Regulacja cyklu komórkowego
Cykl rozwojowy u Eucaryota podlega niezwykle skomplikowanej regulacji.
Jego prawidłowy przebieg możliwy jest tylko dzięwki obecności dwóch
punktów restrykcyjnych.
Punkt 1: granica G1 i S. tutaj odbywa się kontrola integralności materiału
genetycznego. Wykrycie uszkodzenia DNA powoduje uruchomienie
mechanizmów naprawczych oraz zatrzymanie cyklu do czasu zakończenia
naprawy.
Punkt 2: granica faz G2 i M. w tym miejscu odbywa siÄ™ kontrola
prawidłowości kondensacji i segregacji materiału genetycznego oraz
tworzenie wrzeciona podziałowego.
Regulacja cyklu odbywa siÄ™ poprzez uruchamianie kaskadowych reakcji
fosforylacji i defosforylacji białek, przeprowadzanych przez odpowiednie
kinazy i fosfatazy. Najczęściej fosforyzowanymi aminokwasami są Thr i Ser.
Aktywacja kinaz zachodzi w obu punktach restrykcyjnych.
1. Czynnika dojrzewania MPF
MPF (maturation promoting factor) powoduje, że komórki jajowe, w których
mejoza uległą zatrzymaniu w profazie I, wchodzą w mejozę II i dojrzewają do
zapłodnienia. Wykazano, że jaja Xenopus mimo usunięcia jądra i innych
organelli ulegajÄ… cyklicznym zmianom, co dowodzi istnienia biochemicznego
oscylatora regulującego cykl komórkowy. MPF jest heterodimerem białkowym,
ulegającym w czasie cyklu komórkowego licznym zmianom, pod wpływem
różnych czynników. Jednym ze składników MPF jest produkt genu cdc2, białko
o masie cząsteczkowej 34 000, nazywane p34. białko p34cdc2(obecnie kinaza
cdk1). Jest kinazą przenoszącą grupy fosforanowe z ATP na różne białka. Jego
obecność wykryto we wszystkich organizmach, a jego geny wykazują znaczną
zachowawczość w przebiegu ewolucji (63% między ludzką a drożdżową cdc2).
U człowieka gen ten zlokalizowany jest na długim ramieniu chromosomu 10. jej
poziom w różnych etapach cyklu nie ulega zmianie, co wyklucza jej działanie
jako oscylatora. Na szczęście drugi składnik MPF, kochana przez studentów
medycyny cyklina potrafi ulegać rytmicznej syntezie w interfazie i degradacji w
fazie M. obecnie, żeby studentom się nie nudziło, wyróżnia się 5 rodzin cyklin,
obejmujących 10 białek. Najlepiej poznany jest wpływ kompleksu cyklina B-
cdk1 na rozpad otoczki jądrowej. Po ufosforylowaniu włóknistych białek otoczki
(lamin) stajÄ… siÄ™ one rozpuszczalne, a po defosforylacji odtwarzajÄ… otoczkÄ™.
2. Rola kinazy p34cdc2 (cdk1) i kinaz rodziny cdk w regulacji cyklu
komórkowego.
Kinaza cdk odgrywa kluczową rolę w regulacji cyklu komórkowego.
Fosforyzowane w niej są: Tyr, Thr i Ser. U organizmów wyższych fosforylacja
zachodzi w różnych kinazach cdk, w zależności od fazy cyklu. W fazie S i G1
fosforylowane sÄ…Tyr15 i Thr14. Ser277 w fazie G1, a Thr161 w fazie G2. w fazie M
wszystkie poza Thr161 sÄ… defosforylowane. W kinazach cdk Tyr15 i Thr14
znajdują się w domenie wiążącej ATP, z kolei Thr161 w domenie wiążącej
cykliny, co stabilizuje ich kompleksy. W początkowej fazie G1 białko p34cdc2 nie
jest zwiÄ…zane z cyklinÄ…, przez co pozostaje nieaktywne. W miarÄ™ akumulacji
cyklin D i E i połączeniu ich z kinazą następuje jej aktywacja, co doprowadza do
startu cyklu (indukcji replikacji, faza S) i organizacji centrum mikrotubul
(MTOC). Po przejściu punktu restrykcyjnego komórki zaczynają produkować
różne cykliny (jednakowoż głównie B), które tworzą kompleksy z kinazą p34cdc2.
kompleksy te (pre-MPF) pozostajÄ… nieaktywne z powodu fosforylacji Ty15 i
Thr14. defosforylacja Tyr15 w póz
nej G2 pozwala na aktywacjÄ™ MPF, co skutkuje
przejściem do mitozy. Przejście pre-MPF w MPF kontrolowane jest przez
produkt genu wee1, mik1 i cdc25, kodujących enzymy o przeciwnym działaniu.
