanie, utrwalanie

amplifikowana pierwotna biblioteka genów

biblioteka genów

29. Metody transformacji E. coli (z CaCL₂, PEG-DMSO, elektrotransformacja).

(Transformacja - (łac. transformatio = przekształcenie) lub inaczej transfekcja, (jeśli DNA został wyizolowany z bakteriofaga), to proces przeniesienia in vitro DNA najczęściej wyekstrahowanego z hodowli bakteryjnej do bakterii biorcy. Komórka bakterii biorcy musi być w określonym stanie fizjologicznym (faza logarytmiczna, musi być pozbawiona systemu restrykcji, nie może wytwarzać substancji niebezpiecznych oraz wprowadzone mutacje musza pozwolić na selekcje transformantów. Wydajność transformacji – ilość kolonii bakteryjnych, powstała na podłożu selekcyjnym, otrzymanych z 1μg DNA użytego do transformacji. Wyrażona jest w cfu/μg DNA. )

Metoda Mandel’a i Higa

Polega ona na inkubacji komórek E. coli w roztworze CaCl₂ w łaźni lodowej, po czym dodaje się roztwór plazmidowego DNA. CaCl₂ powoduje rozluźnienie struktur komórkowych. Następnie przenosi się probówkę z łaźni lodowej do łaźni o temp. 42^oC (3 min) wywołując szok termiczny. Plazmidowe DNA do tej pory zabsorbowane na powierzchni komórek w wyniku zmiany temperatury wnikaja do wnętrza komórek. Przeprowadzamy inkubację w 37^oC w pożywce płynnej bez antybiotyku (nowe cechy wprowadzone z DNA plazmidowego mają zacząć działać). Potem wysiewamy na stałe podłoże z dodatkiem antybiotyku i otrzymujemy transformanty. )siągamy wydajność transformacji 10⁶ – 10⁷jtk (cfu). Wydajność ta dotyczy cząstek plazmidowego DNA o wielkości do 5000 pz (bp). Wraz ze wzrostem wielkości cząsteczki DNA wydajność transformacji spada. Gdy wykorzystujemy cząstki wektorowe ze wstawionymi fragmentami (wykorzystujemy ligację), to wchodzić będzie tylko kolisty zamknięty DNA (pusty wektor lub zamknięty wektor z wstawką), a więc wydajność transformacji będzie mniejsza niż 100%. Powyższa metoda została udoskonalona przez Hanahana w 1983 poprzez wzbogacenie środowiska transformacji w jony Mg²⁺, Mn²⁺ (MgSO₄, MnCl₂), co zwiększyło wydajność (10⁸).

Metoda Chung’a i Millera

Metoda Chung i Miller która pozwala na przetrzymywanie komórek kompetentnych w głębokim zamrożeniu. Komórki po osiągnięciu fazy logarytmicznego wzrostu zawiesza się w roztworze z siarczanem(IV) magnezu i chlorkiem manganu (II) z glikolem polietylenowym z dodatkiem 5% DMSO. Tak przygotowana mieszaninę można zamrozić i przechowywać w zamrażarce 2 lata.W tej metodzie nie stosujemy szoku termicznego, ale wszystkie operacje wykonujemy w lodzie. Później przenosimy do świeżego podłoża i inkubujemy w 37^oC (temperatura optymalna dla wzrostu E. coli). Wydajność 10⁸ cfu/µg DNA.

Elektrotransformacja

Elektrotransformacja polega na uzyskaniu komórek kompetentnych za pomocą elektropermeabilizacji ściany komórkowej. Duża różnica potencjałów powoduje powstanie perforacji w komórkach. Przebieg procesu elektroperforacji polega na umieszczeniu komórek oraz DNA które chcemy w niej umieścić do kuwety z elektrodami. Następnie stosowane są wysokie napięcia przy bardzo krótkich impulsach rzędu milisekund. Tak uzyskane komórki wysiewa się na podłoże selekcyjne. Metoda jest znacznie wydajniejsza od metod chemicznych nawet do 20 razy (Wydajność 10⁹ cfu/µg DNA). Zaletą tej metody jest również fakt że można wprowadzać fragmenty DNA o wielkościach do 130 kbp. Jest ona wykorzystywana głównie do bakterii. Wadą jest wysoka śmiertelność komórek

30. Metody transformacji B. subtilis (komórek komplementarnych, transformacja protoplastów).

Atrakcyjnym gospodarzem jest również B. subtilis (G+). Większość syntetyzowanych białek jest wydzielana poza komórkę

Metoda Anagnostopulos’a

Polega ona na otrzymaniu kompetentnych komórek na drodze dwuetapowej kontrolowanej hodowli na podłożach ubogich w składniki odżywcze, dzięki czemu komórki miały niekompletną ścianę komórkową. Metoda ta nie dawała jednak dobrych efektów, gdy mieliśmy do czynienia z monomerycznym plazmidowym DNA (pojedynczy odcinek DNA formie kolistej). Wydajność transformacji w tym wypadku była bardzo niska lub z komórki w ogóle nie otrzymywano transformantów.

Przyczyny problemów związanych z tą metodą:

1. Jeśli wprowadzamy monomeryczny plazmidowy DNA, to ulegnie on absorpcji na powierzchni komórki, do wnętrza wchodzi tylko jedna nić natomiast druga jest degradowana, więc nie może zachodzić replikacja.

2. Forma dimeryczna (lub trimeryczna). Do cząsteczki wchodzą: jednoniciowy DNA z jednego meru i jeden jednoniciowy z drugiego. Odcinki te są do siebie komplementarne i dzięki temu mogą być włączone i może zajść replikacja i synteza nowych plazmidowych DNA.

Metoda Chang’a i Cohen’a.

