Ann. Acad. Med. Siles. 2005, 59, 3 PRACA POGL
DOWA
Magdalena Czajka-Uhryn1, Ilona Bednarek2
1
Katedra i Zakład Biologii Molekularnej i Genetycznej Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach
2
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach
Interferencja RNA  nowe narzędzie
molekularne w modulacji zjawiska
oporności wielolekowej
RNA interference  a new molecular tool in MDR modulation
ABSTRACT
The multidrug resistance (MDR), intrinsic or acquired, is nowadays one of the major reasons for chemotherapeutic
treatment failure in many cancer patients. The etiology of MDR is rather multifactorial, but often the classical MDR is
associated with the overexpression of the plasma membrane ABC (ATP-binding cassette) transporters, resulting in
increased efflux of the drugs from the cancer cells. In the last few years a vast number of strategies have been
proposed and tested to reverse the MDR. One of the most promising methods for modulation of the classical MDR
phenotype is RNA interference (RNAi). RNAi is a conserved biological response to dsRNA, which results in sequence-
specific gene silencing. The RNAi is a powerful tool, which gives an opportunity for highly specific inhibition
of expression of the individual ABC transmembrane proteins. The results obtained from the experiments in the preclini-
cal models with the usage of RNAi are very encouraging. It gives hope that the MDR problem will finally be overcome.
KEY WORDS: multidrug resistance (MDR), RNA interference (RNAi), Post-transcriptional Gene Silencing (PTGS)
STRESZ CZ ENI E
Oporność wielolekowa, zarówno pierwotna jak i nabyta, jest obecnie jedną z głównych przyczyn niepowodzenia terapii
nowotworów. Etiologia oporności wielolekowej jest wieloczynnikowa, jednak klasyczną oporność wielolekową wiąże
się najczęściej z nadmierną ekspresją transporterów błonowych należących do rodziny białek ABC (ABC family),
których nadekspresja powoduje nadmierny wyrzut leków z komórek nowotworowych i zmniejszenie skuteczności terapii.
W ostatnim czasie opracowano i testowano liczne strategie mające na celu zwalczanie oporności wielolekowej nowo-
tworów. Ostatnio jedną z najbardziej obiecujących metod terapii okazała się interferencja RNA, określana jako RNAi.
Jest to etiologicznie konserwatywna odpowiedz
komórki na krótki, 2-niciowy RNA (dsRNA), prowadząca do specyficz-
nej, zależnej od sekwencji dsRNA inhibicji ekspresji homologicznego genu. Technika RNAi umożliwia specyficzne
zahamowanie ekspresji białek uczestniczących w powstawaniu fenotypu MDR. Rezultaty eksperymentów przeprowa-
dzanych w warunkach in vitro z wykorzystaniem techniki RNAi okazały się bardzo zachęcające. Daje to nadzieje
na szybsze i skuteczniejsze rozwiązanie problemu oporności wielolekowej u pacjentów z chorobami nowotworowymi.
SA
OWA KLUCZOWE: oporność wielolekowa, interferencyjny RNA (RNAi), potranskrypcyjne wyciszanie
ekspresji genów (PTGS)
Adres do korespondecji:
Dr n. biol. Ilona Bednarek
Zakład Biotechnologii i Inżynierii Genetycznej Śl. AM
ul. Narcyzów 1, 41 200 Sosnowiec
Tel./faks:([phone]
e-mail: [e-mail]
Annnales Academiae Medicae Silesiensis 2005, 59, 3, 209 218
Copyright © ÅšlÄ…ska Akademia Medyczna
ISSN 0208 56077
209
Ann. Acad. Med. Siles. 2005, 59, 3
Wstęp na celu ochronę komórek przed wniknięciem do ich wnę-
trza egzogennych substancji toksycznych, co potencjalnie
Choroby nowotworowe obecnie zalicza siÄ™ do jednej
mogłoby doprowadzić do śmierci komórki. Ze względu na
z najczęstszych przyczyn zgonów wśród populacji ludzkiej.
