Praca magisterska Sonia Fraenzel mikrobiologia 2016

Kierunek: Mikrobiologia

Specjalność: Mikrobiologia medyczna i diagnostyka

laboratoryjna

Sonia Fraenzel

Nr albumu: 351476

Izolacja bakterii fermentacji mlekowej z kiszonek

i charakterystyka ich właściwości

antybakteryjnych

Isolation of lactic acid bacteria from pickled

vegetables and characteristics of their anti-

bacterial properties

Praca magisterska

wykonana w Zakładzie Immunobiologii Bakterii

Instytutu Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii

pod kierunkiem i opieką dr hab. Agnieszki Torzewskiej

Łódź, 2016

Spis treści

I. Wstęp ............................................................................................................................. 3

II. Cel pracy ................................................................................................................... 10

III. Materiały i metody .................................................................................................. 11

III.1. Materiał ............................................................................................................... 11

III.1.1 Soki z kiszonych ogórków i kapusty ............................................................. 11

III.1.2 Szczepy bakteryjne ........................................................................................ 11

III.2. Metody ............................................................................................................... 11

III.2.1.Izolacja bakterii ............................................................................................. 11

III.2.2. Sprawdzenie przynależności szczepów do rodzaju Lactobacillus. .............. 11

III.2.3. Określenie właściwości antybakteryjnych mieszanych hodowli bakterii w
kiszonkach. ............................................................................................................... 12

III.2.4. Określenie właściwości antybakteryjnych szczepów Lactobacillus. ........... 13

III.2.5. Określenie zdolności do wytwarzania nadtlenku wodoru przez szczepy
Lactobacillus. ........................................................................................................... 14

IV. Wyniki ...................................................................................................................... 15

IV.1. Obecność Lactobacillus sp. w soku z kiszonek. ................................................ 15

IV.2. Identyfikacja szczepów pod kątem przynależności do rodzaju Lactobacillus. .. 17

IV.3. Działanie antybakteryjne bakterii w sokach. ...................................................... 17

IV.4. Działanie antybakteryjne wybranych szczepów Lactobacillus sp. .................... 19

IV.5.Wytwarzanie wody utlenionej przez wybrane szczepy Lactobacillus sp. ........... 21

IV.6. Charakterystyka właściwości antybakteryjnych wybranych szczepów
Lactobacillus. ............................................................................................................... 22

V. Dyskusja .................................................................................................................... 26

IV. Wnioski .................................................................................................................... 29

IV. Streszczenie .............................................................................................................. 30

VII. Literatura ............................................................................................................... 32

I. Wstęp

Na przestrzeni ostatnich lat coraz większym problemem stają się nawracające

infekcje układu moczowego zwłaszcza u kobiet i pacjentów cewnikowanych.

Najczęstszymi patogenami atakującymi kobiety są: Escherichia coli (nawet do 80 %

przypadków), Staphylococcus, Klebsiella, Enterobacter, Enterococcus. Dotykają one

kobiety aktywne seksualnie, a także w okresie menopauzy, gdzie patogeny obecne w

pochwie dostają się do cewki moczowej, następnie wędrują wyżej i powodują zakażenie.

Nawracające infekcje dotykają ok. 20- 30% kobiet, z czego większość wymaga leczenia

antybiotykami. Kolejną grupą narażoną na zakażenia układu moczowego są pacjenci

cewnikowani. Bakterie patogenne, najczęściej Proteus mirabilis są zdolne do tworzenia

na ich powierzchni biofilmu, z którego bakterie dostają się do układu moczowego.

Antybiotyki jak do tej pory są jedynym skutecznym sposobem leczenia pacjentów z

zakażeniami urologicznymi, ale coraz częściej bakterie nabywają antybiotykoodporności.

Obiecującą, ale nadal słabo zbadaną alternatywą dla antybiotyków mogłyby stać się

probiotyki. Te zaakceptowane przez WHO (World Health Organisation) i FAO (Food

and Agriculture Organization of the United Nations) bakterie bezpieczne dla zdrowia

człowieka mogły by stać się „lekarstwem” oraz środkiem zapobiegającym infekcjom

układu moczowego (Fraga i in. 2005, Dineshkumar i in. 2013, Borchert i in. 2008).

Probiotyki (pro bios – dla życia) to organizmy żywe, które mają korzystny wpływ

na zdrowie ludzi, po podaniu ich w odpowiedniej dawce (Mojka 2014, Kuśmierska, Fol

2014). Po raz pierwszy termin probiotyki został użyty w 1965 roku przez Lilly i Stilwell.

Organizmy te zostały uznane jako gatunki bezpieczne dla człowieka i zwierząt (GRAS),

oraz dopuszczone do stosowania przed FDA (Food and Drug Administration) oraz Unię

Europejską. Zaakceptowano je jako żywność funkcjonalną, czyli żywność, która ma

korzystny wpływ na funkcjonowanie organizmu ponad efekt odżywczy. Poprawiają stan

zdrowia oraz samopoczucia, a także zmniejszają ryzyko chorób. Żywność funkcjonalna

musi mieć podobną postać jak żywność konwencjonalna, a także mieć korzystne

działanie na organizm w ilościach normalnie przyjmowanych z dietą. Nie są to jednak

tabletki, kapsułki ani krople, tylko składnik prawidłowej diety (Functional Food Science

in Europe). Produkt jest uznawany za probiotyczny, jeśli zawiera co najmniej 10

aktywnych komórek bakteryjnych w mililitrze produktu (Mojka 2014).

Kryteria jakie musi spełniać organizm probiotyczny to: pochodzenie od

człowieka, odporność na niskie pH żołądka oraz działanie enzymów i kwasów

żółciowych w dwunastnicy, zdolność do przeżycia i aktywności metabolicznej w

środowisku jelita grubego, zdolność adherencji do komórek nabłonka jelitowego i trwałej

lub przejściowej kolonizacji przewodu pokarmowego, musi być bezpieczny dla

człowieka, działać korzystnie na organizm gospodarza oraz być trwały i żywotny w

czasie przechowywania oraz w środowisku niekorzystnym (Banan-Mwine Daliri, Lee

2015).

Do probiotyków należą nieliczne bakterie mlekowe, które są ziarniakami,

pałeczkami bądź laseczkami, barwiące się Gram- dodatnio. Nie posiadają katalazy, ale

produkują dysmutazę nadtlenkową. Są to bakterie homo- i heretofermentatywne,

fermentują glukozę do kwasu mlekowego, etanolu i dwutlenku węgla. Wzrastają w

warunkach beztlenowych, tolerują jednak niewielkie stężenie tlenu w otoczeniu

(Gajewska, Błaszczyk 2012). Stosowane są głównie w dolegliwościach układu

pokarmowego, jak biegunka, biegunka poantybiotykowa, alergie pokarmowe u dzieci.

W ostatnich latach bada się także ich pozytywne znaczenie w leczeniu biegunki

podróżnych, stanach zapalnych jelita grubego i płuc, próchnicy zębów, zespołu jelita

drażliwego, cukrzycy, reumatoidalnego zapalenia stawów, a także infekcji układu

moczowego (Goldin, Gorbach 2008). Prowadzone są także badania nad

immunomodulacją i immunostymulacją w celu leczenia raka m.in. pęcherza (Fraga i in.

2005).

Do bakterii probiotycznych należą bakterie fermentacji mlekowej z rodzaju

Lactobacillus, które znaleźć można w produktach fermentacji mleka, warzyw, mięsa,

kiszonkach oraz w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt (Buda i in. 2013, Mojka

2014).

Lactobacillus to Gram- dodatnie pałeczki, bardzo zróżnicowane morfologicznie,

w zależności od gatunku przyjmują kształty długich lub krótszych pałeczek o wymiarach

0,5-1,2 x 1-10 µm (Słońska, Klimuszko 2010). Mogą być proste lub wygięte, a także

wąskie lub grube. Na ich morfologię ma wpływ podłoże oraz wiek hodowli (Słońska,

Klimuszko 2010, Buda i in. 2013).

Najlepszym podłożem wzrostowym dla tych bakterii jest MRS agar (de Man,

Rogosa and Sharpe agar). Można je podzielić na gatunki mezofilne, których optymalna

temperatura wzrostu wynosi 20- 28°C oraz termofilne (37- 45°C). Optymalne pH wzrostu

tych bakterii jest dość niskie i wynosi 5,5- 6,2. Ich wzrost obserwuje się w postaci

niewielkich (2-5 mm), gładkich i śliskich kolonii. Inną formą wzrostu są matowe,

kremowe, bądź bezbarwne kolonie (Mojka 2014, Buda i in. 2013).