Metoda zaproponowana przez Chang i Cohen pozwalającą na transformacje protoplastów Bacillus subtilis. Komórki zawiesza się roztworem w roztworze 0,5M sacharozy(działająca ochronie na powstające protoplasty) oraz lizozymu z jaja kurzego. Na skutek działania enzymu ściana komórkowa ulega degradacji(degradacja wiązania 1,4-β-glikozydowe w β-glukanie występującym w warstwie peptydoglikanu), a komórki pozostają w formie protoplastu. W takiej postaci komórki łatwo przyjmują obce DNA. Po tym etapie protoplasty rozsiewa się na podłożu regeneracyjnym gdzie odbudowują osłonę, a następnie na podłoże selekcyjne.Wydajność tej metody wg jej autorów 10⁸ cfu/µg DNA. Pękanie protoplastów podczas procesu powoduje zwiększenie lepkości roztworu i powstanie aglomeratów nieuszkodzonych protoplastów. Aby temu zapobiec stosuje się czasami dodatek DNA-zy, która nie zdegraduje plazmidów w protoplastach, ale zdegraduje zwiększający lepkość roztworu chromosomalny DNA. Powyższa metoda nie wymaga wprowadzenia multimetrycznej formy DNA. W przypadku wprowadzenia form monomerycznych uzyskujemy wyższą wydajność, gdyż do plazmidu wchodzą całe wektory koliste.

31. Metody bezpośredniej selekcji i skriningu rekombinantów (ekspresja genów warunkujących antybiotykową odporność, ekspresja genów enzymów szlaków biosyntezy koniecznych dla rozwoju komórek – aminokwasów, nukleotydy, witaminy, ekspresja genów enzymów sprawdzalnej aktywności (alfa-amylazy, proteinaza, fenolo-liaza tyrozynowa) (3 przykłady na 3ke 5 na 5ke)

Metody te polegają na zastosowaniu prostego testu lub podłoża selekcyjnego i umożliwiają bezpośrednie wskazanie aktywności klonów. Mogą być stosowane wówczas gdy występuje ekspresja genu i produkt jest łatwy do identyfikacji. Przykładami metod bezpośrednich są:

a) geny oporności na antybiotyki

b) geny znoszące efekty mutacji auksotoficznych

c) geny α-amylazy, proteazy, lipaz, β-galaktozydazy

d) gen fenololiazy tyrozynowej

Izolowanie genów:

Geny oporności antybiotykowej, bezpośrednia selekcję na podłożach zawierających antybiotyki. Wzrost koloni posiadających opornośc.

Gen Leu Z mutanty auksotroficzne są gospodarzem a plazmid zawiera brakujący gen, selekcję prowadzimy na podłożu zdefiniowanym na którym wyrosną tylko komórki które przyjęły plazmid. (synteza leucyny)

Gen β-galaktozydazy selekcja na podłożu z X-gal I IPTG, transformanty rosną na niebiesko

Gen α-amylazy selekcja na podłożu z dodatkiem skrobi i płynu Lugola. Można stosować również skrobie modyfikowaną np. STARCH AZURE (skrobia błękitna – trwałe połączenie jodem). Identyfikacja – utrata błękitnego zabarwienia.

Geny lipaz do podłoża dodajemy tłuszcze oraz indykator pH, rosnące komórki hydrolizują tłuszcze produkując kwasy tłuszczowe i obniżając pH wokół koloni, co powoduje zmianę barwy indykatora

Geny protez do podłoża dodaje się kazeinian wapnia, który powoduje jego zmętnienie. Wokół kolonii wytwarzających proteazy pojawia się strefa przejaśnienia.

Gen katalazy dodanie do podłoża H₂O₂ które redukowane przez katalazę powoduję pienienie się i wytwarzanie gazu – identyfikacja transformanta

Gen fenololiazy tyrozynowej – jest to enzym mający zdolność do rozkładu tyrozyny do fenolu, kwasu pirogronowego i amoniaku. Wydzielany fenol jest szkodliwy dla komórek bakterii, dlatego na podłożu z tyrozyną widzimy strefy przejaśnień wokół koloni, które mają gen kodujący ten enzym.

32. Metody identyfikacji klonów w banku genów (metody immunologiczne i immunochemiczne w przypadku ekspresji genów, metody hybrydyzacyjne w przypadku banku ekspresji genów (sondy DNA, sondy RNA).

Są to metody pośrednie stosowane, gdy następuje ekspresja genu (jest produkowany metabolit), ale trudno go oznaczyć (np. produkcja hormonu na podłożu stałym). Rozwiązaniem jest zastosowanie metod immunologicznych lub immunochemicznych :

- dodatek specyficznych przeciwciał do stałego podłoża, gdy docelowy produkt jest wydzielany poza komórkę,

- liza komórek, gdy docelowy produkt jest wewnątrzkomórkowy.

W przypadku braku ekspresji stosuje się metody hybrydyzacyjne

A) Metoda immunologiczna – Polega ona na wiązaniu się specyficznego białka –wyznakowanego radioaktywnie przeciwciała wiążącego się do poszukiwanego przez nas produktu i unieruchomienie go na podłożu stałym ( powstają aureole wokół koloni wydzielającej poszukiwany przez nas produkt). Jako sondę można w takim przypadku wykorzystać nie tylko specyficzne przeciwciało, ale każdy ligand wiążący się specyficznie z badanym białkiem np. do identyfikacji klonów syntetyzujących białkowy receptor hormonu jako sondę można stosować znakowany hormon oddziałujący z tym receptorem.