posiadane funkcje transportery rodziny ABC lub ich ana-
Wysoka śmiertelność często jest spowodowana zbyt póz
nÄ…
logi można spotkać w wielu organizmach nie tylko ludz-
lub nietrafną diagnostyką samej choroby oraz wciąż nie-
kich, ale i zwierzęcych, roślinnych czy bakteriach. Trans-
dostatecznie efektywną terapią. Są to między innymi przy-
portery ABC występują w różnych tkankach (np. płuca,
czyny, dla których wielu badaczy i lekarzy skupia się na
łożysko, jelito, mózg, serce, nerki). Białka rodziny ABC
opracowaniu skutecznej i wydajnej terapii nowotworów
mogą przenosić różne substraty, włączając jony, hormo-
zmniejszającej śmiertelność chorych.
ny, lipidy, leki i inne ksenobiotyki [5]. CharakterystykÄ™
Chemioterapia zajmuje ważne miejsce w leczeniu cho-
wybranych białek należących do rodziny ABC oraz białka
rób nowotworowych. Często obserwuje się dalszy wzrost
oporności płuc (LRP, lung resistance-related protein), któ-
komórek nowotworowych w obecności zastosowanego
remu również przypisuje się udział w powstawaniu feno-
chemioterapeutyku lub całej grupy zastosowanych związ-
typu MDR, przedstawiono w tabeli I.
ków. Wiąże się to głównie z wytworzeniem tzw. mecha-
W organizmie ludzkim transportery ABC pełnią bar-
nizmu oporności wielolekowej komórek nowotworowych.
dzo ważne funkcje fizjologiczne. Eliminacja ksenobioty-
Oporność wielolekowa (MDR, multidrug resistance) to
ków i toksyn jest niezbędna dla prawidłowego funkcjono-
swego rodzaju  fenomen komórek nowotworowych,
wania komórek wątroby, nerek czy układu pokarmowe-
dzięki któremu komórki eksponowane na działanie jed-
go. Ponadto białka transporterowe uczestniczą w regula-
nego czynnika chemioterapeutycznego rozwijajÄ… opor-
cji przepuszczalności komórek łożyska i ośrodkowego ukła-
ność krzyżową w stosunku do dużej grupy ksenobioty-
du nerwowego, będąc głównym elementem barier: łoży-
ków niezwiązanych ze sobą pod względem budowy struk-
skowej i krew mózg; tym samym zapobiegają one ekspo-
turalnej i funkcjonowania [1, 2]. W niektórych typach
zycji wrażliwych komórek nerwowych oraz komórek roz-
nowotworów obserwuje się również tzw. pierwotną opor-
wijającego się płodu na szkodliwe czynniki cytotoksyczne
ność wielolekową, objawiającą się bez wcześniejszej eks-
[2]. Białka ABC uczestniczą także w licznych procesach
pozycji na chemioterapeutyki [2]. Dotychczas nie pozna-
metabolicznych, a mutacja w obrębie genów kodujących
no całkowicie podstaw mechanizmu MDR, wiadomo jed-
te białka może prowadzić do poważnych chorób metabo-
nak, że etiologia fenotypu MDR jest złożona i wieloczyn-
licznych. Przykładami mogą być dziedziczny niedobór biał-
nikowa [2]. Oporność wielolekowa może zależeć m.in.