U człowieka zdrowego Lactobacillus występuje w jamie ustnej, jelicie krętym,

okrężnicy oraz są dominujące wśród bakterii występujących w pochwie. Za probiotyczne

uważane są gatunki: L. acidophilus, L. amylovorans, L. cassei, L. crispatus, L. delbruecki

subsp. bulgaricus, L. gallinarum, L. gassei, L. johnsonii, L. paracasei, L. plantarum, L.

reuteri, L. rhamnosus (Gajewska, Błaszczyk 2012).

Bakterie z rodzaju Lactobacillus wykazują działanie antybakteryjne, ponieważ są

zdolne do produkcji substancji o działaniu antybakteryjnym, m.in. bakteriocyn,

biosurfaktantów i białek wiążących kolagen, które zapobiegają adhezji patogenów do

komórek, także kwasy organiczne oraz nadtlenek wodoru, które hamują wzrost i są

toksyczne dla flory patogennej (Słońska, Klimuszko 2010). Dzięki komunikacji i

sygnalizacji

międzykomórkowej

mogą

działać

immunomodulująco

immunostymulująco, uruchamiając szlaki oraz cząsteczki sygnałowe komórek

organizmu człowieka (Kuśmierska, Fol 2014).

Ze względu na rodzaj przeprowadzanej fermentacji można podzielić bakterie z

rodzaju Lactobacillus na obligatoryjnie homofermentatywne, które fermentują glukozę

do kwasu mlekowego za pomocą szlaku EMP (szlak Embdena-Meyerhofa-Parnasa), nie

degradują pentozy oraz glukonianu. Fakultatywne homofermentatywne rozkładają

heksozy do kwasu mlekowego oraz degradują pentozy i w pewnej części glukonian.

Obligatoryjnie heterofermentatywne rozkładają heksozy i pentozy z wydzieleniem CO

(Gajewska, Błaszczyk 2012). W wyniku fermentacji produkują od 0,6% do 3,0% kwasu

mlekowego. Wytwarzają kwas L(+) mlekowy rozkładany przez człowieka, oraz kwas

D(-) mlekowy. Działanie antybakteryjne tych kwasów polega na neutralizacji potencjału

elektrochemicznego

membrany

komórkowej

zniszczenia

białek

wewnątrzkomórkowych bakterii patogennych. Kwasy organiczne gwałtownie obniżają

pH w środowisku, powoduje to hamowanie aktywności biochemicznej bakterii przez

niezdysocjowane cząsteczki kwasu (Mojka 2013, Słońska, Klimuszko 2010).

Charakteryzując budowę komórki Lactobacillus należy wspomnieć, że ściana

komórkowa bakterii Gram - dodatnich złożona jest głównie z peptydoglikanu, kwasów

tejchojowych i lipotejchojowych, białek oraz polisacharydów. Mureina (peptydoglikan)

tworzy sieć i buduje wewnętrzną warstwę ściany komórkowej. Jest to substancja sztywna

i wytrzymała na rozciąganie. Kwasy tejchojowe budują różne struktury połączone

kowalencyjnie z mureiną ściany komórkowej, najczęściej fosforany polioli lub polimery

fosforanów glikozydowanych polioli. Natomiast kwasy lipotejchojowe to struktury

zanurzone w membranie poprzez fragment lipidowy. Mają one właściwości silnie

polielektronowe, dlatego, że posiadają silnie kwasowe grupy fosforanowe. W skład

ściany komórkowej Lactobacillus wchodzą również egozpolisacharydy (EPS), które

mają pH kwaśne lub neutralne. Mogą być one połączone ze ścianą w sposób

kowalencyjny lub niekowalencyjny, a także wydzielane do środowiska zewnętrznego,

decydują one o właściwościach ochronnych: zabezpieczają przed utratą wody,

fagocytozą, atakiem fagów czy pierwotniaków, antybiotykami, toksynami oraz stresem

osmotycznym (Buda i in. 2013 Gajewska, Błaszczyk 2012).

Na powierzchni ściany komórkowej Lactobacillus znajduje się wiele rodzajów

białek zależnych od sortazy. Białkami wydzielanymi na zewnątrz są bakteriocyny, które

są białkami działającymi bójczo lub bakteriostatycznie. Są to niskocząsteczkowe związki

chemiczne, które zbudowane są z prostych peptydów lub kompleksów polipeptydów.

Wykazują one zdolności antybakteryjne, lecz bakterie które je wydzielają są odporne na

wytwarzaną przez siebie bakteriocynę, ponieważ kodują białka blokujące aktywność

bakteriocyny. Większość badań dotyczących bakteriocyn poświęconych było szczepom,

które stosuje się do produkcji żywności. Jednym ze zbadanych szczepów był

L. acidophilus, gdzie wśród 52 zbadanych szczepów aż 63% posiadało cechę produkcji

bakteriocyn. Ich produkcja jest uzależniona od warunków środowiskowych, takich jak

pH, temperatura czy skład podłoża (Buda 2013, Słońska, Klimuszko 2010).

Bakteriocyny zostały podzielone na następujące klasy: lantybiotyki, bakteriocyny

nielantybiotykowe, bakteriocyny o dużej masie cząsteczkowej, bakteriocyny

wymagające do działania pewnych substancji. Klasy te zostały podzielone na liczne

podklasy. Lantybiotyki są to termostabilne bakteriocyny o niskiej masie cząsteczkowej.

W ich skład wchodzi lantonina lub 3- metylolantonina. Wyróżnia się typ A i B tych

bakteriocyn, które różnią się budową, mogą być liniowe i cykliczne. Bakteriocyny

nielantybiotykowe nie posiadające w swoim składzie lantoniny, są termostabilne i mają

dość niską masę cząsteczkową. Zostały podzielone na trzy podklasy: pedicynopodobne,

dipeptydowe oraz wydzielane na drodze sekrecji typu Sec. Bakteriocyny klasy trzeciej,

mają duże rozmiary i są termolabilne, produkowane są głównie przez bakterie z rodzaju

Lactobacillus. Klasa czwarta obejmuje białka, które do pełni aktywności potrzebują

obecności części lipidowej lub węglowodanowej. Bakteriocyny mogą działać na

wrażliwe komórki w sposób bakteriobójczy lub bakteriostatyczny. Ich mechanizm polega

na destabilizacji błony cytoplazmatycznej, wytworzenie w niej kompleksów poracyjnych

i następnie kanałów jonowych. Biernie wydostają się wtedy z komórki jony potasu,

magnezu, fosforu, aminokwasy i ATP. Prowadzi to do zachwiania pracy pompy

protonowej, potencjału membranowego oraz gradientu pH. Zahamowana zostaje synteza

DNA, RNA i białek, co powoduje zmniejszenie produkcji składników odżywczych i w

efekcie śmierć komórki bakterii. Drugi sposób działania bakteriocyn to zdolność do

wywołania lizy komórki. W tym wypadku bakteriocyna wchodzi w interakcje z kwasami,

które są składnikami ściany komórkowej bakterii wrażliwych. W wyniku tej reakcji

uwalniają się i aktywują związane z nimi enzymy autolityczne, które doprowadzają do

autolizy komórki. Niektóre bakteriocyny mogą zakłócać biosyntezę ściany komórkowej,

przy czym nie zaburzają biosyntezy materiału genetycznego, ani białek (Słońska,

Klimuszko 2010).

Bakteriocyny z reguły działają najsilniej na szczepy blisko spokrewnione ze

szczepem, który je wytwarza. Ze względu na zakres ich działania można je jednak

podzielić na: bakteriocyny o wąskim, umiarkowanym i szerokim spektrum działania.

Pierwsze z wymienionych działają na szczepy tego samego gatunku, drugie działają na

inne bakterie niż produkująca bakteriocyny. Bakteriocyny o szerokim spektrum działania,

wykazują działanie bójcze na bakterie Gram- dodatnie, Gram- ujemne oraz hamują

tworzenie przetrwalników i form wegetatywnych bakterii (Słońska, Klimuszko 2010).

Kolejnymi białkami, które występują na powierzchni komórek Lactobacillus są

adhezyny bakteryjne, które mają za zadanie adhezję do błony śluzowej jelita. Tą samą

funkcję pełnią także w układzie moczowym. Zidentyfikowaną w ciągu ostatnich lat

adhezyną bakterii z rodzaju Lactobacillus jest dehydrogenaza aldehydu 3-

fosfoglicerynowego (GAPDH), która została wykryta u L. plantarum oraz L. crispatus.

