Beata Szymczak

Katarzyna Syka

BIAŁKA

Zajęcia:

Środa, godz. 11¹⁵-15⁰⁰

Prowadzący:

Dr Aneta Białkowska

WSTĘP

Białka stanowią znaczną część organizmu zwierzęcego, utrzymują jego kształt i zapewniają jego funkcjonowanie. Obecność ich stwierdzono we wszystkich komórkach żywych. Są składnikiem skóry, mięśni, ścięgien, nerwów i krwi, a ponadto enzymów, przeciwciał i wielu hormonów.

Białka są z chemicznego punktu widzenia polimerami wielkocząsteczkowymi, nazywane polipeptydami lub poliamidami, powstałe w wyniku reakcji kondensacji
L-α-­aminokwasów (zawierające ponad 100 reszt aminokwasowych) o bardzo dużej masie cząsteczkowej, od 10 do 1000 kDa (Dalton - umowna jednostka masy atomowej nienależąca do układu SI stosowana w chemii do oznaczania masy cząsteczkowej, gdzie 1 Da jest równy 1,66*10^-24g) . Cząsteczki białka zbudowane są z prostszych składników, aminokwasów, które są połączone wiązaniami peptydowymi tworzącymi się pomiędzy grupą α-aminową jednego aminokwasu a grupą α-karboksylową drugiego aminokwasu.

Cząsteczki białka mają określoną budowę przestrzenną. Mówi się, że łańcuch peptydowy jest w określony sposób pofałdowany. To pofałdowanie powstaje na skutek działania różnego rodzaju sił wiążących, występujących pomiędzy różnymi odcinkami łańcucha peptydowego. Można wyróżnić kilka różnych poziomów organizacji cząsteczki białkowej. Pierwszy poziom stanowi struktura pierwszorzędowa, uwarunkowana kolejnością aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Struktura drugorzędowa, to ukształtowanie łańcucha polipeptydowego w przestrzeni. Wyróżniamy tutaj typ α-helisy i β-harmonijki. Trzeci poziom organizacji cząsteczek - struktura trzeciorzędowa, to ostateczny sposób ułożenia i pofałdowania łańcucha polipeptydowego w przestrzeni, charakterystyczny dla danego rodzaju białka. Białka o cząsteczkach złożonych z dwóch lub więcej podjednostek, wykazują strukturę czwartorzędową.

Białka posiadają szereg wspólnych właściwości:

• Mają podobny skład pierwiastków: węgiel, wodór, tlen i azot, a często także siarkę i fosfor;

• Ich roztwory są hydrofilowymi układami koloidalnymi;

• Są amfoterami - w zależności od środowiska reagują jak kwas lub jak zasada;

• Pod wpływem wysokich stężeń silnych elektrolitów wypadają z roztworu - wysalanie;

• Ulegają denaturacji - zniszczeniu struktury natywnej, powodującej zanik aktywności biologicznej białka;

• Są związkami optycznie czynnymi - ich roztwory skręcają płaszczyznę światła spolaryzowanego.

Białka możemy podzielić ze względu na:

1. Strukturę chemiczną:

• proste (czyste) - w wyniku hydrolizy powstają tylko aminokwasy;

• skonfigurowane (złożone) - w wyniku hydrolizy powstają aminokwasy i inne składniki.

2. Kształt cząsteczki:

• fibrylarne - o strukturach włóknistych;

• globularne - o kształtach kulistych lub elipsoidalnych.

3. Rozpuszczalność:

• albuminy - dobrze rozpuszczalne w wodzie i rozcieńczonych roztworach soli, kwasów i zasad;

• globuliny - nierozpuszczalne w wodzie; wykazują skłonność do agregacji; do rozpuszczenia wymagają obecności niewielkiej ilości soli dobrze dysocjującej na jony (wsalanie);

• gluteiny - rozpuszczalne jedynie w rozcieńczonych roztworach kwasów lub zasad;

• prolaminy - rozpuszczalne tylko w 70% etanolu.