ka oporności wielolekowej 2 (MRP, multidrug resistance-
od: nadmiernej aktywacji enzymów detoksykacyjnych, za-
associated protein) powodujÄ…cy syndrom Dubina-Johnso-
burzeń w przekierowywaniu cyklu komórkowego na szlak
na, czy też niedobór MRP6, prowadzący do pseudoxan-
apoptotyczny (np. mutacje w obrębie genu p53, zachwia-
thoma elasticum  wielosystemowego zaburzenia ataku-
na równowaga białek pro- i antyapoptotycznych), nasi-
jącego skórę, oczy i naczynia krwionośne [5]. Budowa
lonego efluksu ksenobiotyków z komórki docelowej za
transporterów ABC jest ściśle podporządkowana pełnio-
pośrednictwem transporterów błonowych, czy wreszcie
nym przez nie funkcjom i wykazywanym własnościom, dla-
zmniejszonego wychwytu leku ze środowiska zewnątrz-
tego białka te mają w swej sekwencji aminokwasowej za-
komórkowego [1, 3]. Uważa się, że tylko dogłębne po-
wsze miejsce przyłączania ATP (Walker motifs), występu-
znanie mechanizmu plejotropowej oporności pozwoli ją
jące w obrębie cytozolowej domeny wiążącej nukleotydy
pokonać, a tym samym zwiększy zakres działania dotych-
(NBD, nucleotide binding domain) oraz kilka tandemo-
czas stosowanych leków cytotoksycznych oraz umożliwi
wych powtórzeń hydrofobowych domen transbłonowych,
syntezę nowych leków odpowiednio zmodyfikowanych
przybierających formy segmentów lub helis (TMD, trans-
w celu  omijania problemu oporności wielolekowej.
membrane domains). Sekwencje te są ułożone naprzemien-
nie [8]. Domena transbłonowa jest zaangażowana w przy-
Białka transportowe błon komórkowych łączanie substratu i jego efluks, domena wiążąca nukle-
jako główne czynniki odpowiedzialne otydy przyłącza ATP i uczestniczy w jego hydrolizie [4].
za zjawisko oporności wielolekowej W organizmach eukariotycznych większość białek ABC
ma zwykle 4 domeny, np. glikoproteina P ma strukturÄ™:
Etiologię klasycznej oporności wielolekowej najczęściej
NH2-TMD1-NBD1-TMD2-NBD2-COOH. Mniejsza gru-
łączy się z nadmierną ekspresją i nieprawidłowościami
pa białek rodziny ABC, określana mianem półtranspor-
w funkcjonowaniu białek transportowych błon komórko-
terów, ma pojedynczą domenę transbłonową i wiążącą
wych [2]. Białka te należą do nadrodziny białek ABC (ATP-
nukleotydy. Do tej grupy należy m.in. białko oporności
biniding cassette), których aktywność zależy od energii
raka piersi (BCRP, breast cancer resistance protein): NH2-
powstałej z hydrolizy ATP (adenosine triplosphate) [4].
-TMD1-NBD1-COOH [1]. Rodzinę białek ABC podzie-
Białka ABC są osadzone w błonach plazmatycznych i dzia-
lono zależnie od występujących podobieństw w budowie
łają jak pompy-transportery przenoszące określone sub-
domen transbłonowych i miejsc przyłączania nukleotydów.
straty przez błonę wbrew gradientowi stężeń do środowi-
Pierwszym opisanym transporterem błonowym, które-
ska zewnętrznego [1]. Działanie białek transportowych ma
go nadekspresja wykazywała związek z powstaniem
210
RNAi w modulacji oporności wielolekowej
Magdalena Czajka Uhryn i wsp., RNAi w modulacji oporności wielolekowej
RNAi w modulacji oporności wielolekowej
RNAi w modulacji oporności wielolekowej
RNAi w modulacji oporności wielolekowej
Tabela I. Charakterystyka wybranych transporterów rodziny ABC i białka LRP zaagażowanych w powstawanie fenotypu MDR, przykłady
ich substratów i miejsc wystepowania [5 7]
Table I. Characteristics of LRP protein and chosen ABC transporters involved in MDR phenotype forming; substrates and localization [5 7]
Gen Alternatywna nazwa Przykłady substratów Przykłady miejsca występowania
MDR1 ABCB1, PGY1, P-GP Kolchicyna, doxorubicyna, Tkanki o funkcji sekrecyjnej
winblastyna, winkrystyna
MRP1 ABCC1 Kolchicyna, etopozyd, VP16 PÅ‚uca, jÄ…dra
MRP2 ABCC2, cMOAT Winblastyna, sulfinpyrazon WÄ…troba, jelito, nerki
MRP3 ABCC3 Metotreksat, etopozyd Nerki, jelito
MRP4 ABCC4 Puryny i analogi nukleozydów Powszechnie w wielu tkankach
MRP5 ABCC5 Puryny i analogi nukleozydów, Wątroba, powszechnie w wielu tkankach
mitoxantron, topotecan, doxorubicyna
MRP6 ABCC6 Etopozyd, doxorubicyna WÄ…troba, nerki
