I Wydział Lekarski 20.XI, 27.XI. 2012
II Wydział Lekarski 29.XI. 2012
ĆWICZENIE 11
Badanie wrażliwości bakterii na leki
" Metody określania wrażliwości bakterii na chemioterapeutyki
" Wykrywanie ²-laktamaz bakteryjnych oraz interpretacja uzyskanych wyników
" Szczepy alarmowe
" Kryteria wyboru antybiotyku do leczenia
DO WYKONANIA:
1. Oznaczenie wrażliwości bakterii na chemioterapeutyki metodą dyfuzyjno-krążkową.
2. Określenie MIC - najmniejszego stężenia antybiotyku, hamującego wzrost bakterii (mg/L)
a. metoda rozcieńczeń antybiotyku w podłożu stałym MH (odczytanie i interpretacja)
b. metoda rozcieńczeń antybiotyku w podłożu przy użyciu aparatu VITEK 2 (odczytanie i
interpretacja wyników testu)
c. metoda dyfuzyjna (E-testy) (odczytanie i interpretacja wyników testu)
3. Wykrywanie ESBL (²-laktamaz o rozszerzonym spektrum substratowym) u paÅ‚eczek Gram-
ujemnych - odczytanie i interpretacja wyników testu.
4. Wykrywanie karbapenemaz: MBL (metalo-²-laktamaz), CHDL i KPC (serynowych
karbapenemaz) u pałeczek Gram-ujemnych - odczytanie i interpretacja wyników testu.
5. Wykrywanie HLAR (oporności na wysokie stężenia aminoglikozydów) u Enterococcus spp.-
odczytanie i interpretacja wyników testu.
6. Wykrywanie szczepów metycylino-opornych gronkowców - odczytanie i interpretacja
wyników testu.
7. Wykrywanie indukcyjnej oporności na MLS-B (makrolidy, linkozamidy, streptograminy B) u
gronkowców i paciorkowców- odczytanie i interpretacja wyników testu.
Piśmiennictwo uzupełniające:
1. Dzierżanowska D.:Antybiotykoterapia praktyczna. Alfa Medica Press, 2009
2. Hryniewicz W., Meszaros J.: Antybiotyki w profilaktyce i leczeniu zakażeń. PZWL,
Warszawa, 2004.
3. MÅ‚ynarczyk A., MÅ‚ynarczyk G.: Chemioterapeutyki przeciwbakteryjne i
przeciwgrzybicze. Mechanizmy działania antybiotyków i lekooporności bakterii.
Zasady racjonalnej chemioterapii [w] Wybrane zagadnienia z mikrobiologii jamy
ustnej. [red. M.A
uczak, E. Swoboda-Kopeć] Wyd. Czelej Sp. z.o.o., Lublin, 2004,
rozdział 7, str.91-112.
mgr Marta Kierzkowska
1. METODA DYFUZYJNO-KR
ŻKOWA
Hodowle bakterii: 1. S.aureus 2. E. faecium 3. E.coli 4. P.aeruginosa
Do probówki z solą fizjologiczną dodajemy ezą bakterie pobrane z podłoża stałego (2-3 kolonii) do uzyskania gęstości
identycznej z wzorcem 0,5 w skali McFarlanda (ok. 5 x 105 CFU/ml). Na powierzchnię całej płytki z podłożem
Mueller-Hinton (MH) nanosimy wacikiem do wymazów zawiesinę bakterii i dokładnie rozprowadzamy. Następnie
rozkładamy pęsetą krążki nasączone odpowiednimi antybiotykami. Przed nałożeniem każdego krążka pęsetę należy
wyjałowić zanurzając w alkoholu i opalając w płomieniu. Po nałożeniu krążków płytkę pozostawiamy przez 1/2 godz.
w temp. pokojowej (dyfuzja antybiotyków w podłożu), a następnie przenosimy do 35oC (płytki inkubujemy wieczkiem
do góry). Wynik odczytujemy po 18-24 godzinach. Mierzymy średnice stref zahamowania wzrostu i odczytujemy
wynik z tabeli z kryteriami wrażliwości. Należy wykonać kontrolę każdej serii krążków, oznaczając równolegle
wrażliwość międzynarodowych szczepów referencyjnych (demonstracja).
