I. ELEKTROFOREZA  OPIS FIZYCZNY
ELEKTROFOREZA - metoda analizowania i rozdzielania koloidów, wykorzystująca ruch
naładowanych cząstek koloidowych w polu elektrycznym.
Wielkością referencyjną występującego zjawiska jest ruchliwość elektroforetyczna, która określa
prędkość przemieszczania się cząstek na jednostkę natężenia pola:
(1)
u - ruchliwość elektroforetyczna (C·s/kg)
v -prędkość cząstki (m/s)
E - natężenie pola elektrycznego (N/C)
lub uwzględniając wielkości dostępne w pomiarach :
(2)
gdzie:
s- droga migracji czÄ…stki [m]
l- długość nośnika podziału [m]
t- czas trwania elektroforezy [s]
U- przyłożona różnica potencjałów
Elektroforezę przeprowadza się stosując natężenie pola w zakresie do 10 V/m (elektroforeza
niskonapięciowa) lub w warunkach chłodzenia przy natężeniu pola około 100V/m (elektroforeza
wysokonapięciowa).
Analizę zjawiska elektroforezy można przeprowadzić na przykładzie analogii do spadku bańki
mydlanej w powietrzu. W tym przypadku mamy do czynienia z obiektem sferycznym o promieniu a
poddanemu działaniu siły grawitacyjnej Fg
(3)
Fg - siła grawitacyjna (N)
m - masa bańki (kg)
g - przyspieszenie ziemskie (m/s2)
Przy założeniu, że jest to jedyna działająca siła bańka będzie poruszać się ruchem jednostajnie
przyspieszonym. Ale obserwacja pokazuje, że tak w rzeczywistości nie jest. Istnieje siła tarcia Ft
przeciwdziałająca sile grawitacyjnej, związana z lepkością powietrza. Siła ta zwiększa się z prędkością
v bańki i jej wartość opisuje prawo Stokes'a :
(4)
F - siła tarcia (N)
· - lepkość powietrza
a - przyspieszenie (m/s2)
v - prędkość (m/s)
1
W czasie przyspieszania bańka osiągnie pewien punkt, w którym Ft zrówna się z Fg . Potem nie
obserwuje się dalszego przyspieszania i bańka porusza się ze stałą prędkością Vt, którego wartość jest
zdeterminowana warunkiem Fg + Ft = 0 i przedstawia się następująco:
(5)
Vt - prędkość bańki (m/s)
m - masa bańki (kg)
· - lepkość powietrza
a - przyspieszenie (m/s2)
u - ruchliwość elektroforetyczna (C·s/kg)
g - przyspieszenie ziemskie (m/s2)
Zamiast siÅ‚y grawitacyjnej Fg = m·g [m.- masa czÄ…stki (g), g- przyciÄ…ganie ziemskie (m/s)]
przyjmujemy siÅ‚Ä™ elektrycznÄ… Fe = Q·E [Q- Å‚adunek elektryczny (C), Ee - natężenie pola elektrycznego
(N/C)]. Możemy zatem przypuszczać, że wzór na prędkość dla cząstki naładowanej w polu
elektrycznym będzie się przedstawiał następująco:
(6)
· - lepkość powietrza
a - przyspieszenie (m/s2)
Q - Å‚adunek czÄ…stki (C)
E - natężenie pola elektrycznego (N/C)
Nie jest to poprawne ze względu na chmurę jonów otaczających naładowaną cząstkę. Ta chmura ma
ładunek przeciwny, ale równy co do wartości ładunkowi cząstki i pod wpływem zewnętrznego pola
elektrycznego przemieszcza siÄ™ w przeciwnym kierunku. Energia zwiÄ…zana z przemieszczajÄ…cÄ… siÄ™
chmurą jest częściowo przekazywana do otaczającego ją środowiska, a więc również do naładowanej
cząstki. Przyjmując za punkt odniesienia poruszającą się cząstkę, możemy zauważyć nieruchomą sferę
z roztworem elektrolitu opływającym ją z prędkością - Vt. Zilustrowano to na rysunku 1, gdzie
przyjęto , że cząstka przenosi ładunek dodatni , a natężenie ma zwrot w prawo. Dla przypadku cząstki
naładowanej ujemnie natężenie ma zwrot przeciwny.
Rys. 1 Model przepływu elektrolitu wokół naładowanej cząstki.
2
II. ELEKTROFOREZA KWASÓW NUKLEINOWYCH
Elektroforeza jest obecnie jedną z głównych metod identyfikacji, rozdzielania i oczyszczania
kwasów nukleinowych. Do rozdzielania dużych cząsteczek DNA stosuje się elektroforezę w żelu
agarozowym. Do rozdzielania małych fragmentów DNA stosuje się elektroforezę w żelu
poliakrylamidowym. W wersji podstawowej są to proste i szybkie techniki, umożliwiające
rozdzielenie mieszaniny różnych fragmentów DNA. Prążki DNA w żelu barwi się przy użyciu bardzo
małych stężeń barwnika fluoryzującego  np. bromku etydyny, wbudowującego się między zasady
(interkalacja). Już nawet kilkadziesiąt ng DNA można wykryć bezpośrednio w żelu w świetle lampy
UV.
