Ćwiczenie 1. Metody oceny antygenów i przeciwciał oparte na reakcji precypitacji
Podstawy reakcji precypitacji
Reakcja precypitacji jest najprostszym typem reakcji wiÄ…zania siÄ™ antygenu ze swoistym
przeciwciałem. Zachodzi zarówno w środowisku płynnym jak i stałym. Antygeny biorące udział
w reakcji to rozpuszczalne w wodzie antygeny białkowe (zarówno pełnowartościowe, jak
i resztkowe, czyli hapteny, które nabywają zdolność indukowania odpowiedzi immunologicznej
po połączeniu z białkiem nośnikowym) o masie cząsteczkowej od 40 do 160 kD. Kolejną ważną
cechą antygenu jest jego wielowartościowość, czyli posiadanie co najmniej dwóch determinant
antygenowych. Przeciwciała precypitujące to przeciwciała wykazujące wysokie powinowactwo,
czyli wysoką siłę wiązania się z determinantami antygenowymi.
Reakcja precypitacji zachodzi dwuetapowo. W pierwszym etapie antygen reaguje ze
swoistym przeciwciałem i powstaje kompleks antygen-przeciwciało, który w drugim etapie,
w strefie równowagi ich stężeń, zostaje wytrącony w roztworze pod wpływem elektrolitów
w postaci precypitatu widocznego jako zmętnienie środowiska. Na przebieg reakcji wpływają
różne czynniki:
- stosunki ilościowe antygenu i przeciwciała; antygen i przeciwciało łączą się ze sobą w
różnych stosunkach ilościowych, ponieważ mają różną wartościowość. Reakcja ta zachodzi
najszybciej w strefie ekwiwalencji, czyli równowagi obu reagentów. Przy nadmiarze przeciwciał
lub antygenu kompleksy sÄ… rozpuszczalne;
- stężenie elektrolitów; optymalne stężenie uzyskuje się stosując 0,85% roztwór NaCl.
Wyższe stężenie jonów w środowisku reakcji powoduje zmniejszenie ilości utworzonego
precypitatu;
- temperatura; zależnie od gatunku, od którego pochodzi surowica odpornościowa
(surowica zawierająca swoiste przeciwciała otrzymana w wyniku uodpornienia określonym
antygenem) przeciwciała będą precypitowały w różnych temperaturach. Np. przeciwciała
królicze jednakowo precypitujÄ… w temperaturze 37ÚC, 20ÚC i 4ÚC, natomiast przeciwciaÅ‚a
koÅ„skie precypitujÄ… szybciej w temperaturze 37ÚC;
- pH środowiska; optymalna wartość pH dla tej reakcji mieści się w granicach 6,5 - 8,5;
- dopełniacz; kompleksy antygen-przeciwciało aktywują układ dopełniacza, który może
częściowo rozpuszczać kompleks. Dlatego do reakcji należy stosować surowice zinaktywowane
(na przykład za pomocą chlorku choliny).
Immunodyfuzja jest reakcją precypitacji zachodzącą w środowisku stałym. Oparta jest na
zjawisku dyfuzji cząsteczek antygenu i przeciwciała w żelu. W środowisku żelowym precypitat
powstaje w miejscu zetknięcia się dwóch reagentów będących w optymalnych stosunkach
ilościowych, czyli w strefie ekwiwalencji, i powstaje w postaci linii, łuku lub pierścienia
precypitacyjnego. Szybkość dyfuzji w żelu jest wprost proporcjonalna do stężenia reagentów,
a odwrotnie proporcjonalna do wielkości cząsteczek. Jako środowisko reakcji stosuje się żel
agarowy, agarozowy lub poliakrylamidowy, pozwalające na swobodną dyfuzję reagentów.
Reakcja immunodyfuzji zależy od tych samych czynników, co reakcja precypitacji. Przy
dłuższym przetrzymywaniu prób z precypitatami żel użyty do odczynu należy zabezpieczyć
przez dodanie do niego azydku sodu.
