IZOLACJA I OCZYSZCZANIE BIAŁKA
I. Źródło białka:
- materiał biologiczny bogaty w oczyszczane białko
- białka rekombinowane – białka produkowane w komórkach bakteryjnych, drożdżowych lub ssaczych
II. Etapy izolacji i oczyszczania białek:
1. Wyodrębnianie z materiału biologicznego:
- rozdrobnienie materiału, rozbicie tkanek i komórek (homogenizacja, ultradźwięki, wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie)
- ekstrakcja frakcji białkowej do roztworu wodnego i usunięcie materiału balastowego poprzez ultrawirowanie
2. Wstępne oczyszczanie białka (opcjonalne)
- wytrącenie białka z roztworu poprzez frakcjonowanie wzrastającymi ilościami
rozpuszczalników
- wysolenie siarczanem amonu usunięcie czynnika wytrącającego poprzez dializę
3. Oczyszczanie
- chromatografia
4. Analiza czystości preparatu
- elektroforeza
CHROMATOGRAFIA
Początek metod chromatograficznych datuje się na rok 1903. Botanik rosyjski Michaił Cwiet przeprowadził rozdział chromatograficzny mieszaniny barwników roślinnych przy użyciu kolumny wypełnionej adsorbentem. Cwiet przy użyciu eteru naftowego wyekstrahował
barwniki roślinne. Pozornie jednobarwny ekstrakt rozdzielił na barwne pasma podczas przepuszczania go przez adsorbent - sproszkowaną kredę. W ten sposób otrzymał w czystej postaci trzy rodzaje chlorofilu a, b i c oraz parę izomerów ksantofilu (pochodnej karotenu).
Chromatografia to szeroki zakres metod fizycznych służący rozdzielaniu i/lub analizowaniu złożonych mieszanin związków chemicznych różniących się (i) właściwościami
fizykochemicznymi (ładunek, rozpuszczalność, hydrofobowość); (ii) budową (wielkość, kształt) oraz (iii) właściwościami biologicznymi.
Metody chromatograficzne mają zastosowanie analityczne ( rozdzielanie złożonej mieszaniny celem stwierdzenia obecności danego związku – analiza ilościowa i jakościowa) lub preparatywne ( izolowanie, oczyszczanie) i służą do rozdzielania: aminokwasów, peptydów, białek, kwasów nukleinowych, lipidów, cukrów.
Układ chromatograficzny składa się z:
- fazy stacjonarnej (faza nieruchoma)
- fazy ruchomej (roztwór rozwijający) przepływającej przez fazę stacjonarną
Zasada rozdziału chromatograficznego:
- składniki rozdzielanej mieszaniny oddziałują z obiema fazami
- wielkość tego oddziaływania jest różna dla różnych składników
- konkretny składnik mieszaniny przesuwa się wzdłuż drogi rozwijania chromatogramu tylko wtedy, kiedy znajduje się w fazie ruchomej
1
- składniki mieszaniny silniej oddziałujące z fazą ruchomą poruszają się szybciej ("częściej"
przebywają w fazie ruchomej)
- składniki silniej oddziałujące z fazą stacjonarną – wolniej („częściej” tkwią na fazie stacjonarnej)
- faza ruchoma stanowi siłę napędową procesu
- faza nieruchoma odgrywa rolę siły hamującej proces migracji składników
Przebieg procesu chromatograficznego:
1. Mieszanina dwóch rodzajów cząsteczek A i B (różniących się powinowactwem do fazy ruchomej i stacjonarnej) zostaje naniesiona na punkt startowy na fazie nieruchomej (stacjonarnej). Oba rodzaje cząsteczek oddziałują z obiema fazami, przy czym cząsteczki A silniej oddziałują z fazą stacjonarną niż cząsteczki B.
2. Rozpoczyna się ruch fazy ruchomej. Na punkt startowy napływa czysta faza ruchoma.
Substancja B silniej oddziałująca z fazą ruchomą przechodzi do fazy ruchomej i wraz z nią wędruje wzdłuż drogi rozwijania chromatogramu. Substancja A silniej oddziałująca z fazą stacjonarną i słabiej z fazą ruchomą; w większości pozostaje w punkcie startowym na fazie stacjonarnej.