A. Elektroforeza w żelu agarozowym.
Agaroza - polisacharyd rozpuszczony w roztworze wodnym tworzy stały żel. Jest to frakcja agaru
oczyszczona z krasnorostów. Polisacharyd ten zbudowany jest z około 800 liniowo połączonych reszt
heksozy (inaczej 400 reszt agarobiozy). Agarobioza to dwucukier zbudowany z D-galaktozy i 3,6-
anhydro-L-galaktozy. Powstawanie żelu agarozowego jest reakcją odwracalna, w wyniku której
pojedyncze, losowo zwinięte łańcuchy układają się w dwuniciową, helikalną strukturę III-rzędową.
A
ańcuchy te rozgałęziając się tworzą sieć. Wielkość porów żelu agarozowego zależy od stężenia
agarozy i określa zakres ciężaru makrocząsteczek np. DNA czy RNA, które można w niej
elektroforetycznie rozdzielać.
Elektroforeza w żelu agarozowym prowadzona jest w aparatach ustawionych poziomo (Rys.2). Próbki
DNA umieszczane są w kieszonkach formowanych w żelu, włączane jest z
ródło prądu i DNA może
się przemieszczać poprzez żel w osobnych ścieżkach. Cząsteczka DNA jest naładowana ujemnie w
środowisku obojętnym i alkalicznym, a więc umieszczona w polu elektrycznym, przemieszcza się w
kierunku anody.
Rys.2 Aparat do elektroforezy w żelu agarozowym.
Kiedy poddamy żel działaniu pola elektrycznego w obecności buforu, który przewodzi prąd
elektryczny, fragmenty DNA migrują w żelu w kierunku elektrody dodatniej (DNA ma silny ładunek
ujemny) z szybkością zależną od ich wielkości i kształtu. Proces ten może być zatem wykorzystywany
do rozdzielenia mieszaniny fragmentów DNA o różnej wielkości (Rys.3).
3
Rys.3 Rozdzielanie mieszaniny fragmentów DNA o różnej wielkości.
Małe liniowe fragmenty poruszają się szybciej niż większe, których ruch jest silniej hamowany przez
plątaninę włókien agarozy tworzących żel. Szybkość, z jaką przesuwa się w żelu cząsteczka DNA jest
odwrotnie proporcjonalna do jej masy cząsteczkowej. Umieszczenie w niektórych studzienkach
fragmentów DNA o znanej wielkości (tzw. wzorców DNA) pozwala na dokładny pomiar masy
cząsteczkowej badanych fragmentów. Dodany do próbek barwnik (najczęściej błękit bromofenolowy)
pozwala na śledzenie przebiegu elektroforezy. DNA uwidaczniane jest za pomocą stosowanego
rutynowo bromku etydyny, który interkaluje pomiędzy sąsiednie pary dwuniciowego DNA (Rys.4)
(powinowactwo EtBr do jednoniciowego DNA jest znacznie słabsze). Po wzbudzeniu światłem
nadfioletowym barwnik ten intensywnie fluoryzuje, emitując światło o pomarańczowym zabarwieniu.
Należy pamiętać, że obecność związku interkalującego do DNA w żelu agarozowym zmniejsza
ruchliwość elektroforetyczną DNA o około 15%. Innym barwnikiem DNA jest np. SYBR Green,
którego czułość barwienia dwuniciowego DNA jest około 25 razy większa niż EtBr.
Rys.4 Związany z DNA bromek etydyny fluoryzujący w świetle UV.
Wielkość liniowych fragmentów DNA o nieznanej masie można również ustalić na podstawie krzywej
wzorcowej, sporządzonej dla fragmentów DNA o znanej długości (tzw. wzorców DNA; patrz Rys.6).
Krzywa kalibracyjna przedstawia zależność między długością tych fragmentów (pz) a odległością
przebytą przez nie podczas elektroforezy (mm). Porównując ruchliwość elektroforetyczną wzorców (w
żelu o tej samej procentowości) z ruchliwością nieznanego fragmentu DNA można na podstawie
wykresu oszacować z dość dużą dokładnością jego długość.
4
Szybkość elektroforetycznej migracji DNA w żelu agarozowym jest zależna od następujących
parametrów:
1. Masa cząsteczkowa DNA: cząsteczki liniowe migrują w żelu z szybkością, która jest
proporcjonalna do log10 z ich masy czÄ…steczkowej.
2. Stężenie agarozy: dany fragment DNA o określonej wielkości migruje z różną szybkością w
żelu zawierającym rożne stężenia agarozy. Istnieje liniowa zależność pomiędzy logarytmem
elektroforetycznej ruchliwoÅ›ci DNA w żelu (µ) i stężeniem agarozy (Å‚), która jest wyrażona
równaniem:
logµ=logµ0 - Kr Å‚
gdzie µ0 jest swobodnÄ… elektroforetyczna ruchliwoÅ›ciÄ… DNA, a Kr oznacza współczynnik
spowalniania (const.), który jest związany z właściwościami żelu oraz z wielkością i kształtem
migrujących cząsteczek. Dlatego przy użyciu żeli o różnym stężeniu agarozy możliwy jest
rozdział fragmentów DNA o bardzo szerokim zakresie wielkości cząsteczek (mas
cząsteczkowych) (Tab.1). Wadą elektroforezy w żelu agarozowym jest natomiast słaba
rozdzielczość frakcji DNA różniącego się o mniej niż 5% wielkości.