Adhezyna ta nie posiada sekwencji syganałowej N- końcowej ani motywów

pozwalających na wydzielanie białka z komórki. GAPDH rozpoznaje antygeny grup krwi

A i B oraz ma zdolność adhezji do błony śluzowej jelita. Kolejną adhezyną jest

oligomeryczne białko zwane mucin adhesion-promoting protein (MAPP), wykryte na

powierzchni L. fermentum. Mechanizm działania tego białka polega najprawdopodobniej

na niekowalencyjnym wiązaniu jego łańcuchów polipeptydowych lub jednostek

białkowych z powierzchnią bakterii. Kolejną adhezyną jest czynnik elongacji Tu, który

występuje u L. johnsoni. Przypuszcza się, że czynnik ten ma zdolności adherencji do

komórek nabłonkowych jelita oraz do białek błony śluzowej. Indukuje on także

odpowiedź immunologiczną. Do adhezyn należy także α- enolaza (Eno A1), znajdująca

się na powierzchni L. plantarum, wykazuje duże powinowactwo do plazminogenu oraz

ma zdolność wiązania fibronektyny. Białkiem o dużej masie cząsteczkowej, które

występuje na powierzchni bakterii i bierze udział w adhezji do nabłonka jest także białko

Mub, które zlokalizowane zostało u L. reuteri. U L. rhamnosus GG wykazano obecność

białek piliny, które zbudowane są z połączonych kowalencyjnie polimerów (Tripathi i in.

2012, Kang, Baker 2012).

Kolejnym czynnikiem antybakteryjnym występującym u bakterii z rodzaju

Lactobacillus jest warstwa S, której cechą jest budowa krystaliczna i dwuwymiarowość.

Wykazano jej obecność u takich szczepów jak: L. helveticus, L. brevis, L acidophilus, L.

crispatus, L. amylovorus, L. gallinarum, L. gasseri i L. johnsonii. Zbudowana jest

głównie z glikoprotein o małej masie cząsteczkowej. Ich cechą charakterystyczną jest

wysoki punkt izoelektryczny (pI 9,35- 10,40), który nadaje im charakter silnie zasadowy,

w przeciwieństwie do innych mikroorganizmów, gdzie jest słabo kwaśny.

Przeprowadzone obserwacje świadczą o obecności dwóch regionów strukturalnych i

funkcjonalnych, które odpowiadają za przytwierdzenie białka do ściany komórkowej oraz

za utrzymanie jego struktury na powierzchni (Buda i in. 2013).

Z powierzchni L. johnsonii i L. gasserii wyizolowano białka, będące czynnikami

ułatwiającymi agregację (APF), natomiast u L. reuterii białko mające zdolność do

wiązania się ze składnikami śluzu jelitowego. Wykazano również, że białka warstwy S

mają zdolność do wiązania toksycznych jonów metali, takich jak ołów czy kadm. Białka

powierzchniowe mają zdolność do hamowania inwazji patogenów, zostało to

potwierdzone w badaniach, w których szczep probiotyczny był wcześniej inkubowany ze

szczepem patogennym, agregował z nim i później hamował in vitro jego adhezję i atak

na komórki ludzkie (Buda i in. 2013).

Właściwości antybakteryjne probiotyków z rodzaju Lactobacillus warunkuje

także produkowany przez nie nadtlenek wodoru, który hamuje rozwój i zabija te bakterie,

które nie wytwarzają enzymów: katalazy i peroksydazy (Słońska, Klimuszko 2010).

Do właściwości antybakteryjnych probiotyków można zaliczyć ich interakcje z

układem odpornościowym człowieka. Kilka szczepów z rodzaju Lactobacillus, ich

elementy budowy oraz produkowane metabolity mogą zwiększać produkcję IgA,

uruchamiać szlak cytokin przeciwzapalnych, które interferują z molekułami

prozapalnymi (Banan- Mwine Daliri, Lee 2015, Hoesl, Altwein 2005). Właściwości

immunostymulujące mają m.in. szczepy L. plantarum , L. acidophilus, L. reuteri i L.

rhamnosus (Banan- Mwine Daliari, Lee 2015, Kuśmierska, Fol 2014). Dzięki działaniu

probiotyków możliwe jest prawidłowe działanie i różnicowanie się populacji

podstawowych komórek układu odpornościowego, takich jak: makrofagi, limfocyty T i

B, komórki dendrytyczne. Również szlaki sygnałowe, w przebiegu których biorą udział

m.in. jądrowy czynnik transkrypcyjny NF- ĸB, kinazy MAPK, PPAR-γ są modulowane

przez probiotyki. Probiotyki mają także zdolność do modyfikowania wydzielania cytokin

takich jak IFN- γ i IL-12 (Kuśmierska i Fol 2014).

W leczeniu chorych na zakażenia układu moczowego stosuje się antybiotyki,

które są przyczyną wielu negatywnych skutków ubocznych, m. in nabywanie

antybiotykooporności przez bakterie patogenne. Wprowadza się probiotyki do diety

pacjentów oraz kobiet jako środki zapobiegawcze przeciwko zakażeniom. Jednak

leczenie probiotykami nadal jest w fazie badań. Powstało wiele prac poświęconych

działaniu skumulowanemu dwóch lub kilku laboratoryjnych szczepów bakterii

probiotycznych z rodzaju Lactobacillus przeciwko bakteriom patogennym. Na dzień

dzisiejszy klinicznie udowodniono, że szczepy: L. rhamnosus GR-1 w połączeniu z L.

reuteri lub L. fermentum mogą zmniejszyć nawroty infekcji oraz wspomagają

odbudowanie flory bakteryjnej. Niewielka natomiast jest liczba prac poświęconych

działaniu antybakteryjnemu pojedynczych szczepów występujących naturalnie w

środowisku, m.in. w kiszonkach.

II. Cel pracy

Celem pracy było wyizolowanie szczepów Lactobacillus z kiszonek o szerokim

zakresie działania przeciwbakteryjnego.

Cel ten realizowano poprzez następujące etapy pracy:

 Izolacja i identyfikacja szczepów z rodzaju Lactobacillus z kiszonek.

 Wyodrębnienie szczepów o właściwościach antybakteryjnych.

 Charakterystyka

właściwości

przeciwdrobnoustrojowych

szczepów

Lactobacillus.

III. Materiały i metody

III.1. Materiał

III.1.1 Soki z kiszonych ogórków i kapusty

W pracy analizowano właściwości bakterii obecnych w sokach z kiszonek. Materiałem

do badań były soki z kapusty kiszonej (sok nr 1,2), soki z ogórków kiszonych (sok nr 3-

27) dostępne na różnych bazarach w mieście Łodzi. Pobrano je z drewnianej lub

plastikowej beczki do kiszenia za pomocą jałowego pojemnika.

III.1.2 Szczepy bakteryjne

Do sprawdzenia właściwości antybakteryjnych bakterii z kiszonek wybrano szczep

typowy Escherichia coli ATTC 25922 oraz szczepy bakterii klinicznych z kolekcji

Zakładu Immunobiologii Bakterii: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,

Klebsiella pneumoniae , Proteus mirabilis, Providencia stuartii, izolowane z biofilmu na

cewnikach urologicznych pobranych od pacjentow długotrwale cewnikowanych.

III.2. Metody

III.2.1.Izolacja bakterii

Po pobraniu prób w pierwszej kolejności mierzono pH soków za pomocą pH

metru (Elmetron). Następnie wykonano szereg rozcieńczeń soku w postępie

arytmetycznym (od 10

-1

do 10

-6

) w probówkach typu eppendorf dodając 100 µl soku do

900 µl 0.9% NaCl. Kolejne rozcieńczenia, zaczynając od 10

-3

do 10

-6

posiewano

głaszczką na płytki MRS (podłoże de Man, Rogosa i Sharpe, BTL) w dwóch

powtórzeniach w ilości 100 µl. Inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 37°C.

Liczbę bakterii określano jako CFU/ml (jednostka tworząca kolonię ang. colony- forming

unit) i wyliczono zgodnie ze wzorem:

CFU/ml = liczba kolonii * rozcieńczenie * 10

Następnie z płytek, na których kolonie były najlepiej rozizolowane pobierano za pomocą

ezy kolonie o różnych morfologiach i posiewano na skosy MRS w probówkach typu

eppendorf. Próby opisano jako: S nr soku K numer kolonii. Inkubowano je 48 godzin w

temperaturze 37°C i później przechowywano w lodówce, aby mogły być na świeżo

przesiewane do dalszych doświadczeń.

III.2.2. Sprawdzenie przynależności szczepów do rodzaju Lactobacillus.

W pierwszej kolejności określano zdolność wytwarzania katalazy przez

wyizolowane szczepy. Na odtłuszczone szkiełko podstawowe naniesionio kroplę 3 %

nadtlenku wodoru, pobrano ezą niewielką ilość bakterii z linii posiewu na skosie i

zanurzono w kropli nadtlenku wodoru. W przypadku braku pienienia, uznawano szczep

za katalazo- ujemny i wykonywano z niego preparat. W tym celu na odtłuszczone

szkiełko podstawowe nanoszono za pomocą ezy kroplę 0,9% NaCl, pobrano ezą szczep

ze skosu i rozmazano w kropli. Pozostawiono do wysuszenia. Następnie utrwalone

preparaty barwiono metodą Grama.