Kinazy wee1 i mik1 powodujÄ… fosforylacjÄ™ Tyr15 i sÄ… inhibitorami mitozy, z kolei
fosfataza tyrozynowa cdc25 jest jej aktywatorem. U człowieka występuje wiele
kinaz cdk, pokrewnych do p34cdc2. obecnie znamy ich ponad 10.
3. Rola cyklin w regulacji cyklu komórkowego
Regulacja aktywności kinaz cdk odbywa się nie tylko drogą fosforylacji, ale
także poprzez łączenie ich w kompleksy z cyklinami. Są one białkami
zbudowanymi z ok. 400 aminokwasów. Ich domena funkcjonalna (kaseta
cyklinowa) wykazuje duży stopień konserwatywności sekwencji. Każda cyklina
zawiera także sekwencję biorącą udział w jej degradacji przy udziale
proteasomów sprzężonych z ubikwityną. Bierze ona udział w wiązaniu cyklin z
cdk. Cykliny można podzielić na:
" Cykliny mitotyczne (A i B)
" Cykliny fazy G1 (D i E)
4. Cykliny mitotyczne
Cykliny mitotyczne zgrupowane są w dwie klasy (A i B) w zależności od
funkcji. Dodatkowo cykliny B dzieli siÄ™ na B1 i B2. Obie klasy cyklin
mitotycznych różnią się funkcją i czasem degradacji. Proteoliza Cykliny B na
granicy metafaza/anafaza powoduje inaktywacjÄ™ MPF, co prowadzi do
zakończenia mitozy i przejścia do interfazy z dekondensacją chromosomów,
reorganizacją otoczki jądrowej i cytokinezą. Obecność zmutowanej cykliny B
powoduje zablokowanie cyklu w mitozie. Cyklina B jest produkowana podczaf
fazy G2 i stopniowo ulega akumulacji w komórce, związana przez struktury
błoniaste i w postaci ziarnistości. Razem z białkiem p34cdc2 tworzy kompleks
pre-MPF. Na początku profazy ulega translokacji do jądra komórkowego. W
odróżnieniu od cykliny B, cyklina A bierze udział już w przebiegu fazy S, gdzie
jest niezbędna do inicjacji replikacji DNA. Gromadzi się ona głównie w jądrze, a
częściowo także rozpuszczona w cytoplazmie. Jej aktywność wzrasta stopniowo
w miarę akumulacji. Z kolei aktywność cykliny B pozostaje niska pomimo jego
wysokiego poziomu aż do zadziałania produktu genu cdc25. szczyt aktywności
kompleksu kinaza-cyklina A występuje, gdy aktywność kompleksu kinaza-
cyklina B dopiero zaczyna rosnąć. Także degradacja cykliny A następuje
wcześniej niż B, bo już w momencie rozpadu otoczki jądrowej.
5. Cykliny fazy G1
Są one aktywne we wczesnych fazach cyklu komórkowego. Do grupy tej
zalicza się trzy cykliny klasy D (D1, D2, D3) oraz cyklinę E, a także bardzo słabo
poznaną cyklinę C. każda z cyklin fazy G1 tworzy kompleksy z odpowiednią
kinazÄ…:
" Cykliny D z cdk4 i cdk6
" Cykliny E z cdk2
" O cyklinie C gówno wiemy
Kinazy cdk4 i cdk6 w kompleksach z cyklinami klasy D działają w
początkowym etapie fazy G1, aktywność kompleksu cdk2-cyklina E pojawia się
póz
niej, a maksimum osiąga na granicy faz G1/S. w komórkach fazy G1
występują też liczne inhibitory cyklin oraz antygen proliferujących komórek
PCNA. Nadekspresja genów cyklin klasy D umożliwia komórkom włączenie się
do cyklu podziałowego, skracając fazę G1. z kolei spadek poziomu cykliny D1
powoduje zahamowanie komórek w fazie G1 cyklu. Także Nadekspresja genu
cykliny E, a czasami również cykliny D2, skraca fazę G1 i przyspiesza
rozpoczęcie fazy S. wysoki poziom cykliny D1 może spowodować blok w fazie
G1, dając czas na naprawę DNA z udziałem PCNA. W hamowaniu cyklu
komórkowego przez cyklinę D1 bierze udział białko p53 i indukowane przez
nie białko p21 oraz inhibitor cdk. W warunkach fizjologicznych aktywność p53
podlega regulacji ze strony mdm2 na zasadzie ujemnego sprzężenia zwrotnego.