WYKONANIE ĆWICZENIA

Ćwiczenie ma na celu sprawdzenie rozpuszczalności albumin, globulin i glutein; zbadanie przebiegu procesu wysalania białek; udowodnienie, że mają charakter koloidalny i amfoteryczny; sprawdzenie wpływu mocnych kwasów organicznych na białka; sprawdzenie przebiegu denaturacji białka a także poznanie reakcji biuretowej, jako metody oznaczania białka.

1. Rozpuszczalność i wysalanie.

1.1. Izolowanie białek roślinnych.

Na powodzenie podczas izolowania białek z określonego materiału ma wpływ dobór odpowiedniego rozpuszczalnika.

A) Ekstrahowanie albumin i globulin.

1g mączki grochowej ekstrahuję 25ml 0,5M roztworu KCl, przez 15 min okresowo wstrząsając, następnie odwirowuję i zlewam ciecz nadosadową do dalszej analizy:

• Przeprowadzam reakcję biuretową (opis postępowania na końcu sprawozdania) w celu wykazania zawartości białka.

Roztwór białka jaja kurzego zabarwia się na fioletowo, natomiast woda na jasnobłękitny. Próbka cieczy nadosadowej także zabarwia się na fioletowo, co jednoznacznie wskazuje na obecność białka w próbce. Dzieje się tak na skutek utworzenia wiązania koordynacyjnego między dwoma wiązaniami peptydowymi, w wyniku czego uzyskujemy barwny kompleks.

• Do dwóch probówek odmierzam po 1ml ekstraktu mączki, następnie do jednej dodaję 8 ml wody, a do drugiej 8ml 0,5M roztworu KCl. Do próby, w której wystąpiło zmętnienie dodaję niewielką ilość roztworu KCl.

W probówce nr 1, do której dodałam KCl, nie nastąpiło zmętnienie, to dzięki temu, że zarówno albuminy jak i globuliny są dobrze rozpuszczalne w roztworach soli. W probówce nr 2, do której dodałam wodę, nastąpiło zmętnienie, gdyż globuliny z powodu silnego momentu dipolowego cząsteczek są nierozpuszczalne w wodzie. Po dodaniu KCl do tej probówki zmętnienie spowodowane wypadaniem nierozpuszczalnego białka zniknęło, gdyż globuliny (i albuminy) są rozpuszczalne w rozcieńczonych roztworach soli.

B) Wydzielanie glutenu.

• Z 30g mąki pszennej i wody przygotowuję twarde ciasto, które odstawiam na 30 min w celu uwodnienia i spęcznienia białka. Po upływie wyznaczonego czasu wypłukuję z ciasta skrobię, poprzez wygniatanie go pod zimną, bieżącą wodą. Otrzymaną masę o gumowatej, ciągnącej konsystencji rozpuszczam w 30ml 0,2M roztworu NaOH i przesączam, po czym sprawdzam obecność białka przy użyciu metody biuretowej.

Gluten jest rozpuszczalny w rozcieńczonych roztworach zasad, dlatego możliwe było rozpuszczenie otrzymanego gumowego ciasta przy użyciu roztworu NaOH.

Po przeprowadzeniu reakcji biuretowej pojawia się fioletowe zabarwienie, co świadczy o dodatnim odczynie reakcji, czyli wskazuje na obecność białka w próbie.

1.2. Wysalanie białek.

Wysokie stężenia soli, zależne od natury białka i pH środowiska, powodują wypadanie białek z roztworu, tzw. Wysalanie. Polega ono na dehydratacji cząsteczek białka. Stosuje się w tym celu sole, które łatwo tworzą wodziany, np. siarczan magnezu, chlorek sodu. Białka dobrze rozpuszczalne w wodzie wymagają do wysolenia wyższych stężeń soli, natomiast te słabiej rozpuszczalne wypadają z roztworu przy niższym nasyceniu solą. Wysalanie jest procesem odwracalnym.

• Do 10ml 1% roztworu białka jaja kurzego dodaję porcjami stały (NH₄)₂SO₄ aż do nasycenia roztworu soli. Osad wysolonego białka oddzielam na sączku i rozpuszczam roztworem KCl. Sprawdzam obecność białka reakcją biuretową. Do wcześniej otrzymanego przesączu dodaję 3 krople 5% CCl₃COOH.