Komórki z biblioteki genów wysiewa się bezpośrednio na podłoże hodowlane( mogące zimmobilizować sondę) a następnie dodaje się wyznakowaną sondę(radiacyjnie bądź obecnie stosowane znakowanie fluorescencyjne). Łączy się ona z poszukiwanym przez nas białkiem i następnie zostaje związana przez podłoże w pobliżu kolonii wydzielającej to biało. Analiza – wzbudzone światło fluorescencyjne.

B) Metoda immunochemiczna – stosowana w przypadku, gdy produkt nie jest wydzielany poza komórkę. Komórki z biblioteki genów wysiewa się bezpośrednio na podłoże hodowlane a następnie dokonuje się dezintegracji komórki np. za pomocą lizozymu lub bakteriofaga i przenosi komórki na odpowiedni filtr. Następnie do filtru dociska się poliwinylowy krążek pokryty przeciwciałami (łatwo wiążącymi się z tworzywem sztucznym). Przeciwciała z płytki połączą się z antygenem (naszym produktem białkowym) tworząc kompleks dwuskładnikowy. Kolejnym etapem jest dodanie immunoglobiny IgG znaczonej J¹²⁵, która wykazuje powinowactwo do kompleksu antygen – przeciwciało i łączy się z nim dając kompleks trójskładnikowy. Następnie dokonuje się autoradiografii i porównujemy wyniki z koloniami na płytce odniesienia.

Metody immunoenzymatyczne i immunoenzymosorbcyjne służy do wykrywania określonych białek w badanym materiale z użyciem poliklonalnych lub monoklonalnych przeciwciał koniugowanych z odpowiednim enzymem. Działanie: przeciwciało związane z określonym enzymem może specyficznie rozpoznać dane białko (nasz szukany produkt), które wcześniej unieruchomiono na podłożu. Po dodaniu przeciwciał następuje utworzenie kompleksów immunologicznych – unieruchomienie przeciwciała. Po wypłukaniu niezwiązanych przeciwciał dodawany jest substrat dla enzymu związanego z przeciwciałem. Używa się do tego specjalnej reakcji aby produkty były łatwe do identyfikacji (np. barwa)

C) Metoda hybrydyzacyjna – gdy nie ma ekspresji poszukiwanego genu. Stosuje się wyznakowane radioaktywnie lub barwnikiem sondy DNA lub RNA będące komplementarne do fragmentów poszukiwanego przez nas genu(konstruowanie sondy opiera się na sekwencjach konserwatywnych, czyli takich, które pojawiają się w danym genie stale u wielu typów organizmów. Sekwencje te dostępne są w bazach danych). Identyfikacja rekombinantów poprzez hybrydyzację koloni wygląda następująco :

1. mamy kolonie transformantów na płytce do której dociska się krążek nitrocelulozowy.

2. dokonujemy lizy bakterii 0,5 M NaOH, neutralizujemy, dodajemy proteinaz, przemywamy i inkubujemy w 30˚C

3. unieruchamiamy DNA

4. dodajemy wyznakowaną sodę która hybrydyzuje się z rozpoznawaną przez siebie sekwencją DNA

5. dokonujemy autoradiografii i porównujemy wyniki z koloniami na płytce odniesienia

33. Charakterystyka aktywności właściwej polimerazy DNA I, fragment Klenowa oraz zastosowanie tego enzymu.

Polimeraza I DNA jest pojedynczym łańcuchem polipeptydowym zbudowanych z dwóch podjednostek. Katalizuje ona dodawanie jednostek deoksyrybonukleinowych do łańcucha DNA:

(DNA)_{n reszt} + dNTP  (DNA)_n+1 + PPi

Do syntezy łańcucha DNA polimeraza DNA I potrzebuje:

1. Wszystkich 4-ech aktywnych prekursorów – 5’-trifosforanów deoksyrybonukleozydów: dATP, dGTP, dTTP, dCTP. Konieczna jest też obecność jonów Mg²⁺.

2. Odcinka starterowego (primera), gdyż polimeraza ta dołącza deoksyrybonukleotydy do wolnej grupy 3’-hydroksylowej już istniejącego odcinka DNA

3. Matrycy DNA jako istotnego składnika układu. Martycą może być jedno- lub dwuniciowy DNA. Dwuniciowy DNA jest efektywną matrycą

Reakcja wydłużania łańcucha katalizowana przez polimerazę zachodzi w wyniku nukleofilowego ataku grupy 3’-OH primera na atom fosforu trifosforanu deoksyrybonukleozydu położony najbliżej deoksyrybozy. Tworzy się wiązanie fosfodiestrowe i równocześnie zostaje uwolniony pirofosforan. Hydroliza uwolnionego pirofosforanu odbywa się przez pirofosfatazę. Elongacja łańcucha DNA odbywa się w kierunku 5’  3’. Polimeraza DNA I jest enzymem instruowanym przez matrycę. Enzym czerpie instrukcje od matrycy i dokonuje syntezy produktu, którego sekwencja zasad jest komplementarna do sekwencji zasad matrycy. Inną właściwością polimerazy tej jest zdolność korygowania pomyłek przez eliminację nukleotydów nie dopasowanych do matrycy. Enzym ten katalizuje hydrolizę nukleotydów, które nie są komplementarne. Ma ona więc aktywność 3’  5’ egzonukleazy. Miejsce odpowiedzialne za tę aktywność jest różne od miejsca odpowiedzialnego za wydłużanie łańcucha. Polimeraza DNA I usuwa niesparowane nukleotydy na końcu odcinka starterowego przed rozpoczęciem polimeryzacji. Dzięki tej właściwości polimerazy DNA I replikacja DNA przebiega bardzo wiernie, a błędy pojawiają się nie częściej niż 1 zasada na 10⁸ zasad poprawnych. Polimeraza DNA I sprawdza wynik każdego przyłączenia przed przystąpieniem do następnego cyklu katalitycznego. Może ona także hydrolizować DNA poczynając od końca 5’ łańcucha (ma aktywność egzonukleazowa 5’  3’ ). W tym przypadku cięcie może zachodzić na końcowym wiązaniu fosfodiestrowym lub na wiązaniu oddalonym o kilka reszt od końca 5’. Miejsce katalityczne odpowiedzialne za tę aktywność w enzymie jest wyraźnie oddzielone od miejsca aktywnego polimeryzacji i hydrolizy 3’  5’.. Aktywność egzonukleazowa 5’  3’ – pełni kluczową rolę podczas replikacji, ponieważ usuwa starterowy odcinek RNA, a także uzupełnia aktywność nukleazową 3’  5’ przez naprawienie błędów innego rodzaju.