Preparaty oglądano pod mikroskopem świetlnym (NIKON) w 1000- krotnym

powiększeniu z olejkiem imersyjnym. Do dalszych badań zakwalifikowano te szczepy,

które odpowiadały morfologii Lactobacillus (pałeczki, Gram- dodatnie).

Podjęto również próbę zaklasyfikowania ich do rodzaju Lactobacillus sp.. W tym celu

sprawdzono fermentację glukozy na podłożu z glukozą, rozkład eskuliny, dihydrolazę

argininy na podłożu z argininą. Szczepy zostały sprawdzone na typowych podłożach

diagnostycznych, przy czym sporządzano je na bazie podłoża MRS. Posiane podłoża

inkubowano do 7 dni w temperaturze 37°C.

III.2.3. Określenie właściwości antybakteryjnych mieszanych hodowli bakterii w

kiszonkach.

Z każdego soku pobrano 200 µl i wysiano na podłoże MRS w probówkach

bakteriologicznych (8 ml). Po 48 godzinach inkubacji w 37°C pobrano szklaną pipetą

1,8 ml hodowli do probówki typu eppendorf (o pojemności 2 ml). Odwirowano 8000 g/15

minut. Następnie odciągnięto supernatant do jałowego eppendorfa o pojemności 2 ml.

Przy pomocy pasków (McolorpHast

MERCK) zmierzono pH supernatantów, w

przypadku zbyt kwaśnego pH ustalano je do 6,0 używając 2 M NaOH. Następnie

supernatanty zostały przesączone przez filtry antybakteryjne o średnicy porów 0,2 µm

(Sartorius).

Właściwości antybakteryjne badano w stosunku do szczepów: Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonie, Escherichia coli, Proteus mirabilis,

Providencia stuarti. Bakterie przed doświadczeniem posiewano na podłoże TSB (tryptic

soy broth, BTL) i inkubowano 24 godziny w temperaturze 37°C. Następnie rozcieńczono

je 1000 razy w podłożu TSB.

Supernatanty dodawano w ilości 100 µl na płytkę 96- dołkową typu V nierozcieńczone i

dwukrotnie rozcieńczone w podłożu TSB. Do wszystkich dołków dodawano 5 µl

zawiesiny bakterii. Kontrolę wzrostu bakterii wykonano dodając do 100 µl TSB 5 µl

zawiesiny bakterii. Natomiast kontrolę jałowości podłoża stanowiło 100 µl podłoża TSB.

Płytkę inkubowano przez 24 godziny w komorze wilgotnej w temperaturze 37°C.

Obecność drobnoustrojów działających antybakteryjnie w danym soku wykazano, gdy

zaobserwowano brak wzrostu bakterii.

III.2.4. Określenie właściwości antybakteryjnych szczepów Lactobacillus.

Szczepy ze skosów MRS przesiano ezą na płynny MRS (8 ml) i inkubowano w

eksykatorze 48 godzin w 37°C. Następnie pobrano szklaną pipetą 2 ml hodowli do

probówki typu eppendorf. Odwirowano 12 000 g przez 20 minut w temperaturze

pokojowej. Supernatant przeniesiono do drugiej probówki typu eppendorf (2 ml) i

ustalono pH do 6,0 przy użyciu 2 M NaOH, pH sprawdzano papierkami do mierzenia pH

(McolorpHast

MERCK).

Badano właściwości antybakteryjne supernatantów pohodowlanych przygotowanych w

nastepujący sposób:

 bez ustalonego pH, gdzie przygotowanie supernatantów zakończono na

odwirowaniu i odciągnięciu supernatantu,

 nieprzesączone, gdzie odciągnięto supernatant i ustalono pH do 6,0,

 ogrzewane, gdzie odciągnięto supernatant, następnie ustalono pH 6,0 i ogrzewano

przez 20 minut w 90°C,

 przesączone, gdzie odciągnięto supernatant, ustalono pH 6,0 i przesączono przez

filtry antybakteryjne o średnicy porów 0,2 µm (Sartorius),

 poddane działaniu peroksydazy, gdzie odciągnięto supernatant, ustalono pH 6,0,

ogrzewano przez 20 minut w temperaturze 90°C i dodano 20 µl peroksydazy z

roztworu wodnego o stężeniu 20 mg/ml (peroxidase type VI from Horse radisch

SIGMA) w celu dezaktywacji nadtlenku wodoru. Inkubowano w 4°C/ noc.

Właściwości antybakteryjne tak przygotowanych supernatantów sprawdzono jak

wcześniej opisano w podrozdziale III.2.3. Płytkę inkubowano przez 24 godziny w

komorze wilgotnej w temperaturze 37°C.

III.2.5. Określenie zdolności do wytwarzania nadtlenku wodoru przez szczepy

Lactobacillus.

Wybrane szczepy zostały przesiane z hodowli na świeże podłoże MRS (8 ml).

Inkubowano je w warunkach beztlenowych (w eksykatorze) przez 24 godziny w 37°C.

Pobrano 2 ml hodowli do jałowej probówki typu eppendorf i odwirowano 10 000 g przez

5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odciągnięto supernatant, a osad

zawieszono w 2 ml buforu fosforanowego (pH 6,5) Tak przygotowane próby inkubowano

w temperaturze 5°C przez 48 godzin. Po czasie 1 godziny, 24 godzin i w 48 godzinie

pobrano do probówek typu eppendorf 0,5 ml zawiesiny i dodano po 10 µl ABTS

(2,2’Azino-bis(3-ethylbeznthiazoline-6-sulfonic acid – SIGMA, z roztworu 25 mg/ml w

0,1 M cytrynianie sodu o pH 4,5) i 10 µl peroksydazy (1 mg/ml peroxidase type VI from

Horseradisch SIGMA). Inkubowano przez 45 minut w temperaturze 37°C. Po tym czasie

odwirowano 10 000g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i nanoszono w dwóch

powtórzeniach (200 µl) na płytkę 96- dołkową płaskodenną razem z kontrolą, którą

stanowiło 0,5 ml buforu fosforanowego, 10 µl barwnika ABTS (2,2’Azino-bis(3-

ethylbeznthiazoline-6-sulfonic acid – SIGMA, z roztworu 25 mg/ml 0,1 M cytrynianu

sodu o pH 4,5) i 10 µl peroksydazy (1 mg/ml, peroxidase type VI from Horseradisch

SIGMA). Mierzono absorbancję przy długości fali 405 nm.

IV. Wyniki

IV.1. Obecność Lactobacillus sp. w soku z kiszonek.

W pobranych do badań sokach poszukiwano drobnoustrojów fermentacji mlekowej z

rodzaju Lactobacillus. O zachodzącej fermentacji może świadczyć niskie pH, dlatego w

pierwszej kolejności zmierzono pH soków. Następnie określono ogólną liczbę bakterii

fermentacji mlekowej jako CFU/ml posiewając soki na podłoże MRS oraz sprawdzono

morfologię ich komórek i barwliwość w metodzie Grama. Wyniki zebrano w Tabeli 1.

Tabela 1. Ocena pH i charakterystyka mikroflory soków.

Nr soku

CFU/ml ± SEM

Charakterystyka preparatów

3,8

7,7 x 10

± 3,23

Gram- dodatnie, krótkie i długie pałeczki

3,28

0,63 x 10

± 0,25 Gram- dodatnie, krótkie, średnie pałeczki, ziarniaki

3,25

0,1 x 10

± 0,04

Gram- dodatnie, średnie i długie pałeczki, ziarniaki.

3,23

1,02 x 10

± 0,34 Gram- dodatnie, krótkie, średnie i długie pałeczki, drożdże

3,32

0,03 x 10

± 0,01 Gram- dodatnie, krótkie, długie pałeczki, ziarniaki

3,42

0,36 x 10

± 0,06 Gram- dodatnie, krótkie, długie pałeczki, ziarniaki.

3,45

3,55 x 10

± 0,25 Gram- dodatnie, krótkie, średnie pałeczki, ziarniaki

3,31

2,82 x 10

± 0,49 Gram- dodatnie, krótkie pałeczki, ziarniaki.

3,4

1,43 x 10

± 0,14 Gram- dodatnie, krótkie pałeczki, ziarniaki.

3,3

1,63 x 10

± 0,11 Gram- dodatnie, krótkie, średnie pałeczki.

3,45

6,3 x 10

± 1,85

Gram- dodatnie, średnie i długie pałeczki, ziarniaki.

3,41

3,96 x 10

± 0,78 Gram- dodatnie, krótkie i średnie pałeczki, ziarniaki.

3,65

1,81 x 10

± 0,19 Gram- dodatnie, średnie i długie pałeczki.

3,4

5,55 x 10

± 0,89 Gram- dodatnie, krótkie, średnie pałeczki, ziarniaki.

