Oznaczanie RNA w materiale roślinnym
Prowadzący: mgr inż. Marta Grec
1. Wstęp teoretyczny
RNA oraz DNA, nazywane kwasami nukleinowymi, są długimi liniowymi polimerami, w
których monomery stanowią nukleotydy1. Każdy z tych merów, który złożony jest z jednostki
cukrowej  �-D-rybozy (RNA) oraz �-D-deoksyrybozy (DNA) - związanej w pozycji 1 z
zasadą purynową (adenina A, guanina G) lub pirymidynową (cytozyna C, tymina T  w DNA,
uracyl U  w RNA), łączy się z kolejnym za pomocą wiązania 3 5 -fosfodiestrowego.
Cząsteczki DNA i RNA są uważane za nośniki informacji genetycznej, która jest
przechowywana w sekwencji zasad leżących wzdłuż łańcucha kwasu nukleinowego. Zasady
te posiadają szczególną cechę tworzenia za pomocą wiązań wodorowych specyficznych par, a
takie ich parowanie jest podstawą mechanizmu kopiowania informacji genetycznej z
istniejącego łańcucha na nowo powstały. Cząsteczki RNA zbudowane są z jednej nici ale
zawierają rejony typu  spinki do włosów , powstające w wyniku utworzenia dwuniciowej
helisy przez sekwencje komplementarne występujące w jednej nici kwasu.
DNA stanowi materiał genetyczny organizmów komórkowych, który określa jakie białka
powstają w komórce, ale to RNA stanowi bezpośrednią matrycę dla ich syntezy. Ekspresja
genów jest przekształceniem informacji zawartej w DNA w funkcjonalne cząsteczki, w której
kluczową rolę odgrywa kilka rodzajów RNA:
a) Informacyjny RNA (mRNA)  stanowi matrycę do syntezy białek czyli translacji 
określa kolejność aminokwasów w syntezowanym białku
b) Transportujący RNA (tRNA)  przenosi zaktywowane aminokwasy do rybosomów,
gdzie dochodzi do ich połączenia się wiązaniami peptydowymi w kolejności
określonej przez mRNA
c) Rybosomowy RNA (rRNA)  główny składnik rybosomów, pełni podczas biosyntezy
białek funkcje zarówno katalityczne jak i strukturalne
DNA stanowi matrycę do syntezy RNA, a proces ten nazywany jest transkrypcją. Jest on
katalizowany przez enzym  polimerazę RNA, która rozpoznając tzw. promotora rozpoczyna
syntezę RNA. Polimeraza RNA przemieszcza się wzdłuż matrycy i przepisuje jedną z nici, aż
osiągnie miejsce terminacji transkrypcji.
Zawartość RNA w komórce roślinnej zmienia się w zależności od rodzaju tkanki i jej
stadium rozwojowego. W dojrzałych liściach całkowite stężenie RNA wynosi 0,1-0,2%. W
liściach czy korzeniach starzejących się lub poddanych głodzeniu jego poziom wyraz
nie
obniża się.
W komórce RNA zwykle połączone jest z białkami, które można odłączyć przez działanie
detergentami, chlorkiem guanidyny lub proteazami. Naturalne mieszaniny RNA można
rozdzielić metodą chromatografii jonowymiennej, sączenia molekularnego w żelach itd.
Badanie składników RNA można przeprowadzić bez poddania go reakcji hydrolizy (np.
stosując reakcje barwne tj. reakcja Biala na rybozę) lub po hydrolizie enzymatycznej lub
chemicznej. W wyniku działania 1M kwasu solnego (1h, 100oC) na cząsteczkę RNA
uwalniane są zasady purynowe, fosforany rybozy oraz nukleotydy pirymidynowe.
Ogrzewanie RNA w obecności 0,5M wodorotlenku potasu (40oC) powoduje powstawanie 2 -
3 - cyklicznych diestrów mononukleotydów (nie powstają one z DNA, gdyż nie ma w nim 2 -
OH); przedłużenie czasu ogrzewania w wodorotlenku potasu do godziny prowadzi do
utworzenia w przybliżeniu równych ilości rozpuszczalnych soli potasowych izomerów 2 - i
3 - nukleotydów: AMP, GMP, CMP i UMP (rys 1), których ilość można oznaczyć
spektrofotometrycznie.
NH2 O
N
N
NH
N
N
N
NH2
N
N
HO
HO
O
O
OH
O OH
O
O P O- O P O-
O- O-
NH2
O
N
NH
N O
N O
HO
O
HO
O
O OH
OH O
O P O-
O P O-
O-
O-
Rys. 1
Podczas ćwiczenia będzie wykorzystana adaptowana do materiału roślinnego i
uproszczona procedura Schmidta i Thannhausera2. Polega ona na usunięciu z materiału
roślinnego barwników, lipidów, białek, wolnych nukleotydów i DNA. Pozostałe RNA
hydrolizuje się poprzez łagodne ogrzewanie w roztworze wodorotlenku potasu, a powstające
2 - i 3 -mononukleozydy oznacza się spektrofotometrycznie. Wykazują one maksymalną
absorpcję przy około 260 nm. Ponadto mierzy się absorbancję przy 300 nm w celu
wprowadzenia poprawki wynikającej z obecności innych związków pochłaniających
promieniowanie przy tej długości fali.