Fragment Klenowa - fragment polimerazy DNA E. coli zachowuje aktywność polimerazową i egzonukleazy 3` -> 5`. Otrzymuje się go poprzez proteolityczne trawienie polimerazy DNA I za pomocą subtilizyny. Otrzymuje się mały fragment mający aktywność egzonukleazy 5’  3’ oraz duży fragment Klenowa. Fragment ten jest używany do uzupełniania lepkich końców o komplementarne zasady. Usuwa z końca 3` DNA fragmenty, które powstały w wyniku cięcia specyficznymi nukleazami restrykcyjnymi.

34. Enzymatyczna synteza genów na matrycy mRNA (polimeraza DNA zależna od RNA, zalety otrzymania cDNA w odniesieniu do genów eukariotycznych).

Kluczem do uzyskania DNA komplementarnego do mRNA czyli uzyskania cDNA jest enzym odwrotna transkryptaza. Polimeraza DNA zależna od RNA czyli odwrotna transkryptaza jest enzymem pochodzącym u retrowirusów. Syntezuje ona łańcuch DNA komplementarny do matrycowego RNA. Wymaga do działania startera DNA oraz deoksynukleotydów. Późniejsza hybryda DNA-RNA może być zhydrolizowana przez podwyższone pH (RNA jest podatny na hydrolizę alkaliczną).Otrzymany cDNA zawiera tylko geny kodujące funkcjonalne produkty. U eukariontów po transkrypcji mRNA ulega modyfikacjom potranslacyjnym (np. splicing), który nie występuje u prokaryota. Dzięki temu możliwa jest ekspresja genu w bakteriach.

35. Chemiczna synteza oligonukleotydów – ogólny schemat, automatyzacja, klonowanie chemiczne syntetyzowanego genu samalostatyny.

Jest to proces otrzymywania metodami chemicznymi krótkich (maksymalnie do ok. 200 jednostek nukleotydowych, zwykle ok. 20) fragmentów DNA lub RNA (oligonukleotydów) o zdefiniowanej sekwencji zasad nukleotydowych.

Do reakcji wykorzystuje się zazwyczaj jednostki nukleotydowe, posiadające w pozycji 3'-OH aktywowaną grupę fosforanową lub jej analog, do której przyłączane są kolejno następne jednostki posiadające wolną grupę 5'-OH. Pozostałe centra reaktywne niebiorące udziału w danej reakcji są zablokowane grupami ochronnymi. Odpowiedni dobór i manewrowanie grupami ochronnymi pozwala na uzyskanie bardzo wysokiej wydajności tworzenia wiązania internukleotydowego (> 99%).

W przeciwieństwie do metod enzymatycznych, podejście chemiczne pozwala na łatwe wprowadzanie różnorodnych modyfikacji we wszystkich elementach syntezowanego oligonukleotydu (tj. na zasadzie heterocyklicznej, szkielecie cukrowym oraz reszcie fosforanowej). Najczęściej modyfikacje takie stosowane są w celu zwiększenia odporności na enzymy hydrolityczne, polepszenia hybrydyzacji z komplementarną nicią kwasu nukleinowego oraz do wprowadzania znaczników, np. fluorescencyjnych.

Najczęściej stosowane zestawy grup ochronnych (blokujących):

1. zasady heterocykliczne: grupa benzoilowa, grupa izobutyrylowa, grupa fenoksyacetylowa

2. centrum fosforowe: grupa cyjanoetylowa , grupa chloro- lub nitrofenylowa

3. pozycja 2'-OH rybozy: grupa tertbutylodimetylosililowa (usuwana jonami F^-); grupa tetrahydropiranylowa

4. pozycja 3'-OH: grupa benzoilowa, grupa lewulinylowa

5. pozycja 5'-OH: grupa dimetoksytrytylowa DMTr

Przebieg syntezy:

Synteza odbywa się w kolumienkach zawierających złoże z unieruchomionym pierwszym nukleotydem. Metody syntezy można pogrupować w zależności od zastosowanej chemii, fazy, skali itd. Obecnie najczęściej stosowanym podejściem jest automatyczna synteza metodą amidofosforynową na podłożu stałym. Składa się ona z powtarzanych kolejno cykli syntetycznych prowadzących do przyłączania kolejnych nukleotydów do łańcucha oligonukleotydowego rosnącego na podłożu stałym:

1. START: Podłoże stałe posiada pierwszy nukleozyd, przyłączony końcem 3'.

1. Odblokowanie zasady (detrytylacja) (Przemycie roztworem kwasu w celu usunięcia grupy DMTr z pozycji 5'-OH)

2. Aktywacja kolejnego nukleotydu przy pomocy tetrazolu

3. Przyłaczenie kolejnej zasady która ma zablokowana gupe fosforanową

4. Odblokowanie grupy fosforanowej (Przemycie roztworem jodu i wody w rozpuszczalniku organicznym w obecności katalizatora nukleofilowego. Fosforyn utlenia się do fosforanu.)