3,51

9,13 x 10

± 1,3

Gram- dodatnie, pałeczki, ziarniaki.

3,34

1,18 x 10

± 0,17 Gram- dodatnie pałeczki, ziarniaki.

3,46

0,61 x 10

± 0,19 Gram- dodatnie, pałeczki.

3,5

11,08 x 10

± 0,78 Gram- dodatnie, pałeczki, ziarniaki.

3,77 27,93 x 10

± 2,03 Gram- dodatnie, pałeczki.

3,73

5,43 x 10

± 1,9

Gram- dodatnie, pałeczki.

3,52 10,63 x 10

± 1,84 Gram- dodatnie, pałeczki, ziarniaki.

3,42

0,08 x 10

drożdże

3,46

1,78 x 10

± 1,15 Gram- dodatnie, pałeczki, ziarniaki.

Nr soku

CFU/ml ± SEM

Charakterystyka preparatów

3,37

1,32 x 10

± 0,43 Gram- dodatnie, pałeczki.

3,52

3,37 x 10

± 0,73 Gram- dodatnie, pałeczki.

3,38

2,8 x 10

± 0,66

Gram- dodatnie, pałeczki, ziarniaki.

3,39

0,06 x 10

Gram- dodatnie, pałeczki, ziarniaki.

Sok nr 22 oraz 27 nie zostały wzięte pod uwagę w dalszych badaniach. W pierwszym

występowały tylko grzyby drożdżopodobne natomiast w drugim zaobserwowano bardzo

mały wzrost kolonii na podłożu MRS.

Jak przedstawiono w Tabeli 1, pH wszystkich soków było mocno kwaśne, w granicach

od 3,23 (sok 4) do 3,8 (sok 1). Na wszystkich płytkach MRS nastąpił wzrost kolonii

wysianych z rozcieńczonych soków, świadczy to o obecności bakterii fermentacji

mlekowej. Najniższe CFU/ml zaobserwowano w soku nr 5 (0,03 x 10

± 0,01), natomiast

najwyższe w soku nr 19 (27,93 x 10

± 2,03). W preparatach mikroskopowych najczęściej

obserwowano Gram- dodatnie pałeczki różnej wielkości. Na Ryc.1. przedstawiono

zróżnicowanie w wielkości i długości obserwowanych pałeczek . Na 27 badanych soków

w 17 obecne były również ziarniaki, a w 2 wykryto drożdże. Do dalszych badań wybrano

drobnoustroje o morfologii pałeczek Gram- dodatnich i podjęto próbę klasyfikacji ich do

rodzaju Lactobacillus.

Ryc.1. Morfologia pałeczek Lactobacillus sp. Preparaty barwione metodą Grama, pow.

10x 100 (Nikon).

IV.2. Identyfikacja szczepów pod kątem przynależności do rodzaju Lactobacillus.

Przynależność szczepów do rodzaju Lactobacillus sprawdzono wykonując test na

katalazę. Szczep uznawano za katalazo- ujemny, gdy po dodaniu H

nie pojawiło się

gazowanie związane z wydzielaniem O

. Następnie sprawdzono fermentację glukozy,

rozkład eskuliny, obecność dihydrolazy argininy. Szczepy zostały sprawdzone na

typowych podłożach diagnostycznych, przy czym dodawano do nich podłoże MRS.

Wszystkie badane szczepy są katalazo- ujemne. Z badanych szczepów 17 wykazuje

właściwość fermentacji glukozy, z czego 7 wydziela CO

, natomiast żaden szczep nie

rozkłada eskuliny ani nie ma aktywności dihydrolazy argininy. Zespół tych cech

potwierdza przynależność badanych bakterii do rodzaju Lactobacillus.

IV.3. Działanie antybakteryjne bakterii w sokach.

W pierwszej kolejności zbadano działanie antybakteryjne wszystkich bakterii

występujących w sokach, aby wyselekcjonować soki zawierające bakterie o takich

właściwościach.

Wszystkie badane soki posiewano na płynny MRS i inkubowano 48 godzin w 37°C.

Następnie podłoże odwirowano, a pH supernatantów ustalono na 6,0 i przesączono przez

filtry bakteriologiczne. Działanie antybakteryjne tak przygotowanych supernatantów

sprawdzono wobec hodowli: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus,

Escherichia coli, Proteus mirabilis, Providencia stuarti. Uzyskane wyniki przedstawiono

w Tabeli 2.

Tabela 2. Działanie antybakteryjne soków.

soku

Pseudomonas

aeruginosa

Staphylococcus

aureus

Escherichia

coli

Proteus

mirabilis

Providencia

stuarti

N- r

1:1

N- r

1:1

N- r

1:1

N- r

1:1

N- r

1:1

+/-

N- r – supernatant nierozcieńczony; 1:1- supernatant rozcieńczony

+ działanie antybakteryjne (brak wzrostu bakterii)

+/- działanie antybakteryjne (zahamowanie wzrostu bakterii, na dnie dołka widoczny osad)

- brak działania antybakteryjnego (wzrost bakterii)

Soki nr 1 i 2 nie zostały tutaj zbadane, ponieważ ich poszczególne szczepy zostały

zbadane w późniejszych etapach badań. Rozcieńczone supernatanty z hodowli soków

(1:1) nie wykazywały właściwości antybakteryjnych. Niektóre supernatanty

nierozcieńczone, w liczbie 9 wykazały działanie bakteriobójcze, ponieważ nie nastąpił

wzrost bakterii. Natomiast jeden supernatant (23) zadziałał bakteriostatycznie, ponieważ

ograniczył jedynie wzrost bakterii

IV.4. Działanie antybakteryjne wybranych szczepów Lactobacillus sp.

Z soków, które wykazywały działanie antybakteryjne zbadano wszystkie szczepy pod

kątem właściwości antybakteryjnych. W tym celu kolejne szczepy posiewano na płynny

MRS i inkubowano 48 godzin w temp. 37°C. Właściwości antybakteryjne supernatantów

pohodowlanych zostały następująco zbadane:

 bez ustalonego pH, gdzie odwirowano i odciągnięto supernatant,
 nieprzesączone, gdzie w supernatancie ustalono pH do 6,0,
 ogrzewane, gdzie w supernatancie ustalono pH 6,0 i ogrzewano przez 20 minut w

90°C,

 przesączone, gdzie w supernatancie ustalono pH 6,0 i przesączono go przez filtry

antybakteryjne o średnicy porów 0,2 µm,

 po działaniu peroksydazy, gdzie w supernatancie ustalono pH 6,0, ogrzewano przez

20 minut w temperaturze 90°C, dodano 20 µl peroksydazy (roztwór wodny 20mg/ml)

aby rozłożyć nadtlenek wodoru i inkubowano w 4°C/ noc.

W tak przygotowanych supernatantach nierozcieńczonych i rozcieńczonych w stosunku

1:1 określano właściwości bójcze jak opisano w podrozdziale Metody (III.2.3). W

poniższej tabeli (Tabela 4) przedstawiono tylko wybrane szczepy, których wyniki

wskazywały na ich działanie antybakteryjne.

Tabela 4. Właściwości antybakteryjne wybranych szczepów w różnym pH.

Numer

szczepu

Pseudomonas

aeruginosa

Staphylococcus

aureus

Escherichia

coli

Proteus

mirabilis

Providencia

stuarti

Pseudomonas

aeruginosa

S1K1

S2K12

S2K18

+/-

S4K3

S5K3

S6K1

S18K1

+/-

S18K2

+/-

S18K4

+/-

S18K7

+/-

S18K9

+/-

S18K10 +

+/-

S19K1

S19K2

+/-

S19K3

+/-

S19K6

+/-

S19K7

+/-

S19K8

+/-

S19K10 +

+/-

S20K1

+/-

S20K2

+/-

S20K3

+/-

S20K8

+/-

S20K9

+/-

S21K5

+/-

S21K6

+/-

S21K7

+/-

S23K2

+/-

*- pH nieustalone

**- pH= 6,0

+ działanie antybakteryjne (brak wzrostu bakterii)

+/- działanie antybakteryjne (zahamowanie wzrostu bakterii, na dnie dołka widoczny osad)

- brak działania antybakteryjnego (wzrost bakterii)

Wszystkie nierozcieńczone badane supernatanty pohodowlane bez ustalonego pH na 6,0

wykazały właściwości bakteriobójcze w stosunku do wszystkich badanych bakterii. Takie

działanie można przypisać niskiemu pH , które wynosiło od 3,5- 4,0. Aby sprawdzić czy

szczepy posiadają inne czynniki antybakteryjne, pH ustalono na 6,0. W tym przypadku

również wszystkie supernatanty nierozcieńczone o pH 6,0 wykazały działanie

antybakteryjne. Sześć szczepów Lactobacillus wykazało działanie bakteriobójcze (S1K1,

S2K12, S4K3, S5K3, S6K1, S19K1), z czego szczepy S1K1, S2K12 i S19K1 również po

rozcieńczeniu, co świadczy o dużej aktywności bójczej tych szczepów. Natomiast reszta

supernatantów posiadała właściwości bakteriostatyczne, z czego w przypadku szczepu

S18K10, także rozcieńczony. Szczepy S21K5, S21K6 i S21K7, w których pH zostało

ustalone na 6,0 wykazywały wybiórcze działanie bakteriostatyczne, bo tylko w stosunku

do Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus i Klebsiella pneumoniae.