Stężenie Zakres długości
agarozy rozdzielanego
w żelu (%) liniowego DNA
(wielkość w tys. par zasad)
[z ang. kb]
0,3 5-60
0,6 1-20
0,7 0,8-10
0,9 0,5-7
1,2 0,4-6
1,5 0,2-3
2,0 0,1-2
Tab.1 Zakres rozdziału linearnego DNA w zależności od stężenia agarozy w żelu.
3. Konformacja DNA: forma I - superzwinięte (CCC), forma II  nacięte koliste (OC) i forma
III- liniowe (L) cząsteczki DNA o tej samej masie migrują w żelu z różną szybkością.
Względna ruchliwość tych trzech form zależy głównie od stężenia agarozy w żelu oraz od
wielkości przyłożonego natężenia prądu, siły jonowej buforu i od gęstości superhelikalnych
skrętów w cząsteczce DNA formy I. W pewnych warunkach DNA formy I migruje szybciej
niż forma III, w innych warunkach kolejność może być odwrócona. Dość dobrą metodą dla
identyfikacji rożnych konformacyjnych form DNA jest rozdział elektroforetyczny w
obecności wzrastającej ilości bromku etydyny. Przy wzroście stężenia bromku etydyny więcej
barwnika wiąże się z DNA. Skręty cząsteczki DNA formy I są sukcesywnie likwidowane , a
szybkość migracji cząsteczek ulega zwolnieniu. Przy krytycznym stężeniu barwnika szybkość
migracji cząsteczki DNA w formie I osiąga swoją minimalna wielkość. Jeżeli stężenie bromku
będzie nadal zwiększane, powstają skręty przeciwnej orientacji, a ruchliwość DNA formy I
zwiększa się szybko. Ruchliwość formy II i III zmniejsza się w różny sposób w wyniku
neutralizacji ładunków i dużej sztywności nadawanej cząsteczce DNA przez bromek etydyny.
Dla większości rozdziałów cząsteczek formy I DNA krytyczne stężenie wolnego bromku
etydyny mieÅ›ci siÄ™ w zakresie 0,1-0,5 µg/ml.
4. Natężenie pola elektrycznego: przy niskim natężeniu pola, migracja fragmentów liniowych
DNA jest proporcjonalna do przyłożonego napięcia. Jednakże przy wzroście natężenia pola
elektrycznego ruchliwość fragmentów DNA o dużej masie cząsteczkowej nie wzrasta w
sposób proporcjonalny. Dlatego efektywny zakres rozdziału w żelu agarozowym zmniejsza się
ze wzrostem napięcia. Aby uzyskać maksymalny rozdział fragmentów DNA, natężenie pola
nie powinno przekraczać 5V/cm.
5
5. Skład buforu do elektroforezy: ruchliwość elektroforetyczna DNA jest zależna od składu i
siły jonowej buforu, w którym przeprowadzamy elektroforezę. W roztworach o niskiej sile
jonowej, DNA migruje bardzo wolno, natomiast w buforach o zbyt wysokiej sile jonowej (np.
10x stężony bufor do elektroforezy) przepływ ładunku powoduje wydzielenie się znacznej
ilości ciepła, co może doprowadzić do upłynnienia żelu i denaturacji DNA. Do elektroforezy
dwuniciowych cząsteczek stosuje się kilka rodzajów buforów (Tab.2). Zawierają one m.in.
EDTA i Tris (pH 7.5-7.8).
Bufor Skład buforu (na litr)
Tris-octanowy (TAE) 4.84 g Tris
1.142 ml 99% kwasu octowego
2 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0
Tris-boranowy (TBE) 10.8 g Tris
5.5 g kwasu borowego
4 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0
Tris-fosforanowy 10.8 g Tris
(TPE) 1.55 ml 85% kwasu fosforowego
4 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0
Alkaliczny 5 ml 10N NaOH
2 ml 0.5 M EDTA, pH 8.0
Tab.2 Skład buforów stosowanych do elektroforezy DNA.