Przykłady praktycznego zastosowanie reakcji precypitacji w diagnostyce medycznej
1. Odczyn precypitacji pierścieniowej. Odczyn ten jest testem jakościowym, służącym do
wykrywania antygenu lub przeciwciał w płynach ustrojowych. Ma praktyczne zastosowanie w:
vð wykrywaniu w badanym materiale obecnoÅ›ci antygenów bakteryjnych
vð klasyfikacji bakterii
vð wykrywaniu obecnoÅ›ci obcych biaÅ‚ek w faÅ‚szowanych produktach spożywczych
vð okreÅ›laniu pochodzenia plam z krwi i innych pÅ‚ynów ustrojowych (w medycynie sÄ…dowej)
2. Test VDRL. Inaczej odczyn flokulacyjny - test kłaczkujący. Szybki test jakościowy. Ma
praktyczne zastosowanie w:
vð diagnostyce kiÅ‚y wykrywanie w surowicy pacjenta obecnoÅ›ci przeciwciaÅ‚ przeciwko
Treponema pallidum, bakterii wywołującej kiłę
3. Odczyn pierścieniowej immunodyfuzji radialnej (odczyn Manciniego). Test wykonywany
w środowisku stałym (immunodyfuzja) służący do ilościowej oceny białek w płynach
ustrojowych. Ma praktyczne zastosowanie w:
vð oznaczaniu stężenie różnorodnych biaÅ‚ek ustrojowych, w tym: albuminy, skÅ‚adowych
dopełniacza, apolipoprotein, CRP, ceruloplazminy, transferyny, fibronektyny, lizozymu,
IgG, IgM, IgA, IgD oraz podklas immunoglobulin (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2),
a także łańcuchów lekkich immunoglobulin
Ćwiczenie 2. Metody oceny antygenów i przeciwciał oparte na reakcji aglutynacji
Podstawy reakcji aglutynacji
Aglutynacja to reakcja między swoistymi przeciwciałami a antygenem upostaciowanym
(w przeciwieństwie do antygenów rozpuszczalnych w wodzie biorących udział w reakcji
precypitacji). Reakcję aglutynacji można podzielić na dwa typy:
a) aglutynację bezpośrednią (czynną) czyli taką reakcję, w której antygeny są
 naturalnymi składnikami błony lub ściany komórek np. erytrocytów, leukocytów, komórek
bakterii, grzybów, pierwotniaków.
b) aglutynację pośrednią (bierną) czyli taką reakcję, w której antygen zostaje jedynie
opłaszczony na nośniku np. cząsteczce lateksu, bentonitu, polistyrenu, erytrocycie. Gdy
nośnikiem danego antygenu są erytrocyty, reakcję aglutynacji nazywamy hemaglutynacją
bierną. W odczynie lateksowym nośnikiem antygenu są cząsteczki lateksu.
Reakcja aglutynacji, podobnie jak precypitacji, przebiega dwuetapowo. W pierwszym
etapie następuje związanie antygenu przez swoiste przeciwciała, w drugim natomiast powstałe
kompleksy immunologiczne (antygen + przeciwciało) w obecności elektrolitów wypadają
z roztworu w postaci obserwowanych makroskopowo aglutynatów. Jako środowisko reakcji
najczęściej stosujemy 0,85% roztwór NaCl o pH 6,8 - 7,2, lecz do niektórych testów wymagane
jest pH w granicach 4,1 - 4,4 (np. aglutynacja pałeczek Salmonella). W prawidłowym przebiegu
reakcji aglutynacji, istotna jest także temperatura reakcji. W zależności od użytych reagentów
należy jÄ… odpowiednio dobrać (4°C, 20°C lub 37°C). UWAGA! Surowica odpornoÅ›ciowa użyta
do reakcji aglutynacji musi zostać wcześniej zinaktywowana czyli pozbawiona dopełniacza,
gdyż kompleksy immunologiczne mają zdolność wiązania dopełniacza.
Odczyny aglutynacji przeprowadzamy na mikropłytkach, na szkiełkach przedmiotowych
(aglutynacja szkiełkowa) lub w probówkach (aglutynacja probówkowa).
Przykład aglutynacji bezpośredniej
Bakteria ma na swojej powierzchni antygen  X
Przeciwciała IgM skierowane są przeciwko antygenowi  X
Wynik reakcji: Komórki bakteryjne opłaszczone przeciwciałami łączą się w duże agregaty
i wypadają z zawiesiny w obecności elektrolitów w postaci widocznego makroskopowo
aglutynatu.