3. Ruch fazy powoduje, że nad punkt startowy i jego bezpośrednie otoczenie napływa czysty rozpuszczalnik, co przyspiesza przechodzenie cząsteczek A do fazy ruchomej zaś cząsteczki B, które wcześniej poruszały się z fazą ruchomą przesunęły się dalej w stosunku do punktu startowego, gdzie jest nieobsadzona faza nieruchoma, co spowodowało ich częściowe przejście do fazy stacjonarnej, aż do uzyskania stanu równowagi.
Kolejne etapy rozwijania chromatogramu to przechodzenie cząsteczek z fazy ruchomej do stacjonarnej w miejscach, gdzie roztwór w fazie ruchomej styka się z "nie zajętą" fazą stacjonarną, oraz przechodzenie cząsteczek z fazy stacjonarnej do fazy ruchomej tam, gdzie
"czysta" faza ruchoma styka się z faza stacjonarną obsadzoną cząsteczkami mieszaniny.
Elementarne procesy przechodzenia z jednej fazy układu chromatograficznego do drugiej odbywają się pod wpływem dwóch czynników - powinowactwa do fazy ruchomej (zdolności rozpuszczania w fazie ruchomej) i powinowactwa do fazy stacjonarnej. Wypadkowa wartość tych dwóch przeciwstawnych czynników określa średni czas przebywania cząsteczek każdej substancji rozdzielanej mieszaniny w fazie ruchomej. Z kolei, czas przebywania w fazie ruchomej określa średnią szybkość migracji wzdłuż drogi rozwijania chromatogramu, bowiem cząsteczki migrują tylko wraz z fazą ruchomą. Odpowiednio dobrany układ
chromatograficzny powoduje uzyskanie takich różnic w szybkości migracji poszczególnych składników rozdzielanej mieszaniny, że odległości między skupiskami poszczególnych cząsteczek po zakończeniu procesu, są wystarczająco duże dla fizycznego odseparowania ich od siebie - dokonania rozdziału chromatograficznego.
Ze względu na rodzaje stosowanych faz dzielimy chromatografię na gazową (faza ruchoma jest gazem) i cieczową (fazą ruchomą jest ciecz przepływająca przez złoże fazy stacjonarnej) Ze względu na podstawowe zjawisko fizykochemiczne prowadzące do uzyskania rozdziału składników chromatografowanej mieszaniny wyróżniamy chromatografię adsorpcyjną,
powinowactwa, jonowymienną, hydrofobową, podziałową i sitową. Chromatografia gazowa ogranicza się do rozdzielania głównie substancji gazowych lub bardzo łatwo lotnych substancji trwałych w wysokich temperaturach. Dlatego chromatografia gazowa do
rozdzielania próbek białkowych się nie nadaje. Natomiast chromatografia cieczowa znajduje w biochemii bardzo duże zastosowanie.
2
Wyróżniamy techniki planarne (np. cienkowarstwowa lub bibułowa) oraz kolumnowe: (i) cieczowa grawitacyjna (faza stacjonarna wypełnia szklana lub metalową rurkę – kolumnę; przepływ fazy wymuszony jest grawitacją) i (ii) wysokociśnieniwą (kolumnowa cieczowa ciśnieniowa; przepływ fazy wymuszony jest wysokim ciśnieniem wytwarzanym przez
specjalne pompy).
CHROMATOGRAFIA ADSORPCYJNA
- metoda rozdzielania składników analizowanej mieszaniny wykorzystująca różnice siły adsorpcji poszczególnych związków na powierzchni ciała stałego - adsorbenta (faza stacjonarna)
- konkurowanie składników analizowanej mieszaniny i rozpuszczalnika z fazy ruchomej o wiązanie się do adsorbenta
- wiązanie ma charakter nietrwały (głównie wiązania wodorowe)
- proces dynamiczny, w którym mają miejsce jednostkowe akty adsorbcji i desorpcji składników w fazie nieruchomej
Różnice siły adsorpcji wynikają z różnicy polarności rozdzielanych związków oraz rozpuszczalnika i zależą od ich budowy chemicznej
Teoria adsorpcji
Cząsteczki znajdujące się wewnątrz fazy ciekłej lub stałej, otoczone są mniej więcej równomiernie przez sąsiadujące cząsteczki i działania sił międzycząsteczkowych praktycznie znoszą się, a ich wypadkowa równa jest zeru. W przeciwieństwie do tych cząsteczek, cząsteczki znajdujące się w warstwie powierzchniowej ulegają nierównomiernemu
oddziaływaniu. Powoduje to wystąpienie zjawisk powierzchniowych jak np. napięcie powierzchniowe i adsorpcja.