Bufor alkaliczny używany jest podczas elektroforezy zdenaturowanych, jednoniciowych
czÄ…steczek DNA. Bufory sporzÄ…dzane sÄ… jako skoncentrowane roztwory (10x) i
przechowywane w temperaturze pokojowej. Najczęściej stosuje się bufor TAE. Bufor ten ma
raczej niską pojemność buforową i tendencję do rozkładu podczas przedłużającej się
elektroforezy. W takim przypadku roztwór w pobliżu anody zakwasza się i jeśli proces
postępuje dalej obejmując żel, może dojść do degradacji rozdzielanego DNA. Prążki DNA
ulegają wówczas rozmyciu i przestają być widoczne. Dlatego podczas dłuższej elektroforezy,
przy wysokim napięciu, niezbędna jest wymiana buforów przyelektrodowych. Bufory TBE i
TPE są trochę droższe od TAE, ale posiadają znacznie wyższą pojemność buforową. W
buforze TAE niezbędne jest przeciętnie dwukrotnie wyższe natężenie prądu do uzyskania
takiego samego napięcia co w buforze TBE. Jeśli więc elektroforeza przeprowadzana jest przy
stałym natężeniu prądu, migracja fragmentów DNA powinna być szybsza w buforze TBE.
Temperatura
Skład buforu EndoRStop
przechowywania
Tris-HCl (pH 8.0) 100 mM
Glicerol 30%
SDS 0.5%
4oC
EDTA (pH 8.0) 100 mM
błękit bromofenolowy 0.02%
ksylen cyjanu FF 0.02%
Tab.3 Skład buforu do nanoszenia próbek DNA w studzienki żelu.
Elektroforetyczna ruchliwość DNA w żelach agrozowych, w przeciwieństwie do żeli
poliakrylamidowych, nie zmienia się w istotny sposób w zależności od składu zasad ani od
temperatury (w zakresie 4oC-30oC), w której zachodzi elektroforetyczny rozdział. W zasadzie
rozdziały elektroforetyczne przeprowadza się w temperaturze pokojowej. Należy jednak
pamiętać, że żele zawierające mniej niż 0,5% agarozy są raczej kruche i lepiej jest w takim
6
przypadku prowadzić rozdział w temperaturze 4oC, co zapewnia większą sztywność żelu. Do
nanoszenia próbek DNA do studzienek żelu służą odpowiednie bufory  obciążające (skład
buforu używanego podczas ćwiczeń podano w Tabeli 3). Bufory te zwiększają gęstość próbek,
zapewniając dobre umiejscowienie DNA w studzience bez dyfuzji, a także zabarwiają próbkę
powodując migrację barwnika w żelu w czasie elektroforezy, ułatwiając w ten sposób łatwe
śledzenie prawidłowości rozdziału.
B. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym (PAGE).
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest wykorzystywana do rozdzielania i analizy małych
fragmentów DNA. Najlepszy rozdział uzyskuje się dla DNA o długości mniejszej niż 1000 par zasad
(pz). W żelach tych można efektywnie rozdzielać także jednoniciowe fragmenty DNA lub RNA.
Wyizolowane z żeli fragmenty mogą być użyte w klonowaniu, sekwencjonowaniu i znakowaniu np.
radioaktywnym fosforem.
Żel poliakrylamidowy powstaje w wyniku polimeryzacji monomerów akryl amidowych w długie
łańcuchy, które następnie są łączone kowalencyjnie przez N,N -metylenobisakrylamid. Polimeryzacja
żelu poliakrylamidowego jest inicjowana przez wolne rodniki dostarczane przez nadsiarczan amonu i
stabilizowane przez TEMED (N,N,N ,N  tetrametylenodiamina). Reakcja trwa około 10-20 minut,
lecz ten czas może różnić się w zależności od stężeń nadsiarczanu amonu i TEMEDu. Stopień
usieciowania żelu (udział % N,N -metylenobisakrylamidu) stanowi czynnik wpływający na
rozdzielenie fragmentów jednoniciowego DNA. Wielkość porów w żelu poliakrylamidowym zależy
od procentowej zawartości akrylamidów. Odpowiednia procentowość żelu może być dobrana dla
określonego zakresu wielkości fragmentów DNA (Tab. 4). Jeżeli chcemy rozdzielić fragmenty
charakteryzujące się szerokim zakresem wielkości, można zastosować żel gradientowy. W takim żelu
wielkość porów jest większa u góry (przy studzienkach), zmniejszając się gradientowo w kierunku do
dołu żelu.
Elektroforeza w żelach poliakrylamidowych przeprowadzona jest w aparaturze ustawionej pionowo, a
więc migracja cząsteczek jest zgodna z kierunkiem siły ciążenia, gdzie jednoniciowe DNA
charakteryzują się spowolnioną, w stosunku do dwuniciowego DNA, migracją w żelu. Rozdział
elektroforetyczny prowadzony jest w buforze 1x TBE (Tab.2). Rozdzielenie fragmentów
przeprowadza się zazwyczaj przy 5 V/cm. Przebieg elektroforezy można śledzić na podstawie migracji
barwników w żelu (Tab.4). DNA w żelu poliakrylamidowym można wybarwiać za pomocą np. EtBr
lub SybrGold.
Wielkość Fragment komigrujący Fragment
%
rozdzielanych z błękitem komigrujący z
akrylamidów
fragmentów [pz] bromofenolowym [pz] ksylenem cyjanu [pz]
3.5 100-1000 100 450
5.0 100-500 65 250
8.0 60-400 45 150
12.0 50-200 20 70
20.0 5-100 12 45
Tab. 4 Wpływ stężenia akrylamidów na zakres rozdzielania fragmentów DNA.