IV.5.Wytwarzanie wody utlenionej przez wybrane szczepy Lactobacillus sp.

Wybrane szczepy bakterii zostały zbadane pod kątem ilości wytwarzanej wody utlenionej

) jako czynnika działającego bójczo na inne drobnoustroje. W tym celu

przygotowano próby jak opisano w rozdziale Metody (III.2.5.), a ilość uwolnionego

produktu oznaczano metodą kolorymetryczną. Wartości absorbancji zostały

przedstawione na Ryc.2.

Ryc.2. Produkcja H

przez szczepy Lactobacillus po w różnym czasie inkubacji w 4°C.

Wartość absorbancji odpowiada w tym przypadku intensywności produkcji wody

utlenionej przez badany szczep po określonym czasie inkubacji. Wszystkie szczepy

produkowały wodę utlenioną, przy czym z różną intensywnością. Absorbancja prób dla

wszystkich szczepów mieściła się w zakresie 0,006 do ok. 0,7. Najsilniej cechę tą

wykazywały szczepy S18K1, S18K7, S18K9, S18K10, S19K1, S19K6, S19K8, S23K2.

Natomiast najmniejszą zdolnością do produkcji nadtlenku wodoru charakteryzowały się

szczepy: S1K1, S4K3, S5K3, S6K1, S18K2, S18K4, S20K2, S20K3, S21K5. U

pozostałych szczepów wykazano średnią produkcję wody utlenionej. W przypadku

większości szczepów, najwyższy poziom wody utlenionej stwierdzono w 48 godzinie.

Jednak niektóre z nich największą produkcją tego związku charakteryzowały się w

pierwszej godzinie, a później jego produkcja spadała (S19K8, S23K2

IV.6. Charakterystyka właściwości antybakteryjnych wybranych szczepów

Lactobacillus.

W celu dalszej charakterystyki właściwości antybakteryjnych supernatanty pohodowlane

Lactobacillus o pH 6,0 i przesączone przez filtry antybakteryjne ogrzewano w 90°C przez

20 min. Miało to na celu unieczynnienie czynników termowrażliwych, pozostawiając te

oporne na temperaturę, w tym np. bakteriocyny. W celu poznania sposobu działania

antybakteryjnego szczepów wykonano także test na właściwości antybakteryjne

wybranych szczepów w obecności enzymu peroksydazy, który rozkłada H

. Wyniki

przedstawiono w Tabeli 5, gdzie porównano działanie supernatantów pohodowlanych, po

podgrzaniu do 90°C przez 20 min oraz poddanych działaniu peroksydazy.

Tabela 5. Właściwości antybakteryjne wybranych szczepów z rodzaju Lactobacillus, po

podgrzaniu oraz po traktowaniu peroksydazą.

Numer

szczepu

Pseudomonas

aeruginosa

Staphylococcus

aureus

Klebsiella

pneumoniae

Escherichia

coli

Proteus

mirabilis

Providencia

stuarti

** *** *

** *** * ** *** *

** ***

** *** *

** ***

S1K1 +

+/-

S2K12 + +/-

+/-

+ +/-

+/-

+ +/-

S2K18 +

S4K3 +

+/- +

+/-

S5K3

S6K1 +

S18K1 -

- +/-

+/-

S18K2 -

S18K4 +/- +

+ +/

+/- +

S18K7 -

S18K9 +

+ +/

+/-

+/- +

S18K1

+/- +

S19K1 + +/-

+/-

S19K2 +

+ +/

+/-

S19K3 +/- +

+/- +

S19K6 +

+/-

+ +/

+/-

S19K7 +

+/- +/- +/- +

S19K8 +

+/- +

+/-

+/- +

+/-

S19K1

S20K1 +

+ +/-

S20K2 +/- +/-

+/-

+/- +/-

S20K3 +

Numer

szczepu

Pseudomonas

aeruginosa

Staphylococcus

aureus

Klebsiella

pneumoniae

Escherichia

coli

Proteus

mirabilis

Providencia

stuarti

** *** *

** *** * ** *** *

** ***

** *** *

** ***

S20K8 +

+/- +

S20K9 -

S21K5 +

+/- +

+/-

+/- +

S21K6 -

+/-

S21K7 -

- +/-

+/- +/-

S23K2 +

* - przesączone; ** - 90°C/20 min; ***- peroksydaza/noc
+ działanie antybakteryjne (brak wzrostu bakterii)
+/- działanie antybakteryjne (zahamowanie wzrostu bakterii, na dnie dołka widoczny osad)
- brak działania antybakteryjnego (wzrost bakterii)

W supernatantach pohodowlanych przesączonych 23 wykazywało właściwości

antybakteryjne. Dwadzieścia z nich było bakteriobójcze, z czego 7 działało na wszystkie

bakterie, a 13 działało wybiórczo na wybrane bakterie. Szczep S20K3 wykazywał

właściwości bakteriobójcze także w przypadku rozcieńczenia supernatantu w stosunku

1:1. Dziesięć supernatantów pohodowlanych nierozcieńczonych wykazało właściwości

bakteriostatyczne, z czego szczep S18K4 w przypadku Providencia stuarti także

rozcieńczony. Pięć z badanych prób nierozcieńczonych wykazywało właściwości

antybakteryjne wobec jednego lub dwóch szczepów bakterii (S1K1, S4K3, S6K1,S21K6,

S21K7).

Z badanych supernatantów pohodowlanych ogrzewanych w temperaturze 90°C,

nierozcieńczonych 21 posiada właściwości antybakteryjne. Siedemnaście wykazało

właściwości bakteriobójcze, z czego niektóre (S1K1, S4K3, S18K9, S19K3, S19K6,

S19K7, S20K1) działają tylko w stosunku do wybranych bakterii. Dla jednego szczepu

(S20K3), podobnie jak to było w przypadku próby nie podgrzewanej, wykazano

właściwości bakteriobójcze także w przypadku rozcieńczenia podłoża po hodowli.

Dziesięć supernatantów pohodowlanych nierozcieńczonych posiada właściwości

bakteriostatyczne, z czego niektóre (S1K1, S18K1, S18K9, S19K1, S19K6, S19K7,

S20K1, S21K7) działały wybiórczo na wybrane bakterie.

Działanie wysoką temperaturą na badane próby w przypadku niektórych szczepów

wzmogło działanie antybakteryjne (S1K1, S18K1, S18K4, S18K10, S21K5, S21K7), a w

niektórych osłabiło (S2K12, S6K1, S18K9, S19K1, S19K3). Zmiany te prawdopodobnie

spowodowane są albo zniszczeniem takich czynników antybakteryjnych jak adhezyny

lub białek warstwy S wrażliwych na wysoką temperaturę lub też wstępne oczyszczenie

preparatów bakteriobójczych z czynników, które hamowały ich aktywność.

Poprzez działanie peroksydazy na uzyskane supernatanty w przypadku jednego szczepu

(S20K9) zaobserwowano wzmożenie działania antybakteryjnego, natomiast u innych

szczepów (S2K18, S18K4, S18K9, S19K2, S19K6, S20K1) działanie antybakteryjne

pozostało bez zmian. W przypadku 2 szczepów Lactobacillus (S4K3, S19K8) efekt

bakteriobójczy był słabszy, a u pozostałych 12 już go w ogóle nie obserwowano. Enzym

peroksydaza rozkłada wodę utlenioną, która jest czynnikiem działającym antybakteryjnie

u szczepów Lactobacillus. Nasuwa się więc wniosek, że w supernatantach, w których

nastąpiło obniżenie lub nie miały wcale właściwości antybakteryjnych głównym

czynnikiem działającym bójczo była właśnie woda utleniona. Porównując uzyskane

wyniki z Ryc.2, na której przedstawiono ilość wytwarzanej wody utlenionej możemy

zauważyć, że w szczepach (S18K10, S19K1, S19K3, S19K7, S19K8, S19K10, S23K2),

które wytwarzały dużą ilość wody utlenionej po zadziałaniu peroksydazy nastąpił spadek

aktywności antybakteryjnej. To potwierdza, że woda utleniona była u nich dominującym

czynnikiem działającym antybakteryjnie. Natomiast w przypadku szczepów

Lactobacillus S18K9 i S19K6, które produkowały dużą ilość wody utlenionej, a działanie

peroksydazy nie wpłynęło na ich bójcze działanie, można stwierdzić że woda utleniona

nie jest ich głównym czynnikiem o działaniu antybakteryjnym.

