OKREŚLANIE STRUKTURY RÓŻNYCH
OKREŚLANIE STRUKTURY RÓŻNYCH
TOKSYN PRZY ZASTOSOWANIU TECHNIKI
TOKSYN PRZY ZASTOSOWANIU TECHNIKI
CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ
CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ
SPRZ
ŻONEJ ZE SPEKTROMETREM
SPRZ
ŻONEJ ZE SPEKTROMETREM
MASOWYM (HPLC-MS)
MASOWYM (HPLC-MS)
Dr inż.Agata Kot-Wasik
Dr Hanna Mazur-Marzec
Katedra Chemii Analitycznej,
Instytut Oceanografii, Uniwersytet Gdański,
Wydział Chemiczny, Politechnika Gdańska
ul. G.Narutowicza11/12,
Al. Marszałka Piłsudskiego 46,
80-952 Gdańsk, Poland
81-378 Gdynia, Poland
[e-mail]
[e-mail]
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJ
CE
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJ
CE
ANALIZ
TOKSYN:
ANALIZ
TOKSYN:
TESTY IMMUNOLOGICZNE I ENZYMATYCZNE
TESTY IMMUNOLOGICZNE I ENZYMATYCZNE
 ELISA (ang. Enzyme-Linked Immunosorbent
 ELISA (ang. Enzyme-Linked Immunosorbent
Assay) pozwala na oszacowanie obecności toksyn,
Assay)
np. wydzielanych przez glony z rodzaju Microcystis,
na poziomie kilku �gL-1 bez przygotowania próbki,
lecz nie pozwala na ich identyfikację.
 PPI (ang. Protein Phospatase Inhibition assay)
 PPI (ang. Protein Phospatase Inhibition assay)
metody wysoce selektywne, czułe i szybkie
J. Rapala, K. Erkomaaa, J. Kukkonen, K. Sivonen, K. Lahti, Analytica Chimica Acta 466 (2002) 213-231
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJ
CE
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJ
CE
ANALIZ
TOKSYN:
ANALIZ
TOKSYN:
METODY CHROMATOGRAFICZNE
METODY CHROMATOGRAFICZNE
 GC MS - zapewnia wysoką selektywność
GC MS
(specyficzność) oznaczenia, lecz wymaga
derywatyzacji analitów, a poza tym nie może
być zastosowana do analizy nielotnych toksyn
wysokocząsteczkowych.
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJ
CE
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJ
CE
ANALIZ
TOKSYN:
ANALIZ
TOKSYN:
 HPLC-UV lub HPLC-DAD - jedna z najczęściej
 HPLC-UV HPLC-DAD najczęściej
stosowanych technik, jednakże nie zapewnia
ona wystarczającej jakości uzyskiwanych
wyników bez zastosowania żmudnych i
długotrwałych procedur przygotowania próbki.
 HPLC-fluorescencja - rzadziej stosowana
 HPLC-fluorescencja
technika, gdyż wymaga derywatyzacji analitów;
ale znacznie czulsza niż HPLC-UV.
HPLC DAD
HPLC DAD
analiza ekstraktu Nodularii
analiza ekstraktu Nodularii
HPLC-DAD
238 nm
254 nm
HPLC DAD
HPLC DAD
analiza ekstraktu Nodularii
analiza ekstraktu Nodularii
Analiza widma DAD
238 nm
254 nm
Wniosek: niezbędny jest wzorzec
celem potwierdzenia czasu
retencji i porównania widma UV
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJ
CE
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJ
CE
ANALIZ
TOKSYN:
ANALIZ
TOKSYN:
 HPLC-UV lub HPLC-DAD
 HPLC-UV HPLC-DAD
HPLC DAD-MS
HPLC DAD-MS
Pozwala na uzyskanie informacji o
masie cząsteczkowej oznaczanych
toksyn, a nawet ich identyfikację.
HPLC-MS
HPLC-MS
TAK, ALE ...
problem połączenia LC i MS !
HPLC, 1 ml/min, 100-250 bar MS, próżnia
Przepływ fazy ruchomej w LC wymusza problemy związane z
uzyskaniem wysokiej próżni. Podczas analizy GC (faza ruchoma:
gaz) przepływ gazu u wlotu do MS wynosi około 0.5-2ml/min.
Podczas kiedy w HPLC faza ruchoma w postaci ciekłej daje przepływ
gazu u wlotu MS rzędu 350ml/min w przypadku metanolu i aż
1000 ml/min w przypadku wody!