5. Kapowanie - przemycie roztworem bezwodnika octowego w celu zablokowania grup 5'-OH, do których nie przyłączył się amidofosforyn.

6. Powrót do punktu 1. Procedurę powtarza się aż do uzyskania pożądanego oligonukleotydu.

Po zakończeniu syntezy oligonukleotyd podlega procesowi izolacji:

1. Końcowe odblokowanie: poprzez umieszczenie podłoża stałego z oligonukleotydem w roztworze amoniaku uzyskuje się:

1. odcięcie oligonukleotydu od podłoża;

2. odblokowanie grup ochronnych z zasad heterocyklicznych;

3. odblokowanie reszty fosforanowej (eliminacja reszty cyjanoetylowej).

2. W przypadku RNA dodatkowym etapem jest odblokowanie pozycji 2'-OH. Grupę sililową usuwa się zazwyczaj w warunkach zbliżonych do obojętnych za pomocą fluorku tetrabutyloamoniowego (TBAF) lub fluorowodorku trietyloamoniowego (TEA•3HF).

3. Oczyszczanie produktu za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (jonowymiennej lub w fazie odwróconej) lub elektroforezy (PAGE). Dla krótkich oligonukleotydów (kilka jednostek nukleotydowych) stosować można również chromatografię cienkowarstwową

4. Liofilizacja gotowego oligonukleotydu.

Przykładem genu uzyskanego ta metoda jest gen kodujący somatostatynę – hormonu hamującego hormon wzrostu.

36. Metoda chemiczna określania sekwencji nukleotydów Maxama – Gilberta. (nie pyta)

Metoda chemicznego zrywania wiązań opracowana przez Maxama - Gilberta polega na wyznakowaniu pojedynczej nici DNA na jednym końcu atomem P³² (radioaktywny izotop). Zwykle znakuje się koniec 5 ’ za pomocą kinazy polinukleotydowej, która do grupy 5 ‘ hydroksylowej przyłącza P³² przenoszony przez ATP. Znakowany DNA jest następnie zrywany preferencyjnie w miejscach występowania 1 z 4 zasad. DNA jest specyficznie zrywany za pomocą odczynników, które modyfikują, a następnie oddzielają zasady od reszty cukru (zrywa wiązanie N-glikozydowe) :

- puryny usuwa się przez działanie siarczanem dimetylu, który etyluje guaninę N-7 a adeninę przy N-3. W przypadku działania DMS w środowisku obojętnym odłączona zostaje tylko zasada G, natomiast po dodaniu kwasu mrówkowego odłącza się A i G

- pirymidyny usuwa się poprzez działanie hydrazyny . Hydrazyna usuwa zasadę A i C, natomiast po dodaniu 1,5 M NaCl zostaje usunięta tylko zasada C.

Następnie stosuje się piperydynę która powoduje pęknięcie łańcucha cukrowego o odłączeniu zasady.

Fragmenty powstające z każdej z 4 mieszanin są następnie rozdzielane elektroforetycznie w żelu poliakryloamidowym o dużej zdolności rozdzielczej ( pozwalającym rozdzielić fragmenty, których długość różni się 1 nukleotydem). Następnym etapem jest odczytanie autoradiogramu. Autoradiogram z żelu, na którym rozdzielono produkty każdej z 4 mieszanin reakcyjnych zawiera obraz prążków, z którego można bezpośrednio odczytać sekwencje nukleotydów.

Etapy sekwencjonowania:

1. znakowanie DNA izotopem P³² na końcu 5’

2. reakcja odłączenia zasad – wyznakowane DNA dzieli się na 4 probówki do których dodaje się odpowiednio DMS, DMS i HCOOH, hydrazynę, hydrazynę + NaCl

3. przecięcie łańcucha za pomocą piperydyny

4. elektroforeza

5. autoradiografia

Przykład : mamy sekwencje 5 ‘ –P³² GCTACGTA-3 ‘. Po działaniu czynnikami zrywającymi otrzymujemy 4 probówki z następującymi sekwencjami :

- zrywanie przy A: P³²- GCT P³²- GCTACGT

- zrywanie przy G: P^32-GCTAC

^- zrywanie przy C: P^32-G P³²- GCTA

-zrywanie przy T: P³²-GC p³²-GCTACG

37. Metoda enzymatyczna określania sekwencji nukleotydów Sangera – Coulsona (znakowanie radioaktywnością i fluorescencją, automatyzacja procesu).

DNA do analizy musi być w formie jednoniciowej, aby mogła służyć jako matryca do syntezy nowej nici. Do kopiowania wykorzystuje się polimerazę I z E. coli. Potrzebne sa również startery. W skład mieszaniny reakcyjnej wchodzą: polimeraza DNA, startery, matrycy DNA w postaci jednoniciowe, 2’- deoksynukleotydów (dNTP), 2’,3’ – dideoksynukleotydów (ddNTP) – brak jest grupy 3’-OH zatem nie można dodać następnego nukleotydu i następuje germinacja

Przebieg reakcji :

1. dzielimy mieszaninę zawierającą wiele kopii matryc na 4 próbki, do każdej próbki dodajemy polimerazę DNA I , jeden konkretny ddNTP i 4 rodzaje dNTP

2. matryca steruje włączaniem dNTP i ddNTP

3. wydłużanie łańcucha jest zatrzymane losowo, gdy do matrycy włączany jest ddNTP

W przypadku posiadania matrycy dwuniciowe należy ją denaturować, obniżamy potem temperaturę by umożliwić przyłączenie się startera. (Wtedy jednak nie można dodać polimerazy z E. coli na początku)

Selekcje przeprowadza się poprzez znakowanie ddNTP za pomocą radioaktywnego izotopu lub fluorescencyjnie. Znakowane w ten sposób mogą być tez startery.