Przykłady praktycznego zastosowania reakcji aglutynacji w diagnostyce medycznej:
1. Odczyn aglutynacji szkiełkowej. Szybki test jakościowy stosowany do:
vð identyfikacji szczepów bakteryjnych, szczególnie paÅ‚eczek jelitowych z rodziny
Enterobacteriaceae, w tym Salmonella i Shigella flexneri
vð okreÅ›lania grup krwi (patrz: ćwiczenie 3)
2. Odczyn aglutynacji probówkowej. Odczyn ten służy do ilościowej oceny poziomu swoistych
przeciwciał (wyrażany jako miano surowicy) w płynach ustrojowych. Stosowany jest praktycznie
w:
vð diagnostyce duru brzusznego i duru rzekomego  odczyn Widala - wykrywanie
obecności swoistych przeciwciał przeciwko Salmonella typhi (pałeczka duru brzusznego)
lub Salmonella paratyphi (pałeczka duru rzekomego)
vð diagnostyce zakażeÅ„ bakteriami z rodziny Rickettsiaceae (dur plamisty)  odczyn Weil-
Felixa
vð diagnostyce zakażeÅ„ bakteriami z rodzaju Brucella (bruceloza)  odczyn Widala-Wrighta
3. Odczyn hemaglutynacji biernej. Test przydatny do ilościowej oceny poziomu swoistych
przeciwciał (wyrażany jako miano surowicy) w płynach ustrojowych. Praktycznie stosowany w:
vð diagnostyce chorób reumatycznych i zespoÅ‚u Sjogrena (choroba autoimmunizacyjna) 
odczyn Waalera-Rosego (wykrywanie czynnika reumatoidalnego)
4. Test lateksowy. Bardzo szybki, jakościowy i półilościowy test niezwykle przydatny
w diagnostyce klinicznej. Praktycznie stosuje siÄ™ go do:
vð oceny poziomu antystreptolizyny O, CRP, czynnika reumatoidalnego
vð oceny poziomu swoistych przeciwciaÅ‚ w diagnostyce mononukleozy zakaz
nej, kiły,
tocznia rumieniowatego układowego i zakażeń wywołanych przez Helicobacter pylori
vð identyfikacji rotawirusów i adenowirusów w kale
vð diagnostyce zakażeÅ„ wywoÅ‚anych przez paciorkowce (klasyfikacja bakterii)
Ćwiczenie 3. Zastosowanie metody aglutynacji w wybranych testach serologicznych
Serologia to dział immunologii i immunodiagnostyki zajmujący się badaniem i oceną
antygenów i przeciwciał we krwi. Serologia ma szczególnie istotne znaczenie
w immunohematologii, która obejmuje badanie odpowiedzi immunologicznej na antygeny
znajdujące się na elementach morfotycznych krwi. Znajomość zróżnicowania antygenowego
składników krwi jest kluczowa w transfuzjologii, ma również istotne znaczenie w ginekologii
i położnictwie, transplantologii i medycynie sądowej.
Układy grupowe krwi. Dotychczas zidentyfikowano 29 układów grupowych krwi,
a najważniejszym z nich jest układ grupowy ABO. Antygeny należące do tego układu są
polisacharydami występującymi na krwinkach w trzech podstawowych typach; charakteryzują
się one silną antygenowością. Występują nie tylko w błonie erytrocytów, ale i na innych
komórkach (oprócz komórek nerwowych) oraz w płynach ustrojowych (oprócz płynu mózgowo-
rdzeniowego). Układ ABO jest jedynym układem w obrębie którego znajdują się we krwi
naturalne przeciwciała (głównie IgM) przeciwko antygenom nieobecnym na własnych
krwinkach. Podział na grupy krwi opiera się na obecności w błonie komórkowej erytrocytów
odpowiedniego antygenu, a w surowicy odpowiedniego naturalnego przeciwciała.