Dodawanie stałego (NH₄)₂SO₄, który ze względu na bardzo dobrą rozpuszczalność w wodzie daje możliwość uzyskania roztworów o wysokiej mocy jonowej, powoduje niszczenie wodnej otoczki białka, obniżenie jego rozpuszczalności w wodzie, co skutkuje wypadaniem tegoż białka z roztworu - powstawanie osadu.

Po rozcieńczeniu osadu i przeprowadzeniu reakcji biuretowej otrzymuję roztwór o barwie niebiesko-fioletowej. Pokazuje to, że osadem było wysolone białko, które rozpuściło się pod wpływem rozcieńczonego roztworu soli. Przeprowadzenie reakcji biuretowej było możliwe, gdyż wysalanie jest procesem odwracalnym i nie powoduje zmian właściwości białka.

TCA wytrąca białka. Po dodaniu go do otrzymanego przesączu nie nastąpiło zmętnienie co oznacza, że białko zostało całkowicie wysolone z roztworu.

2. Białka jako koloidy.

Obecność grup hydrofilowych oraz duży rozmiar cząsteczek, roztwory białek należą do właściwych układów koloidalnych odwracalnych. Białka rozpuszczając się w wodzie tworzą wokół siebie otoczkę hydratacyjną. Wszystkie koloidy hydrofilowe charakteryzują się dużą trwałością, lepkością a także działaniem stabilizującym wobec nietrwałych koloidów hydrofobowych.

• Do dwóch probówek odmierzam po 1ml 0,01M roztworu azotanu srebra. Do probówki nr 1 dodaję 1ml 1% roztworu białka jaja kurzego a do probówki nr 2 - tę samą ilość wody. Po wymieszaniu wprowadzam do każdej probówki po 1ml chlorku sodu.

W probówce nr 1 zauważam zmętnienie - powstaje układ koloidalny. W probówce nr 2 nie obserwujemy żadnej zmiany. Dodanie do obu probówek NaCl daje efekt odwrotny - w probówce nr 1 następuje rozpuszczenie zmętnienia a w probówce nr 2 pojawia się zmętnienie. Dzieje się tak, gdyż nadmiar Cl^- powoduje wytrącenie AgCl w probówce nr 2, natomiast w probówce nr 1 następuje stabilizacja koloidu hydrofobowego (AgCl) przez koloid hydrofilowy.

3. Amfoteryczność białek.

Białka są związkami amfoterycznymi. Grupami zdolnymi do jonizacji w cząsteczkach protein są: grupa karboksylowa, aminowa hydroksylowa, tiolowa, a także pierścień imidazolowy i grupa guanidynowa, w przypadku białek złożonych dodatkowo grupa fosforanowa.

Przy pH=pI cząsteczki białka występują w postaci jonu obojnaczego, wówczas ilość grup zjonizowanych dodatnio i ujemnie jest jednakowa. Punkt izoelektryczny (pI) jest charakterystyczny dla danego białka.

A) Strącanie białek za pomocą kationów i anionów.

• Do trzech probówek odmierzam po 2ml roztworu białka jaja kurzego o odpowiednim pH: w probówce nr 1 białko o pH>pI, w próbce nr 2 białko o pH=pI, w próbce nr 3 białko o pH<pI. Do poszczególnych probówek dodaję kilka kropli odczynnika określone roztwory soli. Obserwację oznaczam w tabeli nr1 stosując oznaczenia:

+ powstał białczan

- nie pojawił się osad soli

Tabela nr1

Odczynnik	pH>pI	pH=pI	pH<pI
10% siarczan miedziowy	+	-	-
10% octan ołowiu (II)	+	-	-
10% wolframian sodowy	-	-	+

Przy pH>pI, cząsteczki białka występują w postaci polianionów i mogą reagować z kationami (Cu⁺², Pb⁺²). Kationy metali ciężkich denaturują białko i tworzą z ich anionową formą trudno rozpuszczalne, słabo dysocjujące sole.

Przy pH<pI, cząsteczki białka występują w postaci polikationów i mogą reagować z anionami. Białczany metali alkalicznych (np. Na⁺) są dobrze dysocjujące i rozpuszczalne w wodzie, dlatego trudno było zauważyć ich powstanie.