Żele poliakrylamidowe mają przewagę nad żelami agarozowymi z kilku przyczyn:
1. Zdolność rozdzielcza żeli poliakrylamidowych jest tak duża, że można rozdzielać cząsteczki
różniące się o 1 pz.
2. Studzienkę żelu poliakrylamidowego można załadować znacznie większa ilością DNA niż w
żelu agrozowym .
3. DNA odzyskany z żelu poliakrylamidowego jest pozbawiony zanieczyszczeń, mogących
hamować aktywność enzymów używanych w klonowaniu, sekwencjonowaniu lub
znakowaniu DNA.
7
Najważniejszym parametrem efektywnego rozdzielania małych fragmentów DNA elektroforezą
poliakrylamidową jest sama reakcja polimeryzacji żelu. Ważne jest używanie wysokiej jakości
odczynników (ang. electrophoresis-grade). Akrylamidy i bisakrylamidy stosunkowo łatwo ulegają
rozkładowi w roztworach do kwasu akrylowego, który wpływa na ruchliwość cząsteczek
przechodzących przez matrix żelu. Roztwory akryl amidów powinny być chronione przed
światłem i nie powinny być przechowywane dłużej w roztworach niż kilka miesięcy. Nadsiarczan
amonu jest stabilny w roztworach tylko przez tydzień w temperaturze 4oC. Płyty szklane, do
których wylewamy roztwór akryl amidów, muszą być czyste, ażeby uniknąć tworzenia się
pęcherzyków w żelu w czasie wylewania. Jednym z często spotykanych problemów rozdzielania
jest rożną ruchliwość elektroforetyczna fragmentów DNA zlokalizowanych na brzegach (szybsza
migracja zachodzi w środku żelu niż na brzegach). Powodem jest nierównomierne rozchodzenie
się ciepła w żelu: brzegi są chłodniejsze niż środek i próbki migrują szybciej w wyższej
temperaturze. Można tego uniknąć przez zastosowanie rozdziału przy niskim napięciu lub
zastosowaniu aparatu zaopatrzonego w system chłodzący albo płytę metalowa rozprowadzającą
ciepło równomiernie w żelu. Przygotowywanie żeli poliakrylamidowych jest mniej wygodne i
bardziej czasochłonne od przygotowania żeli agarozowych. Dlatego warto przygotować sobie
więcej żeli jednocześnie. Mogą one być przechowywane nawet przez kilka tygodni bez wpływu na
jakość rozdziału.
C. Trawienie DNA enzymami restrykcyjnymi.
Enzymy restrykcyjne (nazywane też endonukleazami restrykcyjnymi lub REazami) to precyzyjne
molekularne  skalpele za pomocą których można manipulować odcinkami DNA. Enzymy te
rozpoznajÄ… specyficzne sekwencje zasad w dwuniciowej helisie DNA i rozcinajÄ… obie nici DNA w
ściśle określonych miejscach. Pozostawiają one grupę fosforanową na końcu 5', a grupę OH na końcu
3' cząsteczki DNA Rozcinając DNA tworzą tępe końce lub końce wystające od strony 3' lub 5', które
są znane pod nazwą końców kohezyjnych lub lepkich.
REazy są niezastąpione w badaniach struktury chromosomów, sekwencjonowania bardzo długich
cząsteczek DNA, izolowaniu genów i tworzeniu nowych cząsteczek DNA, nadających się do
klonowania. Odkrycie i zastosowanie endonukleaz restrykcyjnych w latach sześćdziesiątych i
wczesnych siedemdziesiątych było kluczowym dokonaniem, dzięki któremu stało się możliwe cięcie
DNA. Enzymy restrykcyjne wykorzystuje siÄ™ do rozcinania czÄ…steczek DNA na specyficzne
fragmenty, które poddają się analizie i różnego rodzaju manipulacjom o wiele łatwiej niż długa
cząsteczka wyjściowa. Fragment uzyskany w wyniku działania jednego enzymu restrykcyjnego może
zostać specyficznie pocięty na mniejsze fragmenty przez inny enzym. Obraz takich fragmentów może
stanowić  odcisk palca cząsteczki DNA (ang. DNA fingerprint). Stosując wiele enzymów
restrykcyjnych można sporządzić mapy chromosomów, zbudowanych z setek milionów par zasad.
Do tej pory oczyszczono i scharakteryzowano 3805 REaz, wykazujących 262 specyficzności. 3698 z
nich to REazy typu II, a 611 jest dostępnych komercyjnie. Nazwy REaz składają się z trzyliterowego
skrótu nazwy organizmu, z którego pochodzą (np. Eco od Escherichia coli), za którym następuje
oznaczenie szczepu (o ile jest to konieczne) oraz numer enzymu podany cyframi rzymskimi (jeśli dany
szczep produkuje więcej niż jeden enzym restrykcyjny). Informacje na temat wszystkich znanych
REaz można znalez
ć w bazie danych REBASE (ang. Restriction Enzyme Database;
http://rebase.neb.com).