W zjawisku napięcia powierzchniowego w układzie faz: ciecz - gaz, cząsteczki cieczy na granicy faz ulegają oddziaływaniu cząsteczek z wnętrza cieczy, gdyż oddziaływania cząsteczek powierzchniowych cieczy z cząsteczkami gazu nad powierzchnią są znikomo małe w porównaniu z siłami oddziaływania między cząsteczkami cieczy. Siła wypadkowa
działająca na cząsteczki powierzchniowe nie jest zrównoważona i skierowana jest w głąb cieczy tzn. cząsteczki w warstwie powierzchniowej znajdują się pod działaniem sił
wciągających je do wnętrza. Ciecz wykazuje, więc dążność do zmniejszania swej
powierzchni. Gdyby nie działały inne czynniki zewnętrzne ciecz przybrałaby kształt kulisty odpowiadający najmniejszej powierzchni przy danej objętości.
W przypadku granicy faz: ciało stałe - ciecz, na powierzchni ciała stałego, dzięki istnieniu sił
oddziaływań międzycząsteczkowych, adsorbują się cząsteczki fazy będącej z nim w
kontakcie. Zjawisko adsorpcji, czyli zagęszczania się na powierzchni, dotyczy zarówno cząsteczek rozpuszczalnika jak i substancji rozpuszczonej. Dodatkowo rozpuszczalnik jak i substancja rozpuszczona oddziałują również na siebie. Zdolność adsorbowania się substancji rozpuszczonej zależy w dużym stopniu od konkurencyjnych zdolności adsorbowania się cząsteczek rozpuszczalnika. Ogólnie: im lepsza jest rozpuszczalność danej substancji w rozważanym rozpuszczalniku, tym gorzej będzie ona adsorbowana na powierzchni ciała stałego. Silniejsze oddziaływanie cząsteczek rozpuszczalnika z fazą stałą, powoduje, że cząsteczki substancji rozpuszczonej są silniej wypierane z powierzchni adsorbentu i wciągane w głąb roztworu. Ilość substancji zaadsorbowanej zależy, więc od wielkości napięcia międzyfazowego - im ono jest większe tym substancja rozpuszczona adsorbuje się łatwiej.
3
Fakt zmniejszenia się napięcia powierzchniowego na granicy faz świadczy również o wzroście zwilżalności danego ciała przez ciecz.
Zatem, jeśli rozpuszczalnikiem jest woda, adsorbenty można podzielić na:
a) hydrofobowe - źle zwilżalne przez wodę, np. węgiel aktywowany. Na granicy
niepolarnego adsorbenta z polarną cieczą wytwarza się znaczne napięcie międzyfazowe i wobec tego woda źle zwilża węgiel aktywny. Rozpuszczone w niej substancje będą
natomiast adsorbowały się dobrze.
b) Hydrofilowe - dobrze zwilżalne przez wodę, np. silikażele. Na granicy polarnego adsorbenta i polarnej cieczy obserwuje się bardzo dobrą adsorpcję wody, podczas gdy substancje w niej rozpuszczone adsorbują się bardzo trudno. W przypadku bardzo silnego adsorbowania cząsteczek rozpuszczalnika zachodzi zjawisko adsorpcji ujemnej, czyli cząsteczki rozpuszczalnika będą wypierały zaadsorbowane uprzednio na powierzchni adsorbenta cząsteczki substancji rozpuszczonej
Substancje, które obniżają napięcie międzyfazowe nazywamy powierzchniowo czynnymi (aktywnymi), a substancje, które podwyższają lub nie zmieniają napięcia powierzchniowego nazywamy powierzchniowo nieczynnymi (nieaktywnymi).
Adsorpcji z roztworów do granicznej powierzchni międzyfazowej ulegają substancje powierzchniowo czynne. Nieaktywne uciekają w głąb roztworu w procesie adsorpcji ujemnej.