MRP8 ABCC11 5-FU, ddC, PMEA Wątroba, gruczoły piersiowe
BCRP ABCG2, MXR1, ABCP Topotekan, daunorubicyna, doxorubicyna Mózg, nerki, płuca, serce
LRP Daunorubicyna Nabłonek oskrzeli, jelito,
komórki okładzinowe żołądka, kanaliki
proksymalne nerek, kora nadnerczy
MDR (multidrug resistance)  oporność wielolekowa; MRP (multidrug resistance-associated protein)  białka oporności wielolekowej; BCRP (breast cancer
resistance protein)  białka oporności raka piersi; LRP (lung resistance-related protein)  białka oporności płuc
oporności wielolekowej, była glikoproteina P (P-gp opisy- genu MDR1 w komórkach; może ona wynikać z charak-
wana również jako PGY1, MDR1, ABCB1). Jest ona zbu- teru tkanki, z której wywodzi się nowotwór, lub też być
dowana z 2 domen transbłonowych (każda złożona z 6 seg- rezultatem zmian w ekspresji genu represyjnego dla genu
mentów transbłonowych), które oddziałują z wieloma obo- MDR. W tym przypadku chemioterapia ma mały wpływ
jętnymi lub dodatnio naładowanymi substancjami hydro- na rozwój fenotypu MDR. Oporność nabyta powstaje na
fobowymi. Zbliżoną budową charakteryzują się także biał- bazie komórek nowotworowych pierwotnie wrażliwych na
ka MRP4 i MRP5, podczas gdy MRP1, MPR2, MRP3 oraz chemioterapiÄ™. W czasie leczenia dochodzi do pojawienia
MRP6 mają 5 dodatkowych segmentów transbłonowych się i wzrostu subpopulacji zmutowanych komórek, cechu-
na N-końcu [5]. Dotychczas poznano i opisano 48 białek jących się nadekspresją glikoproteiny P. W tym przypadku
należących do rodziny ABC. W przypadku 10 białek udo- chemioterapia eliminuje tylko wrażliwe komórki, a zmu-
wodniono ich ścisły związek z powstawaniem oporności towana grupa komórek pozostaje i nadal się rozwija. Trzeci
wielolekowej (np. MDR1, MRP1-6, BCRP), podczas gdy typ oporności, określany też jako indukowany, dotyczy
nadekspresję 2 innych białek łączy się z powstawaniem komórek nowotworowych pierwotnie wrażliwych na leki,
fenotypu MDR [2]. W przypadku posiadania przez ko- które nagle pod wpływem stosowanej chemioterapii in-
mórkę fenotypu oporności wielolekowej, związanego z nad- dukują nasiloną ekspresję genu MDR1, co pozwala im na
ekspresją białek rodziny ABC, dochodzi do nadmierne- przetrwanie terapii i dalszy rozwój [5]. Inną przyczyną
go, niekontrolowanego wyrzutu substancji egzogennych nasilonego wyrzutu leku z komórek może być nieprawi-
z komórki za pośrednictwem transporterów ABC. Powo- dłowa ekspresja białek rodziny ABC. Zmieniona, wadli-
duje to znaczny spadek akumulacji leku w przestrzeni wew- wa ekspresja białek transportowych może tłumaczyć fakt
nątrzkomórkowej, co prowadzi do zmniejszenia ilości te- istnienia tak dużej rozbieżności w budowie strukturalnej
rapeutyku mogącego osiągnąć swoje miejsce docelowe. substratów przenoszonych przez jeden transporter. Doy-
Ostatecznie obserwuje się spadek skuteczności leku le i Ross potwierdzili, że mutacja w obrębie białka BCRP
i w efekcie terapia jest nieskuteczna. PrzyczynÄ… nasilone- w pozycji 482 polegajÄ…ca na wymianie aminokwasu (argi-
go efluksu może być nadmierna ekspresja białek trans- niny na treoninę lub glicynę) zmienia specyficzność sub-
portowych. Według Scotto oporność wielolekową nowo- stratową tego białka [1]. Wystąpienie u pacjenta oporno-
tworu, związaną z nadekspresją białka P-gp, można po- ści komórek nowotworowych wobec przyjmowanego leku
dzielić zależnie od mechanizmu jej powstania na 3 typy: wymusza zwiększenie stosowanej dawki leku lub włączenie
oporność pierwotną, nabytą i przejściową [5]. Pierwotna do terapii dodatkowych, farmakologicznie aktywnych czyn-
oporność wiąże się z nasiloną konstytutywną ekspresją ników w celu uzyskania pożądanego efektu terapeutycz-
211
Ann. Acad. Med. Siles. 2005, 59, 3
nego. To jednak automatycznie wiąże się ze wzrostem tok- cyficzne komponenty (np. kompleks przenoszący sygnał
syczności i zwiększeniem działań niepożądanych terapii. zainicjowany przez stymulację metaboliczną lub środowi-
skową) [5]. Konstytutywna ekspresja niektórych białek, np.