Enzymy restrykcyjne występują u wielu prokariotów. Ich biologiczna rola polega na rozcinaniu
obcych cząsteczek DNA. Komórkowy DNA gospodarza nie jest przez nie degradowany, ponieważ
miejsca rozpoznawane przez własne enzymy restrykcyjne są zmetylowane. Wiele enzymów
restrykcyjnych rozpoznaje specyficzne sekwencje czterech do ośmiu par zasad i hydrolizuje wiązanie
fosfodiestrowe w obu niciach DNA rozpoznawanego regionu. CharakterystycznÄ… cechÄ…
rozpoznawanych miejsc jest symetria obrotowa. Innymi słowy, rozpoznawana sekwencja jest
palindromiczna, czyli odwrotnie powtórzona, a miejsca rozcinania łańcuchów DNA są usytuowane
symetrycznie. Rozcięcie DNA może przebiegać ukośnie (powstają tzw.  lepkie końce, jak na Rys.5)
8
lub równo (powstają tzw.  tępe końce DNA).  Lepkie końce mogą się póz
niej łączyć przez
oddziaływania między tworzącymi pary zasadami (hybrydyzację) jednoniciowych krótkich
fragmentów z końcami innych cząsteczek DNA, mających taką samą wystającą sekwencję.
Rys. 5
Działanie endonukleaz restrykcyjnych zilustrowane na przykładzie enzymu restrykcyjnego
HindIII.
Trawienie plazmidu lub genomowego DNA przeprowadza siÄ™ na skalÄ™ preparatywnÄ… lub analityczna
używając dostępnych w handlu enzymów restrykcyjnych i buforów. Znając sekwencję substratowego
DNA można za pomocą odpowiednich programów przewidzieć wielkości otrzymywanych w wyniku
reakcji trawienia daną REazą fragmentów restrykcyjnych (np. http://rebase.neb.com; Rebase Tools;
Theoretical digest with all REBASE prototype.) .
Wszystkie enzymy restrykcyjne wymagają Mg2+, zwykle w stężeniach dochodzących do 10 mM, lecz
różne enzymy wymagają do optymalnej aktywności różnego pH, stężenia NaCl lub obecności innych
składników buforu.
Trawienie kilkuset nanogramów plazmidowego DNA wystarcza aby produkty trawienia można było
analizować poprzez elektroforezę w żelu agarozowym (Rys.6).
W skali preparatywnej używa się kilku mikrogramów DNA. DNA jest inkubowany w obecności
enzymu w odpowiednim buforze w optymalnej temperaturze (zwykle 37oC, ale wykorzystywane sÄ…
też REazy termofilne, które wykazują maksymalną aktywność w temperaturze powyżej 60oC),
zazwyczaj w objÄ™toÅ›ci 20 µl. Po zakoÅ„czeniu inkubacji do próby dodawany jest barwnik (np.
EndoRStop, Tab.3). Następnie próbka jest ogrzewana przez 5 minut w 55oC w celu inaktywacji
enzymu. Tak przygotowaną próbkę nanosi się na żel agarozowy o odpowiednio dobranej
procentowości.
9
 A. B.
Nr fragmentu Długość Masa DNA
DNA [pz] [ng]
1 622 143
2 527 121
3 404 93
4 307 70
5 242 55
6 238 55
7 217 50
8 201 46
9 190 44
10 180 41
11,12 160 74
13,14 147 68
15 123 28
16 110 25
17 90 21
18 76 17
19 67 15
20,21 34 16
22,23 26 12
24 15 3
25,26 9 4
Rys. 6
A. Trawienie 0.5 µg plazmidowego DNA pBR322 endonukleazÄ… restrykcyjnÄ… MspI.
(żel agarozowy 1.8%; ang. base pairs  pary zasad).
B. Przybliżona masa DNA każdego prążka przy zaÅ‚ożeniu naniesienia na żel 1 µg DNA.
III. ELEKTROFOREZA POLIAKRYLAMIDOWA BIAA
EK W WARUNKACH
DENATURUJ
CYCH (SDS-PAGE).
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym jest użyteczną i powszechnie stosowaną metodą
rozdziału i charakterystyki białek. Jest to stosunkowo prosta i szybka technika. Na jednym żelu
można przeprowadzić jednocześnie analizę wielu próbek, a rozdzielane białka można skutecznie
wykrywać w żelu np. metodami barwienia, immunoprecypitacji czy autoradiografii. Można więc
stosować tę technikę na przykład przy analizie białek we frakcjach zbieranych w trakcie rozdziału
na kolumnie chromatograficznej.
Żel poliakrylamidowy powstaje w wyniku reakcji polimeryzacji akrylamidu z N, N -metyleno-bis-
akrylamidem. Gęstość żelu zależy od całkowitego stężenia obu składników, natomiast stopień
usieciowania zależy od stężenia bis-akrylamidu. Reakcja polimeryzacji jest katalizowana przez
odpowiedni system oksydo-redukcyjny: N, N, N , N -czterometylo-etylenodwuaminÄ™ (TEMED) i
nadsiarczan amonu. Utworzony żel służy jako nośnik do rozdziału elektroforetycznego,
funkcjonując jednocześnie jak sito molekularne, co wpływa na skuteczny rozdział
makrocząsteczek. Wielkość porów tego sita uwarunkowana jest zarówno przez stężenie akryl
amidu (ze wzrostem stężenia wielkość porów maleje), jak i poprzez stopień usieciowania.