2.WYKRYWANIE ²-LAKTAMAZ U PAA
ECZEK GRAM-UJEMNYCH (Enterobacteriaceae, pałeczki
²
²
²
niefermentujÄ…ce)
2A O ROZSZERZONYM SPEKTRUM SUBSTATOWYM (ESBL)
Metoda DDST. Stosowane oznaczenia: AMC - amoksycylina z klawulanianem; CAZ -ceftazydym; CTX -
cefotaksym. Wynik dodatni  synergizm (rozszerzenie strefy zahamowania wzrostu) pomiędzy krążkiem z
kwasem klawulanowym a krążkiem z ceftazydymem, cefotaksymem
INTERPRETACJA: Szczepy ESBL(+) są oporne na większość cefalosporyn, penicylin bez inhibitorów,
karbacefemów i monobaktamów. Wg aktualnych norm EUCAST dopuszczalne jest stosowanie w leczeniu zakażeń
szczepami wytwarzającymi ESBL oksy-imino-beta-laktamów na które szczep wg nowych kryteriów oporności (z
roku 2011) wykazuje wrażliwość.
2B KARBAPENEMAZ SERYNOWYCH KPC
Test z kwasem fenyloboronowym
Wynik dodatni: różnica stref zahamowania wzrostu wokół krążka z meropenemem (MEM) i inhibitorem oraz
krążka z samym meropenemem wynosi 5mm lub więcej dla Enterobacteriaceae oraz powyżej 6mm dla pałeczek
niefermentujÄ…cych
2C KARBAPENEMAZ MBL (metaloenzymów)
Wynik dodatni: synergizm (rozszerzenie strefy) pomiędzy krążkiem z EDTA (środkowy krążek) a imipenemem
(IPM) lub ceftazydymem (CAZ)
2D KARBAPENEMAZ CHDL (np. OXA 48)
Metoda dyfuzyjno-krążkowa z temocylinÄ… 30µg (TEM)
Wynik dodatni: brak strefy zahamowania wzrostu 6mm
3. WYKRYWANIE SZCZEPÓW HLAR (HLGR i HLSR) PACIORKOWCÓW KAA
OWYCH (wysoka
oporność na aminoglikozydy)
Strefy zahamowania wzrostu wokół krążków z gentamycyną (GM30) i/lub streptomycyną (S300):
Oporność HLGR< 8 mm, HLSR<19 mm
INTERPRETACJA: Rodzaj Enterococcus wykazuje naturalną oporność na aminoglikozydy i cefalosporyny
(wyjątek: ceftobiprol), a wiele szczepów wykazuje tolerację (brak działania bakteriobójczego) w stosunku do
penicylin w zakażeniach szczepami HLAR(-) i wrażliwymi na aminopenicyliny (najczęściej E.faecalis) można
stosować leczenie skojarzone np aminopenicylina + aminoglikozyd
4 WYKRYWANIE SZCZEPÓW MRSA i MR-CNS. Kryteria:
wrażliwy oporny
CEFOKSYTYNA FOX30 S.aureus i S.lugdunensis
e"22 d"21
Pozostałe CNS
e"25 d"24
INTERPRETACJA: MRSA i MR-CNS sÄ… oporne na wszystkie antybiotyki beta-laktamowe (penicyliny,
cefalosporyny (wyjÄ…tek. ceftobiprol, ceftarolina), karbapenemy, karbacefemy, monobaktamy, inhibitory beta-
laktamaz)
5.WYKRYWANIE INDUKCYJNEJ OPORNOÅšCI NA MLS-B (MAKROLIDY, LINKOZAMIDY,
STREPTOGRAMINY B)
Test wykonuje się u szczepów gronkowców i paciorkowców opornych na makrolidy (pierścień 14 lub 15
członowy np erytromycynę) a wrażliwych na pozostałe MLS-B (np klindamycynę). U szczepów o indukcyjnej
oporności na MLS-B (indukcja+) strefa zahamowania wzrostu wokół krążka z linkomycyną (MY15) i
klindamycyną (CC2) zmniejsza się (spłaszcza się) od strony krążka z erytromycyną (E15).
INTERPRETACJA: W stosunku do gronkowców i paciorkowców MLS-B indukcja+ nie należy stosować
klindamycyny (w trakcie leczenia mogą powstać warianty oporne).
6.WYKRYWANIE SZCZEPÓW ALARMOWYCH (kryteria wg EUCAST 2011):
S.aureus: MRSA-metycylinooporne S.aureus. Kryterium: oporność na cefoksytynę (MIC>4 mg/L)
VISA- średniowrażliwe na wankomycynę S.aureus
VRSA wankomycyno-oporne S.aureus (MIC>2 mg/L)
LRSA linezolido-oporne S.aureus (MIC>4 mg/L)
Enterococcus spp :VRE -wankomycyno-oporne Enterococcus spp (MIC 4 mg/L)
LRE linezolido-oporne Enterococcus spp (MIC 4 mg/L)
S.pneumoniae : PRSP -penicylino-oporne S.pneumoniae (MIC>2 mg/L)
pałeczki Enterobacteriaceae syntetyzujące ESBL
pałeczki Gram-ujemne (Enterobacteriaceae, P.aeruginosa, Acinetobacter spp): oporne na karbapenemy