2. Wykonanie ćwiczenia
Odczynniki i materiały:
95% etanol
80% etanol
eter naftowy
0,2M kwas nadchlorowy (schłodzony)
1M kwas nadchlorowy
0,5M wodorotlenek potasu
materiał roślinny
Szkło i inne wyposażenie
Kolba stożkowa 250 ml, moz
dzierz z tłuczkiem, pęseta, lejek szklany z korkiem gumowym,
kolbka ssawkowa, sączki, bagietki, probówka wirówkowa, próbówka szklana, termometr,
cylinder miarowy 10 ml, pipeta, łaz
nia lodowa, łaz
nia wodna (100oC), łaz
nia wodna (40oC),
folia aluminiowa, kuweta, spektrofotometr, wirówka,
Etap 1  usunięcie większości chlorofilu, lipidów, wolnych puryn i nukleotydów
Naważkę 300 mg (zapisać dokładną wagę naważki!!) liści pociąć na 2-3 milimetrowe
fragmenty. Do kolby stożkowej o pojemności 250 ml wlać 100 ml 80% etanolu i zakryć folią
aluminiową. Następnie umieścić w wrzącej łaz
ni wodnej i gdy alkohol zacznie wrzeć dodać
stopniowo za pomocą pęsety kawałki liści w taki sposób, aby nie przerwać wrzenia. Kolbę
przykryć folią i ogrzewać przez 4 minuty. Nie doprowadzić do zbyt dużego odparowania
alkoholu!
Etap 2  usunięcie chlorofilu, lipidów, karotenoidów
Zawartość kolby schłodzić pod bieżącą wodą, zdekantować alkoholowy roztwór i odrzucić
(wylać do specjalnie przygotowanego pojemnika na odpad etanolu!!!). Pozostałość przenieść
do moz
dzierza i dokładnie rozetrzeć, dodać 5 ml 95% etanolu i dalej rozcierać. Zawiesinę
przenieść na lejek szklany z gumką i przygotowanym sączkiem  odsączyć alkohol pod słabą
próżnią. Moz
dzierz przepłukać 10 ml 95% etanolu i roztwór przenieść na sączek. Osad na
sączku przemyć dwukrotnie (2 razy po 10 ml) eterem naftowym i odsączyć pod słabym
ciśnienie.
Etap 3  usunięcie rozpuszczalnych nukleotydów
Osad przemyć dwukrotnie (2 razy po 10 ml) schłodzonym 0,2M kwasem nadchlorowym. W
celu usunięcia kwasu osad przemyć dwukrotnie (2 razy po 10 ml) 95% etanolem.
Etap 4  hydroliza RNA do 2 - i 3 -mononukleotydów
Po odsączeniu etanolu wyjąć sączek z osadem, zwinąć, włożyć do probówki wirówkowej,
dodać 5 ml 0,5M wodorotlenku potasu i całkowicie zanurzyć sączek w roztworze. Probówkę
zamknąć i wstawić do łaz
ni wodnej o temperaturze 40oC na godzinę.
Etap 5  wytrącenie DNA, białek, ścian komórkowych
Po wyjęciu z łaz
ni wodnej probówkę umieścić w łaz
ni lodowej na 10 minut (mieszając
zawartość bagietką), następnie dodać 5 ml schłodzonego 1M kwasu nadchlorowego i łagodnie
wymieszać. Pozostawić w łaz
ni lodowej przez 15 minut.
Etap 6  Uzyskanie roztworów oczyszczonych 2 - i 3 -mononukleotydów
Całość wirować 7 minut przy 12 000 obrotach/min, supernant ostrożnie zdekantować do
cylindra o pojemności 10 ml (zapisać objętość!).
Etap 7  pomiary i ilościowe oznaczanie RNA
Do szklanej próbówki pobrać 1 ml roztworu nukleotydów RNA, dodać 3 ml wody, dokładnie
wymieszać i przenieść do kuwety pomiarowej. Zmierzyć absorbancję przy 260 i 300 nm w
spektrofotometrze wyzerowanym na wodę. Ilość RNA obliczyć ze wzoru:
mg RNA = 0,031(A )(rozcieńczenie x ml RNA)
260-A
300
gdzie:
0,031   średnia wartość absorbancji dla nukleotydów w RNA
A , A  zmierzone wartości absorbancji
260 300
rozcieńczenie próbki  w tym przypadku 4 (1 ml + 3 ml)
ml RNA  ilość supernantu po wirowaniu
Zawartość RNA wyrazić w procentach.
1. J.M. Berg, J.L.Tymoczko, L. Stryer, Biochemia, Wydawnictwo PWN, 2005, 117-131
2. J.N. Davidson, Biochemia kwasów nukleinowych, Methuen & Co Ltd., 1969, 111-112