Białko p53 nasila ekspresję genu mdm2, którego produkt tworzy z kompleksy
p53-mdm2, pozbawiony aktywności indukcji genów. Białko mdm2 wykazuje w
tym dimerze aktywność ligazy ubikwitynowej, co prowadzi do degradacji p53.
aktywność mdm2 kontrolowana jest z kolei przez białko p19. kompleks mdm2-
p19 nie wykazuje aktywności ligazy, co prowadzi do stabilizacji poziomu p53.
Cyklina D1 może brać udział zarówno w indukcji jak i inhibicji cyklu
komórkowego, mniej wiadomo o cyklinach D2 i D3, aczkolwiek
prawdopodobnie także biorą one udział w regulacji cyklu, zwłaszcza przy
różnicowaniu mioblastów i komórek układu krwiotwórczego.
Cyklina E ma związek z aktywnością kinazy histonu H1, która jest najwyższa
w póz
nej G1 i wczesnej S. cyklina E może tworzyć kompleks z cdk1, jednakże nie
wykazuje on aktywności kinazowej.
Cyklina C jest najsłabiej poznana. Wiemy jedynie, że jej mRNA osiąga
najwyższy poziom we wczesnej G1 i że najbardziej różni się od cyklin
mitotycznych.
6. Degradacja cyklin przy udziale systemu ubikwitynowego
Szybka degradacja cyklin mitotycznych przebiega przy udziale białkowych
kompleksów zwanych proteasomami (konkretnie proteazy 26S proteasomu).
Degradacji ulegajÄ… jednak jedynie czÄ…steczki odpowiednio oznaczone. RolÄ™
znacznika pełni tu małe białko; ubikwityna, która zostaje przy udziale ATP
przyłączona do cząsteczki cykliny, tworząc kompleks zwany cyklosomem.
Bezpośrednio przed degradacją dochodzi do modyfikacji cykliny, zwiększającej
jej powinowactwo do enzymów przenoszących ubikwitynę. W degradację cyklin
są zaangażowane co najmniej dwie kinazy: p34cdc2 oraz kinaza białkowa p39mos.
Bezpośrednio przed mitozą stwierdza się wzrost stężenia jonów Ca2+ i
kalmoduliny, od których zależy aktywność kinazy II. Obecność zmutowanej,
stale aktywnej kinazy II powoduje blok w fazie G2, pomimo wzrostu aktywności
MPF. Degradację cyklin pod koniec mitozy wywołuje rozpad kompleksu kinazy
p34cdc2-cyklina, w którym Thr161 jest nadal ufosforylowana. Dopiero degradacja
cyklin powoduje defosforylację tego aminokwasu, powodującą całkowity zanik
aktywności kinazowej, gwarantujący prawidłowy przebieg cyklu komórkowego.
7. Inhibitory kinaz zależnych od cyklin (CKI)
W komórkach somatycznych odok cdk i cyklin występują dodatkowe
czynniki białkowe, wywierające hamujący wpływ na aktywność tych
kompleksów takie jak:
" Białko p21 WAF1: produkt genu CIP1. hamuje aktywność
enzymatyczną cdk w kompleksach z cyklinami. Najsilniej działa na
kompleksy cdk2-Cyklina A, a najsłabiej na cdk2-Cyklina B. poziom
jego mRNA jest w komórkach starzejących się i zahamowanych w G0
podwyższony 10-29krotnie. W komórkach G0 przechodzących do
cyklu następuje częściowy wzrost poziomu mRNA dla genu pic1.
regulacja białka p21 odbywa się na drodze zależnej i niezależnej od
p53.
" Białko p16 INK4A: kodowane przez gen CDKN2A. wiąże się głównie
z cdk4, gdy inaktywacji ulega Rb i pokrewne mu białka. W
komórkach o zmutowanym białku pRb wzrasta ekspresja genu dla
białka p16 i następuje inaktywacja cdk4, co jednak nie wpływa na
postęp cyklu, gdyż zmutowane pRb znajduje się w stanie ciąglej
hiperfosforylacji.