glikoproteiny P lub MRP, może w niektórych komórkach
Możliwości tłumienia zjawiska oporności
podlegać regulacji przez komponenty zaangażowane
wielolekowej. Chemouczulacze
w transformację nowotworową komórki. Istnieją donie-
W związku z coraz częstszym pojawianiem się oporno- sienia potwierdzające fakt, że forma dzika białka p53 może
ści nowotworu na stosowane chemioterapeutyki, koniecz- wyciszać transkrypcję genu MDR1, podczas gdy całkowi-
ne okazało się poszukiwanie nowych strategii terapii w celu ta inhibicja ekspresji białka p53 lub obecność w komórce
odwrócenia czy zapobiegania oporności wielolekowej [9]. niektórych mutantów białka p53 może aktywować ekspre-
Duże nadzieje wiązano z tzw. terapią objawową, polega- sję genu MDR1 [13 15]. Ponadto induktorami ekspresji
jącą na opracowaniu czynnych farmakologicznie modula- białka P-gp mogą być: metale ciężkie, szok termiczny, sta-
torów MDR, tzw. chemouczulaczy, których działanie spro- ny zapalne, kancerogeny, hipoksja oraz promieniowanie
wadza siÄ™ do inhibicji funkcjonowania pomp-transporte- X i UV [5, 16].
rów, a tym samym  zmniejszania wyrzutu leku z komór- Alternatywnym sposobem modulowania ekspresji bia-
ki. Działanie stosowanych chemouczulaczy często spro- łek rodziny MDR jest inhibicja zachodząca na poziomie
wadza się do wypierania leków z ich połączeń z pompami translacji. W tym przypadku celem modulacji staje się
na podstawie mechanizmu inhibicji konkurencyjnej [10]. matrycowy RNA znajdujÄ…cy siÄ™ w cytoplazmie. Dotych-
Do najczęściej stosowanych inhibitorów MDR stosowa- czasowe próby inhibicji translacji polegały m.in. na wpro-
nych w warunkach in vitro należą blokery kanałów wap- wadzaniu do komórki specjalnie zaprojektowanych oligo-
niowych, antagoniści kalmoduliny, peptydy hydrofobowe, nukletydów antysensownych, które posiadają sekwencję
antybiotyki, inhibitory kinazy białkowej, pochodne hor- komplementarną do wybranego odcinka mRNA, przyłą-
monów lub flawonidy [11]. Dużą przeszkodą w wykorzy- czają się do niego, uniemożliwiając syntezę łańcucha pep-
stywaniu modulatorów MDR okazała się konieczność sto- tydowego [12, 17]. Inną techniką wyciszania genów docelo-
sowania ich w bardzo dużych dawkach w celu uzyskania wych na poziomie mRNA jest stosowanie rybozymów, czyli
niezbędnego wewnątrzkomórkowego stężenia prowadzą- oligonukleotydów o właściwościach katalitycznych. Oligo-
cego do ujawnienia się ich działania cytotoksycznego [12]. nukleotydy te, odpowiednio zaprojektowane, przyłączają się
Duże dawki chemouczulaczy mogą jednak powodować do docelowego mRNA i dzięki posiadanej aktywności en-
wiele poważnych działań niepożądanych terapii, jak np. donukleazy przecinają łańcuch nukleotydowy mRNA, unie-
zaburzenia przewodzenia w komórkach mięśnia sercowe- możliwiając tym samym syntezę określonego białka.