Przykład : mamy sekwencję matrycową 5’-CGTAGCTTA-3’, nić komplementarna to 5’-GCATCGAAT-3’ Otrzymujemy następujące fragmenty

Zawartość probówki	Starter+wydłużenie(nić komplementarna)	Sekwencja wydłużona
ddATP+4dNTP	Starter + 3	Starter -dGdCddA
	Starter + 7	Starter -dGdCdAdTdCdGddA
	Starter + 8	Starter - dGdCdAdTdCdGdAddA
ddCTP + 4dNTP	Starter +2	Starter -dGddC
	Starter +5	Starter - dGdCdAdTddC
ddGTP + 4dNTP	Starter + 1	Starter - ddG
	Starter + 6	Starter - dGdCdAdTdCddG
ddTTP + 4dNTP	Starter + 4	Starter - dGdCdAddT
	Starter + 9	Starter - dGdCdAdTdCdGdAdAddT

Produkty każdej z mieszanin inkubacyjnych poddaje się elektroforezie w 4 równoległych ścieżkach żelu poliakrylamidowego, a następnie autoradiografii. Sekwencję DNA określa się przez proste odczytanie obrazu pasm na autoradiogramie, poczynając od końca żelu do jego początku (tzn. odczytując sekwencję DNA w takim kierunku, w jakim ona powstaje poczynając od startera). Sekwencja odczytana bezpośrednio z żelu jest sekwencją łańcuchów nukleotydów nowo syntetyzowanych. Sekwencja ta jest komplementarna do sekwencji wyjściowej matrycy DNA. Obecnie DNA jest sekwencjonowany w sposób automatyczny z zastosowaniem metody dideoksy, ale z zastosowaniem ddNTP znakowanego fluoryzującym barwnikiem, a nie radioaktywnie. ddNTP wykorzystywany do każdej z 4 mieszanin jest znakowany barwnikiem o innej fluorescencji. Po inkubacji łączy się mieszaniny i poddaje elektroforezie w jednej ścieżce żelu. Laserowy detektor rozróżnia i identyfikuje każdy z produktów w miarę ich wypływania z żelu. Kolejność w jakiej są wymywane z żelu produkty o różnej fluorescencji, stanowi sekwencję DNA. Zaletą wykrywania na podstawie fluorescencji jest eliminacja odczynników radioaktywnych oraz możliwość zautomatyzowania procedury. (np. użycie elektroforezy kapilarnej – DNA przeciska się przez kapilare gdzie barwy wychwytywane są przez detektor i przetwarzany na wykres w postaci pików)

Pirosekwencjonowanie

Metoda sekwencjonowania DNA w czasie rzeczywistym. Biorą w niej udział 4 enzymy: fragment klenowa polimerazy DNA I, sulfulyraza ATP, lucyferaza, apiraza. Matrycami sa jednoniciowe DNA. Sekwencjonowanie jest możliwe poprzez syntetyzowanie nici komplementarnych przez polimerazę. Każdorazowo gdy włączany jest nukleotyd uruchamiana jest seria enzymatycznych reakcji, których wynikiem jest sygnał świetlny.

1 Hybrydyzacja primera

2 Dodanie jednego z czterech DTP inicjuje ten etap, Polimeraza DNA dołącza komplementarny dNTP. W wyniku tego powstaje pirofosforan w stechiometrycznej ilości:

dATP jest zastępowane przez dATP-α-S ( deoksyadenozyno – α – tiotrifosforan) po to, by nie aktywować lucyferazy.

3. Sulfurylaza ATP ilościowo przekształca PP_i do ATP w obecności APS. Powstały ATP stymuluje lucyferazę do przekształcenia lucyferyny w oksylucyferynę, czego wynikiem jest wytworzenie impulsu świetlnego o intensywności proporcjonalnej do ilości ATP. Powstałe światło jest mierzone przez kamerę CCD i może być analizowane przez specjalne oprogramowanie.

4.jeżeli dodany nukleotyd nie znajduje komplementarnej pary wówczas zostaje on zdegradowany za pomocą apirazy do dinukleotydu lub mononukleotydu (dotyczy to również nadmiaru ATP):

5.Dodajemy nowy nukleotyd i rozpoczynamy nowy cykl

Zastosowanie pirosekwencjonowania:

- szybkie sekwencjonowanie krotkich i średnich fragmentów DNA ( 20-30 pz),

- analiza SNP w wielu dziedzinach badań

- identyfikacja mutacji odpowiedzialnych za choroby

- monitorowanie lekowych terapii

- kryminalistyka

- genotypowanie czynników infekcyjnych ( np. wirusa HPV)

38. Reakcja PCR, zasada metody oraz jej wykorzystanie.

PCR ( Polymerase Chain Reaction) – łańcuchowa reakcja polimeryzacji. Umożliwia ona w jednej reakcji enzymatycznej, powielenie (amplifikację) w ciągu kilku godzin określonego odcinka DNA w milionowych ilościach kopii. Kopiowanie odbywa się bez pośrednictwa wektorów. Metoda powielania DNA tą techniką polega na cyklicznym powtarzaniu denaturacji DNA, przyłączaniu starterów i syntezie nowej nici DNA między tymi starterami.

W pierwszym cyklu docelowe cząsteczki DNA rozdzielone są na 2 nici w wyniku ogrzewania mieszaniny do 95^oC. Zazwyczaj przez ok. 60 s. Następnie w celu przyłączenia starterów obniża się temperaturę do ok. 55^oC (przez ok. 30 s, temperatura zależy od budowy startera). Po przyłączeniu starterów podnosi się temperaturę mieszaniny do 72^oC, w której zachodzi optymalna polimeryzacja z wykorzystaniem dTP i Mg²⁺ zawartych w mieszaninie reakcyjnej.