Między aktywnością powierzchniową a adsorpcją z roztworu istnieje logiczny związek.
Napięcie powierzchniowe cieczy jest wywołane przyciąganiem jej cząsteczek leżących na powierzchni przez cząsteczki znajdujące się wewnątrz cieczy. Jeśli przyciąganie cząsteczek substancji rozpuszczonej przez cząsteczki rozpuszczalnika jest większe, niż wzajemne przyciąganie się cząsteczek rozpuszczalnika, to cząsteczki substancji rozpuszczonej są wciągane w głąb roztworu i warstwa powierzchniowa w nie ubożeje, natomiast cząsteczki rozpuszczalnika są silniej wyciągane z wnętrza cieczy na powierzchnię. Napięcie
powierzchniowe rośnie. W przypadku odwrotnym, gdy przyciąganie cząsteczek substancji rozpuszczonej przez cząsteczki rozpuszczalnika jest mniejsze niż wzajemne przyciąganie się cząsteczek rozpuszczalnika, cząsteczki substancji rozpuszczonej zostaną wypchnięte na powierzchnię. Napięcie powierzchniowe maleje.
Adsorbent powinien:
- mieć silnie rozwiniętą powierzchnię
- składać się z ziaren o jednorodnej wielkości
- składać się z ziaren o odpowiedniej wielkości
- być bierny chemicznie wobec rozpuszczalnika i substancji rozdzielanych
- być selektywny
Rodzaje adsorbentów:
(ze względu na ich siłę sorpcji związków organicznych):
- silne (tlenki magnezu i glinu, węgiel aktywny)
- średnie (żel krzemionkowy, węglany oraz fosforany magnezu i wapnia)
- słabe (ziemia okrzemkowa, celuloza, skrobia, sacharoza)
Rodzaje adsorbentów:
(ze względu na selektywność adsorpcji związków organicznych):
- polarne - dobrze wiążące związki polarne, aktywność maleje z zawilgoceniem; głównie tlenki i sole
- niepolarne - niezwilżalne, dobrze wiążące związki niepolarne; węgiel aktywny, celuloza, skrobia
Faza ruchoma
- rozpuszczalnik lub mieszanina rozpuszczalników o określonej sile elucji uwarunkowanej ich 4
polarnością. Gdy polarność fazy ruchomej rośnie, to jej siła elucji na adsorbencie polarnym rośnie.
Wraz ze wzrostem polarności rozpuszczalnika (pirydyna> kwas octowy> woda> metanol> etanol> aceton> octan etylu> eter etylowy> chloroform>toluen>heksan) siła elucji na adsorbencie polarnym rośnie. Rośnie również łatwość wypierania z powierzchni adsorbenta zaadsorbowanych związków.
Ruch rozpuszczalnika powoduje przemieszczanie się rozdzielanych związków, tym szybsze, im większa jest siła elucyjna rozpuszczalnika i słabsza adsorpcja danego związku.
Siła adsorpcji rozdzielanych związków zależy od:
- budowy ich szkieletów węglowych
- rodzaju i liczby grup funkcyjnych w cząsteczce
Wprowadzenie do cząsteczki węglowodoru grupy funkcyjnej powoduje:
- wzrost polarności
- silniejsze oddziaływanie z adsorbentem polarnym
Gdy wypadkowa polarność cząsteczki rośnie (grupa karboksylowa> grupa aminowa> grupa hydroksylowa> grupa karbonylowa> grupa estrowa> przyłączony chlorowiec> wiązanie podwójne), to siła adsorpcji tej cząsteczki na polarnym adsorbencie rośnie – zatem spada szybkość migracji tej cząsteczki w czasie rozdziału chromatograficznego.
Zasada doboru faz:
- większa polarność substancji rozwijanej (rozdzielanej) wymaga większej polarności stosowanej na adsorbencie polarnym
- na adsorbencie niepolarnym szereg eluotropowy należy stosować w odwrotnej
kolejności tzn. im silniejsze wiązanie substancji ze złożem, tym mniej polarny
powinien być układ rozwijający.
W chromatografii adsorpcyjnej wyróżniamy technikę kolumnową i cienkowarstwową.