Antygen w błonie Przeciwciało naturalne
Grupa krwi erytrocytów w surowicy
Grupa A
A1  silna odmiana antygenu A anty-B
podgrupa A1
A2  słaba odmiana antygenu A
podgrupa A2
Grupa B antygen B anty-A
Grupa AB
antygen A1 i antygen B brak
podgrupa A1B
antygen A2 i antygen B
podgrupa A2B
Grupa 0 antygen H anty-A i anty-B
Układ grupowy Rh. Antygeny układu Rh występują tylko w błonie erytrocytów. W tym
układzie występuje 5 głównych antygenów  D, C, E, c oraz e. Najsilniejszą immunogenność
wykazuje antygen D i dlatego podział na grupy opiera się na obecności (grupa Rh+) lub braku
(grupa Rh-) antygenu D. W surowicy brak jest przeciwciał naturalnych skierowanych przeciwko
antygenom układu Rh. Przeciwciała w układzie Rh (głównie IgG) powstają wyłącznie po
przetoczeniu krwi niezgodnej w układzie Rh lub w przebiegu konfliktu serologicznego i mają
charakter przeciwciał odpornościowych. Są to tzw. przeciwciała niekompletne bowiem nie
powodujÄ… reakcji aglutynacji w 0,85% roztworze NaCl.
Odczyn antyglobulinowy Coombsa. Przy pomocy tego odczynu wykrywa się obecność
przeciwciał niekompletnych, które wiążą się z antygenami na powierzchni erytrocytów, ale nie
powodują aglutynacji komórek. Przeciwciała niekompletne wykrywa się za pomocą przeciwciał
antyglobulinowych. Odczyn antyglobulinowy Coombsa wykonuje się w dwóch wariantach:
- odczyn bezpośredni, w którym wykrywamy przeciwciała niekompletne opłaszczone in
vivo na erytrocytach,
- odczyn pośredni, w którym wykrywamy obecność przeciwciał niekompletnych
w surowicy.
Praktyczne zastosowanie wybranych testów serologicznych w diagnostyce klinicznej
1. Oznaczanie grup krwi układów ABO i Rh i próba krzyżowa
vð identyfikacja grupy krwi pacjenta, szczególnie przed planowanymi zabiegami
chirurgicznymi
vð okreÅ›lanie grup krwi u dawców
vð ocena zgodnoÅ›ci grup krwi dawcy i biorcy
vð identyfikacja grup krwi matki i pÅ‚odu w celu oceny ryzyka rozwoju choroby hemolitycznej
2. Odczyn antyglobulinowy Coombsa  bezpośredni
vð diagnostyka anemii hemolitycznej lub choroby hemolitycznej noworodków
vð diagnostyka powikÅ‚aÅ„ potransfuzyjnych
vð diagnostyka niedokrwistoÅ›ci autoimmunohemolitycznej
3. Odczyn antyglobulinowy Coombsa - pośredni
vð diagnostyka konfliktu serologicznego
vð wykrywanie przeciwciaÅ‚ niekompletnych u dawców i biorców krwi
Ćwiczenie 4. Techniki immunoenzymatyczne - test ELISA. Oznaczanie antystreptolizyny
O (odczyn ASO). Odczyn wiązania dopełniacza (OWD)
Techniki immunoenzymatyczne
Metody immunoenzymatyczne polegają na znakowaniu jednego ze składników reakcji
immunologicznej (czyli antygenu bÄ…dz
przeciwciała) enzymem, który w obecności substratu
i chromogenu powoduje powstanie barwnego produktu. Barwny produkt reakcji wykrywamy
metodami kolorymetrycznymi. Do znakowania reagentów stosuje się głównie peroksydazę
chrzanową lub fosfatazę zasadową. Najczęściej stosowanym testem immunoenzymatycznym
jest test ELISA. Przy zastosowaniu tej metody możemy oceniać ilościowo, i to z bardzo dużą
czułością, stężenie przeciwciał lub antygenów w badanym materiale biologicznym. Zazwyczaj
do oceny ilości antygenu lub przeciwciała używa się nieznakowanego reagentu związanego ze
ścianą płytki, a po przeprowadzeniu inkubacji z materiałem badanym dodaje się przeciwciała
znakowane enzymem. Jeżeli przeciwciała znakowane enzymem nie zostaną związane, reakcja
barwna nie zachodzi (brak kompleksu immunologicznego).