Replikacja rozpoczyna się od primerów na każdej nici i zachodzi na obu niciach w 2-óch przeciwnych kierunkach. Po zakończeniu replikacji nici są rozdzielone (denaturacja), aby ponownie umożliwić wiązanie znajdujących się teoretycznie 2n dwuniciowych cząsteczek DNA będących kopiami sekwencji zawartej pomiędzy primerami.

PCR daje się stosunkowo łatwo zastosować jako technika laboratoryjna. Materiałem wyjściowym do amplifikacji jest DNA zawierający interesującą nas sekwencję. Ponieważ sekwencja ta określana jest przez primery użyte do reakcji, nie jest konieczne izolowanie samej sekwencji. Ilość DNA stosowanego do PCR jest bardzo mała (teoretycznie wystarczy jedna cząsteczka DNA). Do mieszaniny reakcyjnej oprócz DNA, dodaje się nadmiar primerów (2 rodzaje primerów określających miejsce startu replikacji na każdej nici), polimerazę DNA, odpowiedni bufor zawierający jony Mg²⁺ oraz mieszaninę 4-ech prekursorów DNA, tj. dNTP. Powodzenie reakcji PCR wymaga właściwego doboru następujących parametrów:

1. starterów reakcji amplifikacji (primerów). Produkując startery reakcji PCR, należy je dobrać tak aby:

- starter zawierał ok. 50% par GC,

- był wysoko specyficzny dla danej sekwencji

- dł. primerów wynosiła ok. 20 – 30 par zasad, a temp. ich topnienia 50 – 60^oC,

- startery nie powinny zawierać w części 3’-końcowej fragmentów komplementarnych do siebie samych oraz do drugiego startera,

2. parametrów reakcji amplifikacji (stężenia dNTP, polimerazy, starterów, Mg²⁺). Do reakcji PCR używa się polimerazy z Thermus aquaticus (Taq polimeraza) lub inne termo stabilne polimerazy DNA (np. Pfu, Pwo, Vent). Mają one tę przewagę nad innymi polimerazami DNA, że są stabilne nawet w 94^oC (optimum temperaturowe wynosi 72^oC), a więc mogą być dodane jednorazowo na samym początku reakcji PCR, nie ulegając dezaktywacji w trakcie kolejnych cykli podgrzewania,

3. warunków samej reakcji PCR (temp., czasu trwania cykli itp.). Czas i temp. w dużym stopniu zależą od wielkości produktów otrzymywanych w procesie amplifikacji oraz sekwencji i długości starterów.

Reakcję prowadzi się w objętości 10 – 50 µl pod warstwą oleju parafinowego lub wosku, zapobiegającą parowaniu. Probówki z PCR umieszcza się w specjalnym aparacie (ang. Thermal cycler), w którym propaguje się czas trwania i liczbę cykli oraz temp. poszczególnych etapów reakcji. Zwykle stosuje się 25 – 35 cykli.

Zastosowanie reakcji PCR

- namnażanie DNA

- izolowanie konkretnego genu z genomu za pomocą odpowiednich starterów

- analizowanie sekwencji podobnych genów

- sekwencjonowanie DNA

- kryminalistyka

- diagnostyka medyczna

- diagnostyka mikroorganizmów

- detekcja i identyfikacja patogenów złośliwych

- wykrywanie zafałszowań w zywności

- otrzymywanie sond molekularnych

- badania ewolucyjne

- archeologia

- konstruowanie bibliotek cDNA z małych ilości mRNA

Typowy profil cyklu PCR

39. Zalety zastosowania termostabilnych polimeraz w technice PCR.

Do reakcji PCR stosuje się termostabilne polimerazy DNA, które zostały wyizolowane z wielu termofilnych bakterii, a ich geny sklonowane. Najbardziej popularna jest polimeraza Taq z Thermus aquaticus. Wytrzymuje ona etap denaturacji DNA w temp. 95^oC przez 1-2 min i w tej temp. ma okres półtrwania wynoszący 2h, a więc mogą być dodane jednorazowo na samym początku reakcji PCR, nie ulegając dezaktywacji w trakcie kolejnych cykli podgrzewania. Wiadomo, że polimeraza Taq podczas kopiowania DNA wprowadza błędy (1 błąd na 250 polimeryzowanych nukleotydów). Oprócz polimerazy Taq można stosować inne termostabilne polimerazy np. Pfu, Pwo, Vent.

40. Reakcja PCR w czasie rzeczywistym (Real-time PCR), zasada metody oraz jej wykorzystanie.

Jest to reakcja PCR w czasie rzeczywistym. Jest ona wykorzystywana do określania zawartości konkretnych genów, określania ich ilości. Pozwala ona na bieżąco śledzić przyrost kopii danego fragmentu DNA czy konkretnego genu w specjalnym termocyklerze. Główną różnicą pomiędzy konwencjonalna reakcję PCR a RT-PCR jest możliwość oceny ilości powstającego produktu reakcji w trakcie jej trwania. Monitorowanie przyrostu liczby kopii badanej sekwencji w czasie rzeczywistym możliwe jest dzięki znakowaniu starterów, sond oligonukleotydowych lub produktów amplifikacji cząsteczkami zdolnymi do fluorescencji (fluorochromami). Fluorescencja każdej próbki jest proporcjonalna do ilości zsyntetyzowanego produktu (im silniejsza fluorescencja, tym więcej kopii). Mierząc fluorescencję próbek po każdym cyklu reakcji można monitorować jej przebieg.