V. Dyskusja

Probiotyki stają się w dzisiejszych czasach alternatywą dla antybiotyków w

zakażeniach układu moczowego. Są już z powodzeniem stosowane w infekcjach układu

pokarmowego prowadzących do biegunek, a także w żywieniu dojelitowym

okołooperacyjnym jako profilaktyka przeciwinfekcyjna. Zakażenia układu moczowego

są problemem medycyny na całym świecie, kobiet, a także pacjentów z urazem rdzenia

kręgowego, pęcherzem neurogennym oraz długotrwale cewnikowanych Długotrwała

antybiotykoterapia skutkuje wzrastającą lekoopornością bakterii chorobotwórczych oraz

niszczy naturalna mikroflorę człowieka (Borchert i in. 2008). Na szczególną uwagę

zasługuje Lactobacillus, które zdolne są do przeżycia w środowisku organizmu. Cechy

jakie posiadają mogą świadczyć o ich zdolności do konkurowania, a nawet zwalczania

bakterii patogennych (Buda i in. 2013). Na podstawie prac różnych autorów można

zauważyć, że do tej pory badane były jedynie szczepy z rodzaju Lactobacillus

wyizolowane od człowieka lub zwierzęcia, ponieważ są to mikroorganizmy naturalnie

zasiedlające organizm, z czego można wnioskować, że są dla niego bezpieczne. Należy

jednak zachować szczególną ostrożność u pacjentów z niedoborem odporności, ponieważ

u takich osób nawet bakterie probiotyczne mogą stać się patogenne (Borchert i in. 2008).

Równie bogatym źródłem bakterii z rodzaju Lactobacillus są kiszone warzywa i

produkty mięsne. W czasie spontanicznej fermentacji, która jest uzależniona od

epifitycznych organizmów, warzywa są zanurzone w roztworze soli na kilkanaście dni w

temperaturze od 8-27°C. W tym czasie mikroorganizmy Gram- ujemne są obecne na

powierzchni warzyw. Ilość bakterii fermentacji mlekowej (LAB) jest niewielka, ale

wzrasta w końcowym etapie fermentacji wraz z obniżeniem ilości tlenu oraz soli. Te dwa

czynniki powodują śmierć bakterii Gram- ujemnych, dla których nie jest to korzystne

środowisko. Natomiast LAB szybko się namnażają, produkują kwas mlekowy i stają się

florą dominującą (Schillinger 1987, Yu 2012). Te informacje pozwoliły wykorzystać w

tej pracy kiszonki jako źródło Lactobacillus. Są to produkty spożywane na co dzień przez

człowieka, daje to pewność, że wyizolowane bakterie będą bezpieczne dla człowieka. Do

izolacji bakterii z kiszonek zastosowano metodę rozcieńczeń soków w postępie

arytmetycznym, następnie wysiano je na podłoże MRS agar, tak jak zostało to opisane

przez Saeedi i wsp. [2014]. Szczepy zaklasyfikowano do rodzaju Lactobacillus, poprzez

wykonanie barwienia Grama, testu na katalazę oraz testów biochemicznych

obejmujących fermentację glukozy, eskuliny i dihydrolazę argininy i badano ich

właściwości antybakteryjne (Saeedi i in., 2014).

Najczęściej badania właściwości antybakteryjnych bakterii probiotycznych

dotyczą gotowego preparatu probiotycznego złożonego z jednej lub mieszaniny bakterii

kwasu mlekowego, często w stosunku do jednego konkretnego patogenu. Przykładem

takich badań było zastosowanie probiotyków u osób zakażonych E. coli zarówno u

pacjentów długotrwale cewnikowanych oraz kobiet, co zmniejszyło zapadalność na

odcewnikowe zakażenie układu moczowego oraz epizody nawrotów (Borchert i wsp.,

2008). W badaniach klinicznych stosowano również L. reuteri oraz L. crispatus

(Stapleton i in. 2011, Jones i in., 2012). Stosowanie L. crispatus w czopkach

dopochwowych zmniejszyło występowanie zakażeń układu moczowo- płciowego u

kobiet (Dineshkumar i in. 2013). Szczep ten był głównym składnikiem probiotyku

Lactiv- V, który nie tylko redukował zakażenia, a także powodował odbudowywanie

endogennej flory L. crispatus (Stapleton i in. 2011). Preparat probiotyczny złożony ze

szczepów L. rhamnosus GR-1 i L. reuteri spowodował zmniejszenie liczby nawrotów

zakażeń układu moczowego oraz miał pozytywny wpływ na normalną mikroflorę

bakteryjną badanych kobiet (Banan- Mwine Daliri, Lee 2015). Fraga i wsp. (2005)

przeprowadzili badania na myszach w których wykazali, że L. murinus, będący

składnikiem naturalnej flory myszy, zapobiegał oraz hamował wzrost bakterii

patogennej, towarzyszącej rozwojowi infekcji układu moczowego. Infekcje pęcherza

były rzadsze u myszy przyjmujących probiotyk niż u myszy, którym go nie podawano.

Zjawiska zahamowania wzrostu patogenu nie zaobserwowano w przypadku nerek (Fraga

2005). W prezentowanej pracy magisterskiej wykazano działanie antybakteryjne

szczepów Lactobacillus w stosunku do wielolekoopornych bakterii uropatogennych

izolowanych z cewników urologicznych. Jak wykazano, za efekt ten odpowiadają

zarówno wytwarzane przez bakterie kwasy organiczne i woda utleniona, jak i inne

czynniki o różnej stabilności w wysokiej temperaturze. Juárez i wsp. (2011) sprawdzali

wpływ 38 szczepów Lactobacillus na bakterie powodujące zakażenia układu

moczowego. Prawie połowa szczepów Lactobacillus hamowała wzrost bakterii

patogennych, natomiast ok. 70% wytwarzało nadtlenek wodoru. Ten czynnik oraz

wytwarzanie kwasów organicznych odpowiadało za efekt bakteriobójczy (Juárez i in.

2011). W pracy magisterskiej poprzez podniesienie pH supernatantów pohodowlanych

udowodniono, że nie u wszystkich szczepów właściwości antybakteryjne zależą od

produkcji kwasów organicznych. Wykazano również, że wszystkie badane szczepy

produkują w różnym stopniu nadtlenek wodoru. Rozkład wody utlenionej peroksydazą

wykazał, w których z badanych szczepów czynnikiem antybakteryjnym była woda

utleniona, a w których inne czynniki. Próba określenia czynnika antybakteryjnego

wykazała, że część szczepów posiada czynniki antybakteryjne termowrażliwe, a część

termostabilne. Badania powinny być kontynuowane w kierunku szczegółowego poznania

mechanizmów antybakteryjnego działania Lactobacillus wraz z ustaleniem

najefektywniejszego czynnika bójczego oraz jego optymalnej dawki. Praca ukazuje

również korzyści wynikające z profilaktycznego spożywania kiszonek, jako źródła

probiotyków działających dobroczynnie na nasz organizm.

IV. Wnioski

1. Wszystkie badane soki z kiszonej kapusty i ogórków były bogatym źródłem szczepów

Lactobacillus.

2. Znaczna część badanych soków (10 z 27 badanych) zawierała bakterie o

właściwościach antybakteryjnych.

3. Wszystkie wyizolowane z soków Lactobacillus zahamowały wzrost wybranych

uropatogenów.

4. Analizując działanie antybakteryjne hodowli Lactobacillus z i bez podnoszenia pH

można stwierdzić, że za efekt ten nie odpowiada tylko produkcja kwasów

organicznych.

5. Wykazano, że wszystkie szczepy Lactobacillus wytwarzają wodę utlenioną, ale ilość

tego produktu uwalnianego w hodowlach była bardzo zróżnicowana. Rozkład wody

utlenionej przez peroksydazę spowodował spadek (12 z 28 badanych) właściwości

antybakteryjnych co potwierdza występowanie jeszcze innych czynników o działaniu

bójczym na bakterie.

6 . Dalsze próby ustalenia czynnika działającego antybakteryjnie polegające na badaniu

właściwości prób po działaniu wysokiej temperatury wykazały, że (5 z 27 badanych)

bakterie posiadają czynniki termowrażliwe oraz te odporne na wysoką temperaturę (6

z 27 badanych).