Wersja testu ELISA wykonywana na ćwiczeniu
Kozie przeciwciała przeciwko ludzkim IgG
znakowane peroksydazÄ… chrzanowÄ…
Przeciwciała skierowane
Antygeny Helicobacter pylori
przeciwko antygenom
opłaszczone na płytce
Helicobacter pylori
Odczyn ASO
Odczyn ASO jest bardzo ważnym testem służącym do oceny poziomu przeciwciał
swoistych dla streptolizyny O. Streptolizyna O to toksyna wytwarzana przez paciorkowce beta-
hemolizujące grupy A. Toksyna ta jest enzymem o właściwościach hemolitycznych (powoduje
lizę erytrocytów). Przeciwciałem wytwarzanym w organizmie w odpowiedzi na zakażenie
paciorkowcami beta-hemolizujÄ…cymi grupy A, a konkretnie skierowanym przeciwko
streptolizynie O, jest antystreptolizyna O. Zasada oznaczania poziomu antystreptolizyny O
w surowicy oparta jest na hamowaniu zjawiska hemolizy testowych erytrocytów pod wpływem
streptolizyny O po jej ilościowym związaniu przez antystreptolizynę O. Wykonując oznaczanie
poziomu antystreptolizyny O w surowicy należy pamiętać, iż niezwykle ważny dla końcowego
wyniku jest ilościowy stosunek streptolizyny O i antystreptolizyny O. Gdy miano u dorosłych
wynosi powyżej 200 j.m (jednostek międzynarodowych), a u dzieci powyżej 333 j.m przyjmuje
się, że może to świadczyć o trwającym bądz
przebytym zakażeniu paciorkowcami. Jednostka
międzynarodowa streptolizyny O to taka jej ilość, która powoduje całkowitą hemolizę 5-
procentowej zawiesiny erytrocytów króliczych w temperaturze 37ºC w ciÄ…gu 60 minut
w objętości 0,5 mL.
Odczyn wiązania dopełniacza  OWD
Odczyn wiązania dopełniacza jest czułym testem przydatnym w ocenie obecności
w badanym materiale zarówno antygenów, jak i przeciwciał. Z reguły stosuje się go jako test
ilościowy, w którym ocenia się poziom (miano) antygenu lub przeciwciał. Zasada tej metody
opiera się na litycznych własnościach dopełniacza po jego związaniu przez kompleks
immunologiczny obecny na błonie erytrocytów (tzw. hemoliza immunologiczna). Do wykonania
testu potrzebne są: [1] zinaktywowana (pozbawiona dopełniacza) surowica badana, w której
poszukujemy przeciwciał, [2] dany antygen, [3] przeciwciała antyerytrocytarne (z reguły jest to
surowica królika uodpornionego erytrocytami barana), [4] erytrocyty barana opłaszczone
przeciwciałami antyerytrocytarnymi [5] dopełniacz (zazwyczaj jego z
ródłem jest surowica świnki
morskiej). Wykonanie testu OWD przedstawione jest schematycznie na rycinie poniżej.
Przykłady praktycznego zastosowania omawianych testów w diagnostyce klinicznej
Praktyczne zastosowanie testu ELISA
vð diagnostyka chorób bakteryjnych, wirusowych, grzybiczych i pasożytniczych poprzez
wykrywanie antygenów lub swoistych przeciwciał w materiale biologicznym
vð ocena stężenia hormonów i enzymów
vð diagnostyka chorób autoimmunizacyjnych (oznaczanie poziomu autoprzeciwciaÅ‚)
vð diagnostyka chorób nowotworowych (oznaczanie poziomu antygenów zwiÄ…zanych
z nowotworem)
Praktyczne zastosowanie ASO
vð diagnostyka trwajÄ…cych zakażeÅ„ paciorkowcami z grupy A (Streptococcus pyogenes)
vð diagnostyka powikÅ‚aÅ„ po przebytej infekcji paciorkowcami z grupy A (gorÄ…czka
reumatyczna, zapalenie kłębuszków nerkowych, zapalenie mięśnia sercowego)
Praktyczne zastosowanie OWD
vð diagnostyka chorób wirusowych i bakteryjnych (w tym diagnostyka zakażeÅ„ Mycoplasma
pneumoniae)