Aby otrzymać pojedyncze białko na ogół trzeba zastosować kilka różnych
rozdziałów chromatograficznych
Chromatografia cieczowa kolumnowa
Przy oczyszczaniu białek najczęściej wykorzystujemy chromatografię cieczową kolumnową.
Kolumna to rurka szklana, plastikowa lub metalowa wypełniona złożem (faza stacjonarna) zrównoważonym buforem o odpowiednim składzie jonowym i pH. Mieszaninę rozdzielanych białek wprowadzamy na kolumnę w buforze fazy ruchomej. Im większe powinowactwo
białka do fazy stacjonarnej tym wolniej przesuwa się na kolumnie. Białka są eluowane (wymywane) z kolumny kolejnymi porcjami buforu w zależności od ich powinowactwa do złoża – najsłabiej zaadsorbowane pojawią się w eluacie jako pierwsze, najsilniej – jako ostatnie
Chromatografia cienkowarstwowa
W chromatografii cienkowarstwowej adsorbent stanowi cienką warstwę na powierzchni płytki szklanej, plastikowej lub z foli aluminiowej. Na suchą płytkę nanosimy na linię startową kilka kropel roztworu mieszaniny i odparowujemy rozpuszczalnik. Płytkę wstawiamy do naczynia z fazą ruchomą tak, aby poziom fazy był ok. 1 cm poniżej linii startowej. Całość wstawiamy do komory chromatograficznej - naczynia szczelnie zamkniętego i nasyconego parami fazy ruchomej. Faza ruchoma dzięki siłom kapilarnym powoduje rozwijanie chromatogramu.
Ruchliwość chromatograficzną związków w technice cienkowarstwowej opisuje współczynnik przesunięcia chromatograficznego (wspłóczynnik retencji) Rf(x), będący stosunkiem drogi 5
przebytej przez dany związek do drogi przebytej przez rozpuszczalnik Rf(r). Na jego podsta-wie można m.in. porównać własności chromatograficzne badanych związków i wzorców.
Współczynnik retencji jest charakterystyczny dla danej substancji w danych warunkach procesu chromatograficznego i może służyć do wstępnej identyfikacji danej substancji.
Wywoływanie chromatogramu
Jeżeli rozdzielane substancje nie są barwne, plamy możemy obserwować w świetle UV
(zjawisko fluorescencji) lub spryskujemy płytkę odpowiednim odczynnikiem, z którym składniki rozdzielanej mieszaniny dają barwne produkty reakcji, np.:
- pary jodu (układy nienasysone)
- ogrzewanie po zwilżeniu stężonym H2SO4
- ogrzewanie po zwilżeniu KMnO4
- ninhydryna (aminokwasy i aminy)
- ogrzewanie po zwilżeniu AgNO3 (monocukry)
CHROMATOGRAFIA POWINOWACTWA
- chromatografia adsorpcyjna kolumnowa
- zastosowanie: oczyszczanie substancji ze złożonych biologicznych mieszanin, oddzielanie formy natywnej od zdenaturowanej danej substancji, oddzielanie małych ilości materiału biologicznego od dużych ilości substancji balastowych
Zasada chromatografii powinowactwa:
- izolowana substancja jest odwracalnie adsorbowana przez komplementarnie wiążącą substancję - ligand
- ligand jest przyłączonony kowalencyjnie do nierozpuszczalnego nośnika
- izolowana substancja oczyszczana jest specyficznie, kilka tysięcy razy w jednym etapie i odzyskiwana w formie aktywnej z dużą wydajnością (> 95%).
Układy oddziaływań
Interakcja substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej z unieruchomionym ligandem
może mieć różny charakter, może to być oddziaływanie pomiędzy:
- hormonem i receptorem,
- enzymem i substratem,
- enzymem i inhibitorem,
- przeciwciałem i antygenem lub haptenem,
- komplementarnymi odcinkami kwasów nukleinowych,
- kwasami nukleinowymi i białkami,
- lektynami i glikoproteinami,
- dopełniaczem i przeciwciałami z grupy IgG, itp.