IV. Streszczenie

Bakterie fermentacji mlekowej z rodzaju Lactobacillus to drobnoustroje, które

dzięki posiadanym czynnikom antybakteryjnym mogą być stosowane jako leki lub też w

profilaktyce wielu schorzeń, m. in. w zakażeniach układu moczowego. Badania w

prezentowanej pracy zostały podjęte z uwagi na ogromne zainteresowanie świata nauki

praktycznym zastosowaniem tych bakterii oraz ze względu na mało doniesień o

antybakteryjnym działaniu probiotyków wyizolowanych z fermentującej żywności.

Celem pracy była izolacja i identyfikacja bakterii z rodzaju Lactobacillus z kiszonek, oraz

zbadanie ich właściwości antybakteryjnych. Szczepy izolowano z soków z kiszonej

kapusty i ogórków na podłożu MRS i identyfikowano na podstawie właściwości

biochemicznych i morfologii komórek. Działanie bakteriobójcze badano w stosunku do

szczepów uropatogennych bakterii izolowanych z cewników urologicznych. Początkowo

określono właściwości antybakteryjne supernatantów pohodowlanych mieszanej flory z

poszczególnych soków, a następnie zbadano właściwości antybakteryjne supernatantów

z wybranych szczepów z rodzaju Lactobacillus. Ponadto podjęto próbę wstępnego

określenia czynnika antybakteryjnego. W tym celu zbadano wytwarzanie wody utlenionej

przez wybrane szczepy oraz wpływ na ich działanie pH wzrostu, przesączenia,

podgrzania oraz poddania działaniu peroksydazy supernatantów. Uzyskane wyniki

wykazały, że soki z kiszonek były bogatym źródłem bakterii z rodzaju Lactobacillus.

Duża część soków (10 z 27) zawierała bakterie o właściwościach antybakteryjnych.

Podniesienie pH supernatantów potwierdziło, że za właściwości antybakteryjne nie

odpowiadają tylko kwasy organiczne. Wszystkie badane szczepy w różnym stopniu

wytwarzały wodę utlenioną, a jej rozkład przez peroksydazę spowodował w przypadku

niektórych szczepów (12 z 28) osłabienie działania antybakteryjnego. Wskazało to, w

których szczepach głównym czynnikiem działającym bójczo była woda utleniona.

Podgrzanie supernatantów badanych szczepów potwierdziło występowanie w nich

antybakteryjnych czynników termowrażliwych (w 5 z 28 badanych) i termostabilnych (w

6 z 28 badanych) Uzyskane wyniki mogą stać się podstawą dla dalszych badań nad

skutecznym lekiem probiotycznym na zakażenia układu moczowego.

Summary

Lactic acid bacteria of the genus Lactobacillus are microorganisms which possess

antibacterial agents and thus can be used as medicaments or for the prophylaxis of various

disorders, e.g. in urinary tract infections. Research in this paper has been taken due to the

enormous interest in the world of science in practical application of these bacteria, and

because of the few reports about antibacterial activity of probiotics isolated from

fermenting food. The aim of this study was isolation and identification of bacteria of the

genus Lactobacillus from pickled cucumbers and cabbage and to investigate their

antibacterial properties. Strains were isolated from cabbage and cucumber juice on MRS

medium and identified on the basis of morphology and biochemical properties of the cells.

Antibacterial activity was tested against uropathogenic bacteria strains isolated from the

catheter. At first the antibacterial properities were defined in the post-culture supernatants

mixed flora and then the antibacterial properties of supernatants from selected strains of

Lactobacillus were examined. Moreover, there was an attempt to define the antibacterial

agent. For that purpose the production of hydrogen peroxide by the selected strains and

their impact on the pH of their growth was examined as well as filtration, heating and

treatment of supernatants with peroxidase. The results showed that the fermented juices

are rich in bacteria of the genus Lactobacillus. A large part of juice (10 of 27) contained

the bacteria with antibacterial properties. Raising the pH of the supernatants confirmed

that the antibacterial properties do not correspond to only organic acids. All tested strains

produced varying degrees of hydrogen peroxide and its decomposition by peroxidase in

the case of certain strains (12 of 28) caused decrease of antibacterial properites. This

indicated that the strains of the main active antibacterial agent was hydrogen peroxide.

Heating the supernatants of tested strains confirmed the presence of antibacterial

thermosensitive agents (5 of 28 patients) and thermostable agents (6 out of 28

respondents). The results can be the basis for further research on effective probiotic drug

for urinary tract infections.

VII. Literatura

1. Banan-Mwine Daliri E., Lee B.H. 2015. New perspectives on probiotics in health and

disease. Food Science and Human Wellness, 4: 56-65

2. Borchert D., Sheridan L., Papatsoris A., Faruquz Z., Barua J.M., Junaid I., Pati Y.,

Chinegwundoh F., Buchholz N. 2008. Prevention and treatment of urinary tract

infection witch probiotics: Review and research perspective. Indian Journal of

Urology. 24, 2:139-144

3. Buda B., Dylus E., Górska- Frączek S., Brzozowska E., Gamian A. 2013. Właściwości

biologiczne białek powierzchniowych bakterii z rodzaju Lactobacillus. Postępy

Higieny i Medycyny Doświadczalnej (online). 67:229-237

4. Dineshkumar B., Krishnakumar K., Jalaja S.M., Anish J., Paul D., Cherian J. 2013.

Natural approaches for Treatmeant of Urinary Tract Infections: A Review. Scholars

Academic Journal of Pharmacy. 2(6): 442-444

5. Fraga M., Scavone P., Zunino P. 2005. Preventive and therapeutic administartion of

a indigenous Lactobacillus sp. strain against Proteus mirabilis ascendind urinary

tract infection in a mouse model. Antoine van Leeuwnhock. 88: 25-34

6. Gajewska J., Błaszczyk M.K. 2012. Probiotyczne bakterie fermentacji mlekowej

(LAB). Postępy Mikrobiologii. 51,1:55-65

7. Goldin B.R., Gorbach S.L. 2008. Clinical Identifications for Probiotics: An Overview.

Clinical Infectious Diseases. 46:96–100

8. Hoesl C.E., Altwein J.E. 2005. The Probiotic Approach: An Alternative Treatment

Option in Urology. European Urology. 47:288-296

9. Jones M.L., Martoni C.J., Di Pietro E., Simon R.R., Prakash S. 2012. Evaluation of

clinical safety and tolerance of a Lactobacillus reuteri NCIMB 30242 supplement

capsule: A randomized control trial. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 60,

2: 313–320

10. Juárez T.M.S., Saralegui Duhart C.I., De Gregorio P.R., Vera Pingitore E., Nader-

Macias M.E. 2011. Urogenital pathogen inhibition and compatibility between vaginal

Lactobacillus strains to be considered as probiotic candidates. European Journal of

Obstetrics and Gynecology and Reproductive Biology. 159: 399-406

11. Kang H.J., Baker E.N. 2012. Structure and assembly of Gram-positive bacterial pili:

unique covalent polymers. Current Opinion in Structural Biology. 22: 200-207

12. Kuśmierska A., Fol M. 2014. Właściwości immunomodulacyjne i terapeutyczne

drobnoustrojów probiotycznych. Problemy Higieny i Epidemiologii. 95(3):529-540

13. Mojka K. 2014. Probiotyki, Prebiotyki i synbiotyki- charakterystyka i funkcje.

Problemy Higieny i Epidemiologii. 95(3): 541-549

14. Saeedi M., Shahidi F., Mortazavi S.A., Milani E., Yazdi F.T. 2015. Isolation and

identification of lactic acid bacteria in winter salad (local pickle) during

fermantation using 16s rRNA gene sequence analysis. Journal of Food Safety. 35:

287-294

15. Schillinger U., Lucke F-K. 1987. Identification of lactobacilli from meat and meat

products. Food Microbiology. 4: 199-208

16. Słońska A., Klimuszko D. 2010. Bakteriocyny probiotycznych pałeczek z rodzaju

Lactobacillus. Postępy Mikrobiologii. 40, 2: 87-96

17. Stapleton A.E., Au- Yeung M., Hooton T.M., Fredricks D.N., Roberts P.L., Czaja

C.A., Yarova- Yarovaya Y., Fiedler T., Cox M., Stamm W.E. 2011. Randomized,

placebo- controlled phase 2 trial of a Lactobacillus crispatus probiotic given

intravaginally for prevention of recurent urinary tract infection Clinical Infectious

Diseases. 52(10):1212–1217.

18. Tripathi P., Beaussart A., Andre G., Rolain T., Lebeer S., Vanderleyden J., Hols P.,

Dufrěne Y.F. 2012. Towards a nonoscale view of lactic acid bacteria. Micron. 50: 31-

19. Yu J., Gao W., Qing M., Sun Z., Wang W., Liu W., Pan L., Sun T., Wang H., Bai N.,

Zhang H. 2012. Identification and characterization of lactic acid bacteria isolated

from traditional pickles in Sichuan, China. Journal of General and Applied

Microbiology. 58:163-172