Fluorochromy muszą zostać wzbudzone światłem o określonej długości fali, a wyemitowana przez nie energia musi być wykryta i zmierzona. Do wzbudzania fluorochromów używa się lampy, diody elektroluminescencyjnej lub lasera. Lampy emitują światło o szerokim zakresie długości fal, podczas gdy LED i laser – wąskie. Detektory mogą posiadać filtry, dzięki którym wykrywana i mierzona jest tylko jedna długość fali.

Real time PCR pozwala również obliczyć ilość kopii badanego fragmentu DNA, jak była obecna w próbce przed reakcją. Do obliczenia ilości badanych cząsteczek obecnych w mieszaninie na początku reakcji wykorzystuje się moment, w którym poziom fluorescencji barwnika przekroczy zdefiniowany próg (CT). Im wcześniej poziom fluorescencji wzrósł do określonego poziomu, tym więcej było kopii badanej sekwencji w próbce na początku reakcji. Najczęściej CT jest momentem wejścia reakcji w fazę logarytmicznego przyrostu ilości produktu.

W celu zbadania liczby kopii badanej sekwencji w próbie sporządza się serię rozcieńczeń roztworu o znanym stężeniu i liczbie kopii DNA, wyznacza się wg nich krzywą standardową i mając dany punkt CT na podstawie krzywej standardowej szacuje się liczbę cząsteczek.

Techniki określania ilości nowych kopii badanego fragmentu DNA można podzielić na metody wykrywania sekwencji specyficznych i niespecyficznych.

Detekcja niespecyficzna

Detektorami niespecyficznymi są cząsteczki fluorochromu emitujące światło o określonej długości po związaniu się z dwuniciowym DNA, takie jak bromek etydyny, jodek propidyny, czy SYBR Green I.

Detekcja niespecyficzna to najprostsza i najmniej kosztowna metoda, jednak najbardziej podatna na błędy, np. wskutek wiązania się fluorochromu ze strukturą primer-dimer, powstającą w wyniku wiązania się starterów ze sobą, gdy są one częściowo do siebie komplementarne, czy z innymi niespecyficznymi produktami reakcji.

Detekcja specyficzna

Najczęściej używane metody detekcji sekwencji kwasów nukleinowych wykorzystują zjawisko transferu energi rezonansu fluorescencji. W mieszaninie reakcyjnej startery lub sonda wyznakowane są fluorescencyjnie. Podczas reakcji dochodzi do przeniesienia energii zaabsorbowanej przez jeden fluorochrom (reporter) na drugi, który emituje światło o innej długości lub dochodzi do wygaszenia emisji fluorochromu przez związek wygaszający. Przykładami są :

1.Sondy TaqMan

Pierwszymi znakowanymi fluorescencyjnie sondami użytymi w real-time PCR były sondy TaqMan . Są to krótkie oligonukleotydy zawierające na końcu 5’ reporter fluorescencji a na końcu 3’ cząsteczkę wygaszającą fluorescencję . Wielkość sondy (odpowiednia odległość między reporterem na jednym jej końcu, a wygaszaczem na drugim) umożliwia przekazywanie energii między fluorochromami. Sonda taka po związaniu się z komplementarną sekwencją na etapie wydłużania jest degradowana przez polimerazę Taq posiadającą aktywność 5`-egzonukleazową, przez co fluorochrom ulega oddzieleniu od wygaszacza. Rozdział obu cząsteczek umożliwia emisję światła fluorescencyjnego.

Uwolniony fluorochrom gromadzi się po każdym cyklu PCR, dzięki czemu może być mierzony w każdym momencie trwania PCR.

2.Molecular beacons

Inną metodą monitorowania przyrostu liczby kopii badanej sekwencji w czasie rzeczywistym jest technika „molecular beacons”. Sondy typu „molecular beacons” są oligonukleotydami posiadającymi fluorochrom na końcu 5’, a na końcu 3’ wygaszasz fluorescencji NFQ (DABCYL). Regiony na końcach sondy są do siebie komplementarne, tak więc w niskich temperaturach hybrydyzują tworząc strukturę spinki do włosów (ang. hairpin), dzięki czemu reporter fluorescencji i cząsteczka wygaszająca znajdują się blisko siebie.

W takim układzie fluorochrom na końcu 5’ nie emituje światła, gdyż wygaszacz przechwytuje jego energię. Środkowy region sondy, tworzący pętle w strukturze spinki do włosów, jest komplementarny do produktu PCR, tak więc w odpowiedniej temperaturze sonda wiąże się z DNA, czego skutkiem jest oddalenie fluorochromu od wygaszacza fluorescencji i emisja światła, którego natężenie jest monitorowane. Jeśli nie ma produktu, z którym sonda może się związać, przyjmuje ona strukturę spinki do włosów i fluorescencja jest wygaszana.

3. System LUX®

Starter w przód wyposażony jest w barwnik, ma specyficzną sekwencję, nie ma wygaszacza. W wyniku wydłużenia strumień świetlny wzbudza luminescencję barwnika. Starter występuje w formie szpilki do włosów która nie emituję światła, natomiast po hybrydyzacji z nicią DNA podczas wydłużania, starter wykazuje fluorescencję w dwuniciowym DNA.

Zastosowanie RT PCR

- jakościowe oznaczanie DNA (bakterie, wirusy, geny, fragmenty DNA)

- ilościowe oznaczenie DNA i RNA

– oznaczenie ilości mRNA pozwala określić poziom ekspresji genów przy pomocy odwrotnej transkryptazy. Im więcej kopi mRNA tym więcej cDNA, a co za tym idzie większa ekspresja danego genu.

- oznaczanie mutacji (translokacji, delecji, duplikacji)

- oznaczanie GMO

- oznaczanie SNP (pojedynczego polimorfizmu nukleotydowego)