B) Wpływ kwasów organicznych na białka.

• Do trzech probówek odmierzam po 1ml 1% roztworu białka jaja kurzego a następnie dodaję po 1ml odpowiednich roztworów kwasów organicznych. Zapisując wyniki w Tabeli nr2 oznaczę intensywność strącania za pomocą znaków + i -.

Tabela nr2

Kwas	Obserwacje
6% kwas sulfosalicylowy	+
10% kwas trójchlorooctowy	+
5% kwas octowy	-

W przypadku dwóch pierwszych kwasów następuje wytrącenie jak i denaturacja białka, gdyż są to kwasy mocne (pierwszy - występuje grupa sulfonowa, drugi - zawiera 3 silnie elektroujemne chlory). Kwas octowy jest kwasem słabszym i nie powoduje wytrącenia białka.

4. Denaturacja cieplna.

Denaturacja - jest to zniszczenie struktury cząsteczki białka przez rozerwanie wiązań wodorowych i mostków disulfidowych. Denaturację mogą powodować czynniki fizyczne: ogrzewanie, ultradźwięki, promienie UV, wysokie ciśnienie; a także chemicznie: stężone roztwory kwasów lub zasad, jony metali ciężkich, detergenty, rozpuszczalniki organiczne. Zmiany denaturacyjne następują w temperaturze powyżej 40ºC. W szczególnych przypadkach (przy pH=pI) denaturacja cieplna prowadzi do koagulacji (zlepiania się) rozwiniętych łańcuchów peptydowych i takie cząsteczki denaturowanego białka są całkowicie nierozpuszczalne.

• Badam denaturację białka o różnych wartościach pH: pH>pI (probówka 1), pH=pI (probówka 2) i pH<pI (probówka 3). Próby te umieszczam na 15 min we wrzącej łaźni wodnej, następnie chłodzę i dodaję po 5ml buforu octanowego do probówek 1 i 3.

W probówce 1 zauważamy zmętnienie - nastąpiła denaturacja białka. W probówce 2 wyraźnie widać, że zaszła koagulacja - białko zostało wytrącone (wytrącił się gęsty, biały osad). W probówce 3 nie powstało zmętnienie, należy jednak pamiętać, że denaturacja nie zawsze oznacza wypadanie białka z roztworu.

Do probówek 1 i 3 dodaję buforu octanowego o pH=4,7 aby doprowadzić pH w probówkach do pH równego ich punktowi izoelektrycznemu. Można zaobserwować intensywniejsze wytrącenie białka w obu probówkach.

5. Reakcja biuretowa.

Należy ona do bezpośrednich metod oznaczania białka. Jest jedną z najczęściej stosowanych metod w analizie białek. W tym ćwiczeniu została wykorzystana do stwierdzenia obecności białka w ekstrakcie mączki grochowej, w preparacie glutenu a także w roztworze wysolonego białka.

• Do 2ml badanego roztworu białka należy dodać taką samą objętość 10% roztworu NaOH oraz kilka kropli 05% (1%) roztworu CuSO₄. Równolegle wykonuje się próbę zerową, która zamiast roztworu białka zawiera wodę.

Pojawienie się niebiesko-fioletowego zabarwienia w próbie z białkiem stanowi o dodatnim odczynie reakcji.

WNIOSKI:

• Na powodzenie podczas izolowania białek z określonego materiału ma wpływ dobór odpowiedniego rozpuszczalnika.

• Białka ulegają wysalaniu, które jest procesem odwracalnym i nie powoduje zmian rodzimych właściwości białek.

• Białka tworzą roztwory koloidalne.

• Białka mają charakter amfoteryczny. W punkcie izoelektrycznym występują w postaci jonów obojnaczych, w pH niższym od punktu izoelektrycznego występują w postaci polikationów natomiast w środowisku o pH wyższym od pH punktu izoelektrycznego, jako polianiony.

• Pod wpływem różnych czynników chemicznych i fizycznych białka ulegają denaturacji, która trwale niszczy ich strukturę i powoduje zatracenie właściwości fizykochemicznych oraz utraty ich naturalnej biologicznej funkcji.

1

---