" Białko p27 KIP1: produkt genu KIP1. jest uniwersalnym inhibitorem
cdk. PoÅ›redniczy ono w transdukcji sygnaÅ‚u pochodzÄ…cego z TGF-²,
blokującego komórki w póz
nej G1. białko p27 wiąże się z kompleksem
cdk2-cyklina E, zwiększając poziom cykliny E potrzebny do aktywacji
cdk2. z kolei wiązanie p27 z kompleksem cdk4-cyklina D2 umożliwia
aktywację kompleksu cdk2-cyklina E. W komórkach nie znajdujących
siÄ™ pod wpÅ‚ywem TGF-² biaÅ‚ko p27 jest obecne, ale pozostaje
związane w kompleksy z innymi białkami, przez co staje się
nieaktywne.
8. Mechanizmy kontrolujące cykl komórkowy
Regulacja transkrypcyjna: większość genów aktywna jest podczas całego
cyklu komórkowego, jednak część ulega jedynie okresowej aktywacji w
określonych fazach. Są to na przykład:
" Geny DHFT, TK, TS, c-myb- w fazie G1/S.
" Geny histonów: H1,H2A, H2B, H3, H4- w fazie S.
" Geny Cyklin A, cdc 25, HSP70 (białko szoku cieplnego)- w
póz
nej S/G2.
" Geny GKSHs1 i GKSHs2: dla białek wiążących kinazę p34cdc2 w
fazie G2/M.
Kontrola przez ujemne sprzężenie zwrotne (zobaczyć w Drewie, zero
konkretów w tym temacie, więc się nie rozpisuję).
Kontrola przez czynniki spoza cyklu: komorki mogą być aktywowane do
cyklu przez czynniki pozakomórkowe, takie jak hormony i czynniki wzrostu i
różnicowania, wpływ układu nerwowego i inne podobne, które dzielimy na
mitogenne i hamujÄ…ce proliferacjÄ™.
" Czynniki wzrostu i różnicowania (CWR): składa się na nie ok. 40
polipeptydów i leukotrienów, których działanie ma miejsce przy stężeniu
zaledwie 10-10 mol/litr. Oddziałują one na komórkę za pomocą błonowych
receptorów, pobudzając do wzrostu (wejście do cyklu), bądz
przerostu
(zwiększania masy). Należą tutaj między innymi: naskórkowy czynnik
wzrostu, interleukiny 1-9, czynnik wzrostu nerwów oraz w ch*j i trochę
innych.
" Białko p110Rb: jest to fosfoproteina posiadająca 10 miejsc fosforylacji
reszt Ser i Thr. Jego fosforylacja odbywa siÄ™ przy udziale kinaz cdk w
określonych fazach cyklu komórkowego. Inicjacja jego fosforylacji
następuje pod wpływem cykliny E, synteza kolejnych cyklin utrzymuje je
w stanie kiper- lub hipofosforylacji. Hipofosforylowana postać
białka(faza G1) zapobiega proliferacji komórek, podczas gdy
hiperfosforylowana (fazy S, G2, M) powoduje jej wzmożenie, uwalniając
szereg czynników transkrypcyjnych, mogących wchodzić w kompleks z
białkiem p33cdc2.
" Białko p53: składa się z 393 aminokwasów i jest fosfoproteiną.
Prawidłowa jego postać występuje w jądrze, podczas gdy zmutowaną
obserwuje się w cytoplazmie. Wykazuje zdolność wiązania z produktami
onkogennych wirusów (np. SV40, Papilloma E6), a także produktem genu
mdm2 o dużej aktywności transformacyjnej. Związane z produktem
Papilloma E6 podlega degradacji przy udziale systemu ubikwitynowego.
Posiada ono zdolność wiązania się z dwuniciowym DNA i zatrzymywać
cykl w póz
nej G1 w przypadku uszkodzeń DNA, dając czas na pracę
enzymów naprawczych przed fazą S. zatrzymując cykl na przełomie G2/M
zapobiega utracie materiału genetycznego wskutek złamań
chromosomów. Prawidłowa jego forma ma zdolność indukowania
apoptozy, podczas gdy zmutowane hamuje ten proces, stajÄ…c siÄ™
onkogenem. Jego zmutowaną postać wykrywa się w licznych
nowotworach (jelita, płuc, przełyku).