Nośnik powinien:
- zapewniać stabilność pod względem fizycznym i chemicznym w warunkach eksperymentu (wysokie i niskie pH, detergenty, rozpuszczalniki organiczne)
- posiadać odpowiednią przepuszczalność
- być wolne od efektów adsorpcji niespecyficznej
Jako nośniki w chromatografii powinowactwa stosowane są złoża, które tradycyjnie wykorzystuje się do filtracji żelowej, z tym, że przed użyciem wymagają one odpowiedniej aktywacji. Są to pochodne dekstranowe (Sephadex), agarozowe (Sepharose) lub
poliakrylamidowe. Do aktywacji żeli dekstranowych i agarozowych powszechnie stosuje się reakcję z bromocyjanem. Oprócz nośników, które można przygotować do celu chromatografii 6
powinowactwa we własnym zakresie, dostępne są również złoża przystosowane już do chemicznego wiązania liganda, np. CNBr-Sepharose 4B.
Aktywacja nośnika
Charakter wiązania między ligandem i nośnikiem zależy zarówno od rodzaju substancji używanej jako ligand, jak i od nośnika. Powstające podczas aktywacji żelu bromocyjanem ugrupowania karboimidowe reagują wyłącznie z grupami aminowymi przyłączanej
substancji.
Z aktywnym nośnikiem można związać chemicznie wszystkie typy biopolimerów zawierające grupy aminowe. Ligandy białkowe można także związać za pomocą grup karboksylowych (Glu, Asp), reszt hydroksylowych (Tyr, Ser, Thr) oraz reszt sulfhydrylowych (tiolowych) (Cys). Kwasy nukleinowe można przyłączyć do nośnika za pośrednictwem reszt
fosforanowych lub grup enolowych zasad azotowych, a cukrowce przez grupy
wodorotlenowe reszt cukrowych. Podłożem o najszerszym zastosowaniu jest Sefaroza 4B -
jest to usieciowana agaroza (-D-galaktozo-3,6-anhydro-L-galaktoza-). Struktura otwartych porów (limit filtracji żelowej wynosi MW 20⋅106) czyni wnętrze tego podłoża dostępnym do przyłączenia liganda i zapewnia dużą pojemność wiązaniową nawet dla dużych molekuł.
Forma sieciowa żelu zapewnia doskonały przepływ z minimalnym wchodzeniem w kanały, a to z kolei ułatwia szybki rozdział.
Ligand powinien:
- wykazywać specyficzne i odwracalne powinowactwo wiązaniowe dla danej substancji, która ma być oczyszczona (ligandy grupowe: (i) NAD+ i AMP wiążą więcej niż jeden enzym lub (ii) wykazują powinowactwo do więcej niż jednego typu reszty cukrowej np.
konkanawalina A)
- posiadać grupy modyfikowalne chemicznie, co pozwoli na przyłączenie go do podłoży bez niszczenia jego aktywności wiązaniowej.
- znajdować się w wystarczającej odległości od nośnika, aby nie wystąpiły przeszkody steryczne interakcji ligand - izolowana molekuła
- posiadać powinowactwo do substancji wiążącej w przedziale 10-4 - 10-6 M w stanie wolnym w roztworze. Jeśli stała dysocjacji jest niższa niż ok. 10-6 M, to elucja tak związanej substancji bez jej inaktywacji jest bardzo trudna.
Odstępnik
Zachodzi czasem konieczność przytwierdzenia liganda do nośnika poprzez tzw. “odstępnik”.
Najczęściej odstępnikami są łańcuchy węglowodorowe zawierające od dwu do dziesięciu atomów węgla. Mają one szczególne znaczenie w przypadku ligandów o bardzo małej
cząsteczce, wiążących wielkocząsteczkowe substancje lub też wtedy, gdy dana substancja wykazuje niewielkie powinowactwo do zastosowanego liganda. Eliminuje się w ten sposób efekty steryczne reszt cukrowych nośnika podczas sorpcji makromolekuł. Długość odstępnika jest niezwykle ważna, gdyż przy zbyt krótkich odstępnikach oddziaływanie ligand -
izolowana molekuła jest mało efektywne. Natomiast bardzo długie odstępniki mogą wiązać różnorodne substancje z próbki na zasadzie oddziaływań hydrofobowych. Pojawienie się niespecyficznych oddziaływań obniża selektywność rozdziału.