( J.Abian "The coupling of Gas and Liquid Chromatography with Mass Spectrometry ")
HPLC-MS
HPLC-MS
Ciśnienie
Ciśnienie
Próżnia
Próżnia
Wysokie ciśnienie
Wysokie ciśnienie
atmosferyczne
atmosferyczne
Kwadrupol
Kwadrupol
Kolumna HPLC +HV
Kolumna HPLC +HV
Elektrorozpylanie
Elektrorozpylanie
(electrospray)
(electrospray)
+
+ +
++
+
+
++
+
+
+ + +
+
+ ++ ++ ++
+
+ +
+ +
+
++
+
+ +
+ +
[M+nH]n+
[M+nH]n+
++ +
+ +
+ +
++ + ++
+
+ +
++
+
+
+ +
+
+
+ ++ ++
+
+
ODPAROWANIE ROZSZCZEPIENIE
ROZPUSZCZALNIKA I POWSTANIE JONÓW
ROZPYLENIE
HPLC MS
HPLC MS
analiza ekstraktu Nodularii
analiza ekstraktu Nodularii
HPLC-MS
SCAN
SIM
HPLC MS
HPLC MS
analiza ekstraktu Nodularii
analiza ekstraktu Nodularii
Widmo MS
SCAN
HPLC MS
HPLC MS
analiza ekstraktu Nodularii
analiza ekstraktu Nodularii
Analiza widma MS
CH3
O
H
COOH
CH3
N
H N
H OMeH H
H
H
O
O
NH
H
H
CH3
H
N NH
H
H
O H
H
COOH
O
[M+H]+ = 825.4
[M+H]+ = 825.4
NH
M=824.4
M=824.4
HN NH2
Wniosek: wzorzec może potwierdzić
hipotezę o obecności nodularyny w
ekstrakcie, ale nie jest niezbędny.
HPLC MS
HPLC MS
analiza ekstraktu Nodularii
analiza ekstraktu Nodularii
Widmo MS
SCAN
HPLC MS
HPLC MS
analiza ekstraktu Nodularii
analiza ekstraktu Nodularii
HPLC-MS
CH3
O
H
COOH
CH3
N
H N
H OMeH H
H
H
O
O
NH
H
H
CH3
H
N NH
H
H
O H
H
COOH
O
NH
HN NH2
dm-Nod
[M+H]+ = 811.3
[M+H]+ = 811.3
M=810.3
M=810.3
HPLC DAD-MS analiza ekstraktu:
analiza ekstraktu:
HPLC DAD-MS
jezioro Karczemne
jezioro Karczemne
DAD
HPLC-DAD
MS-SCA
HPLC-MS
MS-SIM
MS-SCAN analiza ekstraktu: jezioro Karczemne
analiza ekstraktu: jezioro Karczemne
MS-SCAN
CH3 O
H OH
N
NH
HN
H
NH2+ O CH2
O
H3C
H3C
[M+H]+ [M+2H]2+
[M+H]+ [M+2H]2+ H CH3 H H H O
O
NH
H R1
H H H
H3C H
N N A
CH3 H
O
H OH
H O
NH
Anatoksyna A
HN NH2
MC RR
MS-SIM analiza ekstraktu: jezioro Karczemne
analiza ekstraktu: jezioro Karczemne
MS-SIM
Jon monitorowany:
166 (Anatoksyna-a)
Jon monitorowany:
520 (MC-RR)
Jon monitorowany:
825 (Nod)
1046 (MC-YR)
Jon monitorowany:
995 (MC-LR)
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJ
CE
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJ
CE
ANALIZ
TOKSYN:
ANALIZ
TOKSYN:
 HPLC MS - technika ta pozwala na
HPLC MS
uzyskiwanie informacji o masie cząsteczkowej
oznaczanych toksyn.
Widmo masowe -  odcisk palca substancji
pozwala na jej identyfikację. Technika HPLC-DAD-MS
zaczyna być coraz powszechniej stosowana do analizy
toksyn ze względu na jej zalety oraz fakt, iż dzisiaj
systemy HPLC-MS stają się niezawodne, oferuje je coraz
większa liczba producentów, a ich ceny zbliżają się do
poziomu akceptowalnego przez większość laboratoriów.
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJ
CE
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJ
CE
ANALIZ
TOKSYN:
ANALIZ
TOKSYN:
 HPLC MS
HPLC MS
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJ
CE
TECHNIKI ANALITYCZNE UMOŻLIWIAJ
CE
ANALIZ
TOKSYN:
ANALIZ
TOKSYN:
niezwykle użytecznym rozwinięciem techniki HPLC-MS
jest LC-MS-MS
LC-MS-MS
 HPLC-MS-MS - dzięki zastosowaniu
 HPLC-MS-MS
dodatkowego detektora masowego możliwa jest
identyfikacja nieznanych substancji jedynie na
podstawie ich widma masowego (nawet bez
konieczności posiadania wzorców).
WNIOSKI KOC
COWE:
WNIOSKI KOC
COWE:
Technika HPLC MS zaczyna być coraz
HPLC MS
powszechniej stosowana w laboratoriach
analitycznych ze względu na jej zalety.
Wkrótce technika LC-MS stanie się techniką
rutynowych analiz.