Wielkość ta musi być właściwie dobrana do wielkości rozdzielanych cząsteczek. Najczęściej
używa się żeli o stężeniu akryl amidu 7.5%-10%, lecz przy rozdziale cząsteczek bardzo dużych
(rzędu 100 kDa), stosuje się żele o bardzo niskim stężeniu akryl amidu, nawet 2,55. Do rozdziału
bardzo małych białek (m.cz. rzędu 2000 Da) używa się żeli zawierających 20% a nawet 30%
10
akrylamidu. Ze wzrostem czynnika sieciującego wielkość porów również maleje; stężenie to
decyduje także o własnościach mechanicznych żelu, jego elastyczności i przejrzystości.
Żel poliakrylamidowy może być formowany w rurkach lub jako żel płytowy o grubości
najczęściej 0.75-1.5 mm. Ze względu na możliwość naniesienia jednocześnie na jeden żel wielu
próbek, obecnie preferowana jest forma płytowa. Najczęściej stosuje się elektroforezę w tzw. żelu
nieciągłym, w którym próbkę nanosi się na żel zagęszczający (o dużych porach) spolimeryzowany
na wierzchu żelu rozdzielającego (o małych porach). W tej technice bufor używany jako bufor
elektrodowy oraz bufory wchodzące w skład obu żeli różnią się składem i pH. Zaletą tego systemu
jest koncentracja białek podczas wędrówki przez żel zagęszczający, co powoduje, że niezależnie
od objętości próbki białka wchodzą w żel rozdzielający w postaci wąskiego, zatężonego pasma.
Użycie anionowego detergentu siarczanu dodecylu (SDS)- pozwala na rozdział elektroforetytczny
białek zgodnie z ich masą cząsteczkową. Przed i w trakcie elektroforezy białka ulegają dysocjacji i
denaturacji w obecności SDS, przy czym większość cząsteczek białkowych wiąże określoną ilość
SDS (około 1.4 g na 1 g białka), co nadaje im jednolity ładunek elektryczny. 1 anion SDS
przypada na 2 reszty aminokwasowe, czyniąc nieistotnym ładunek natywny białka. W rezultacie
czynnikiem decydującym szybkości poruszania się białek w trakcie elektroforezy jest długość
polipeptydu, a zatem pośrednio masa cząsteczkowa. Dzięki możliwości rozdziału białek na
podstawie ich wielkości możemy oznaczyć masę cząsteczkową nieznanego białka, porównując
jego położenie w żelu w stosunku do innych białek (tzw. białek wzorcowych) po zakończonej
migracji i wybarwieniu.
Próbki nanosi się na żel po 5 minutowym ogrzaniu w 100oC (we wrzącej łaz
ni wodnej lub w bloku
grzejnym) w buforze denaturującym. Wchodząca w skład buforu denaturującego sacharoza
obciąża próbki, ułatwiając ich umieszczenie w studzience. W obecności SDS i czynnika
redukujÄ…cego wiÄ…zania dwusiarczkowe (²-merkaptoetanolu) biaÅ‚ek ulegajÄ… denaturacji
(rozdzielają się na podjednostki) a ich wiązania niekowalencyjne ulegają rozkładowi. Początkowo
rozdział prowadzi się przy małym napięciu (60 V), aby białka jak najlepiej weszły w pory żelu.
Następnie zwiększa się napięcie (do 120 V), przyspieszając przepływ białek. Rozdział prowadzi
się w buforze glicynowym. Odpowiednie napięcie wraz z użyciem żelu o mniejszym stężeniu
akrylamidów w stosunku do żelu dolnego pozwala na zagęszczenie próbek. Efekt taki uzyskujemy
dzięki glicynie i jonom chlorkowym zawartym w buforze elektrodowym. Glicyna w pH 6.8
górnego żelu (wyższym od jej punktu izoelektrycznego pI 6.3) przyjmuje ładunek lekko ujemny.
W porównaniu z silnym ładunkiem ujemnym Jomów chlorkowych i białka (dzięki obecności
SDS) jest to Å‚adunek znikomy. Glicyna jako czÄ…steczka o najmniejszym Å‚adunku wypadkowym
ujemnym wędruje więc najwolniej ku anodzie. Przed nią przemieszczają się białka poprzedzone
przez jony chlorkowe, charakteryzujące się dużą ruchliwością elektroforetyczną. Takie
rozmieszczenie w żelu migrujących cząsteczek powoduje zagęszczenie próbki. Dzięki temu
naniesione białka wchodzą równocześnie w żel dolny. Przejście białek z żelu górnego do dolnego
rozpoczyna proces ich właściwego rozdziału. Żel dolny, poza stężeniem akryl amidów, a co się z
tym wiąże wielkością porów, różni się od żelu górnego również pH, które wynosi 8.8. Takie pH
jest znacznie wyższe od pI glicyny, co powoduje, że wypadkowy ładunek aminokwasu staje się
bardziej ujemny (wraz ze zmniejszeniem liczby jonów H+ zwiększa się ilość cząsteczek glicyny ze
zjonizowanymi grupami karboksylowymi). Zmiana Å‚adunku glicyny jest przyczynÄ… zmiany
opisanej wcześniej kolejności migracji. Białka wędrują za jonami chlorkowymi i glicyną, ulegając
rozdziałowi pod względem masy cząsteczkowej.