Etapy rozdziału:
1. Nałożenie próbki – tworzy się kompleks ligand – komplementarna molekuła 2. Płukanie - wymycie substancji balastowych buforem wyjściowym
3. Elucja - oddysocjowanie związanych specyficznie molekuł
4. Równoważenie - przepłukanie kolumny buforem wyjściowym.
7
Krzywa desorpcji obrazuje podział cząsteczek substancji izolowanej pomiędzy dwie fazy: ruchomą (bufor) i stacjonarną (afinożel)
Warunki w
iązania/elucji oczyszczanej molekuły:
1. specyficzność wiązaniowa liganda
2. odpowiednia siła wiązania (10-6 M < KD < 10-4 M)
- oczyszczana substancja związana w całości
- brak wyciekania oczyszczanej substancji w etapie nakładania próbki i płukania
kolumny
- łatwość oddysocjowania związanej substancji w wyniku zmiany pH lub siły jonowej
- substancja związana eluowana w postaci ostrego piku
Na wartość KD mają wpływ:
- zmiana pH
- zmiana siły jonowej
- zmiana temperatury
- zmiana polarności
Im mniejsza wartość KD tym silniejsze wiązanie ligand – komplementarna molekuła.
Jeśli KD > 10 -4
dla etapu wiązania to :
- zbyt słabe wiązanie
- oczyszczana substancja wycieka z kolumny w etapie nakładania próbki i płukania kolumny Jeśli KD < 10 -6
dla etapu wiązania to :
- zbyt mocne wiązanie
- denaturujące warunki elucji (4-8 M roztwór mocznika, 6 M roztwór guanidyny)
- utrata aktywności biologicznej oczyszczanej substancji
E
LUCJA - całkowita desorpcja związanej substancji poprzez:
- zmianę warunków (pH, siła jonowa, temperatura, polarność) powodującą zmianę wartości KD z niskiej na wysoką. Prawidłowa wartość KD dla elucji zawiera się w przedziale: 10-2 < KD <10-1
Jeśli KD < 10 -2
dla elucji to :
- zbyt silne wiązanie
- oczyszczana substancja zatrzymana na kolumnie
- opóźniona elucja
- substancja desorbowana w postaci szerokiego, płaskiego piku
Elucja polega na:
- dodaniu rozpuszczalnego liganda lub analagu liganda – współzawodnictwo o
komplementarną molekułę lub
- dodaniu rozpuszczalnej substancji współzawodniczącej z komplementarną molekułą o wiązanie z ligandem
Kinetyka wiązania/desorpcji powinna zapewniać:
- szybkie wiązanie i desorpcję
- ostrą krzywa desorpcji
Gdy zbyt wolne wiązanie należy wydłużyć czas oddziaływania izolowanej molekuły z ligandem (nakładanie próbki porcjami z czasowym zamykaniem kolumny).
Gdy zbyt wolna desorpcja należy wydłużyć czas oddziaływania czynnika eluującego z kompleksem izolowana molekuła - ligand (czasowe zamknięcie kolumny).
8
CHROMATOGRAFIA POWINOWACTWA NA KOLUMNIE CONA–SEPHAROSE
Lektyny to:
białka lub glikoproteiny pochodzenia nieimmunologicznego
specyficznie wiążą reszty cukrowe aglutynują komórki i aglutynują lub wytracają glikokoniugaty (cząsteczki zawierające reszty cukrowe np. polisacharydy,
glikoproteiny, glycolipidy).
Lektyna konkanawalina A (ConA)
wyizolowana z fasoli „Jasiek” Canavalia ensiformis
nie jest glikoproteiną
homotetramer (102 kDa, forma aktywna)
4 miejsca wiążące - aglutynacja
metaloproteina (wiąże 1 jon Ca2+ i 1 jon metalu przejściowego zwykle Mn2+)
rozpoznaje α-D-związaną mannozę i terminalną α-D glukozę
Lektyna ConA
nie wiąże: O-glikanów, tri-i tetraantenowych N-glikanów typu kompleks, biantenowych N-glikanów typu kompleks z fukozą α1,3-przyłączoną do reszty
GlcNAc w łańcuchu zewnętrznym oraz przedzielonych biantenowych N-glikanów typ
kompleks
wiąże: mono- i biantenowe N-glikany typu kompleks, struktury hybrydowe i wielomannozowe
9