Bialka w żęlu można wybarwić następującymi metodami:
1. Barwienie w roztworze Coomassie brillant Blue.
2. Barwienie srebrem (np. według metody: Nesterenko i wsp., 1994).
3. Barwienie roztworem czerni amidowej.
Pojawia się wówczas seria prążków (Rys.7). Po wybarwieniu błękitem Coomassiego już 0.1 g
(około 2 pmol) białka daje wyraz
ny prążek, a jeszcze mniejszą ilość (około 0.02 g) można
11
uwidocznić wybarwiając srebrem. Tą metodą można na ogół rozdzielić białka różniące się masą
cząsteczkową o około 2% (np. 40 i 41 kDa, co odpowiada różnicy około 10 reszt
aminokwasowych). Znakowane białko można zlokalizować metodą autoradiografii, umieszczając
na żelu błonę rentgenowską. Małe białka poruszają się w żelu szybko, natomiast duże zatrzymują
się na górze, blisko miejsca nałożenia mieszaniny na żel. W tych warunkach ruchliwość
większości łańcuchów polipeptydowych jest liniowo proporcjonalna do logarytmu ich masy
cząsteczkowej. Jednak do tej empirycznej zależności stosują się nie wszystkie białka: np. niektóre
białka bogate w reszty węglowodanowe i białka błonowe migrują nietypowo.
Przykładowy rozdział białek w żelu poliakryloamidowym przedstawiono na Rys. 7. Żel barwiono
Coomassie brillant Blue.
nr ścieżki
1 2 3 4 5 6 7
116 kDa
TspGWI
84 kDa
67 kDa
Rys. 7
Rozdział elektroforetyczny w żelu SDS-poliakrylamidowym (8%) białek uzyskanych z
poszczególnych etapów izolacji rekombinowanej endonukleazy restrykcyjnej TspGWI.
ścieżka 1: wzorzec masowy (Sigma) (Mat.4.10)
ścieżka 2: wzorzec masowy (Pharmacia) (Mat.4.10)
ścieżka 3: lizat białkowy
ścieżka 4: preparat po wytrąceniu białek siarczanem amonu w przedziale 35-65%
ścieżka 5: preparat po chromatografii na złożu Fosfocelulozy (P11)
ścieżka 6: preparat po zagęszczaniu i dializie do buforu do przechowywania
ścieżka 7: preparat natywnej REazy TspGWI
Elektroforezę typu SDS-PAGE możemy wykorzystać do sprawdzenia wydajności stosowanej
procedury izolacji, poddając rozdziałowi każdą frakcję z poszczególnych etapów oczyszczania.
Frakcje z pierwszych etapów rozdzielą się na dziesiątki, a nawet setki białek, a w miarę postępu
procesu oczyszczania ich liczba będzie się zmniejszała, aż do pojawienia się jednego z nich,
najbardziej intensywnego, odpowiadającemu białku, które oczyszczamy (Rys. 7).
LITERATURA
1. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. (1982) Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold
Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
2. Kur J. (1994) Podstawy inżynierii genetycznej. Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej.
3. Berg J.M, Tymoczko J.L, Stryer L. (2005) Biochemia. (według V wyd. amerykańskiego)
Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa.
4. Jaroszyk F. (2001) Biofizyka. Wydawnictwa Lekarskie PZWL, Warszawa.
12
5. Solomon E., Berg L., Martin D.W., Villee C. (1996). Biologia. Wyd. I (według III wyd.
amerykańskiego), MULTICO Oficyna Wydawnicza, Warszawa.
6. Turner P.C, Mc Lennon A.G., Bates A.D., White M.R.H. (1999) Biologia molekularna.
Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa.
7. Benedek G.B, Villars F.M.H. (2000) Physics with illustrative examples from medicine and
biology  Electricity and Magnetism. Second Edition, Springer-Verlag, NY.
8. Roberts R.J., Vincze T., Posfai J., Macelis D. (2007) REBASE - enzymes and genes for DNA
restriction and modification. Nucleic Acids Res. 35: D269-270.
9. Węgleński P. (2006) Genetyka molekularna. Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa.
10. Nesterenko M.V., Tilley M., Upton S.J. (1994) A simple modification of Blum's silver stain
method allows for 30 minute detection of proteins in polyacrylamide gels.
J.Biochem.Biophys.Methods 28: 239-242.
11. http://rebase.neb.com
13