go, hipotensja, hiperbilirubinemia, czy immunosupresja Nową, konkurencyjną i, jak się często podkreśla, bar-
[12]. Dodatkowo wiele modulatorów MDR oddziałuje dziej wydajną i specyficzną techniką wyłączania genów jest
z innymi białkami transportującymi oraz licznymi układa- metoda interferencji RNA (RNAi, RNA interference).
mi enzymatycznymi (np. wywołują izoenzym 3A4 cytochro- Mimo że jest to stosunkowo nowa metoda, to jej wysoka
mu p450), prowadząc do nieprzewidywalnych interakcji specyficzność i potencjalne możliwości zastosowania w na-
farmakokinetycznych [4]. Innym niezwykle istotnym utrud- uce i medycynie budzą coraz większe zainteresowanie.
nieniem terapii z udziałem chemouczulaczy stało się wy- Świadczyć o tym może ciągle rosnąca liczba publikacji na-
twarzanie przez niektóre nowotwory tzw. trzeciorzędowej ukowych poświęconych tematyce RNAi, np. liczba wyszu-
oporności, w tym wypadku skierowanej wobec stosowa- kanych artykułów w bazie internetowej PubMed
nych modulatorów MDR [12]. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) na hasło  RNA interferen-
ce w 1998 roku wynosiła 5 publikacji, w 2000 roku  71,
a w 2003 roku  już 898 i obecnie liczba ta nieustannie
Regulacja zjawiska oporności wielolekowej
wzrasta. Warto również uwzględnić fakt, że czasopismo
na poziomie ekspresji genów
 Science uznało odkrycie RNAi za przełomowe wyda-
Ze względu na liczne przeszkody w modulowaniu zja- rzenie 2002 roku.
wiska MDR na poziomie białek zaangażowanych w ten
proces alternatywą stała się terapia przyczynowa, obejmu-
Metoda RNAi  regulator ekspresji genów
jąca regulację ekspresji białek ABC. Regulacja procesu
transkrypcji wiąże się z zastosowaniem inhibitorów wią- Pierwsze doniesienia o możliwości wyciszania genów
żących się z matrycowym DNA (np. oligonukletydów, bia- przy udziale RNA opublikowano w połowie lat 90. XX
łek, związków chemicznych) lub modulacją działania re- wieku. Wówczas Guo i Kemphus oświadczyli, że po wpro-
gulatorów transkrypcji. Regulacja transkrypcji jest proce- wadzeniu do organizmu nicienia Caenorhabditis elgans
sem bardzo złożonym, gdyż każda grupa genów podlega mieszaniny sensownego i antysensownego RNA zaobser-
regulacji przez wyspecjalizowany, wielobiałkowy kompleks wowali wyciszenie odpowiedniego, komplementarnego
zawierający zarówno wspólne, podstawowe komponenty genu. Tę informację zgłębił Fire, który wraz ze współpra-
(np. czynniki transkrypcyjne), jak również unikatowe, spe- cownikami w 1998 roku ogłosił, że to właśnie 2-niciowy
212
RNAi w modulacji oporności wielolekowej
Magdalena Czajka Uhryn i wsp., RNAi w modulacji oporności wielolekowej
RNAi w modulacji oporności wielolekowej
RNAi w modulacji oporności wielolekowej
RNAi w modulacji oporności wielolekowej
RNA odpowiada za proces wyciszania genów w Caenor- Uważa się, że enzymy RNazy III działają jako dimery, dla-
habditis elegans [18]. Od tego czasu w celu pełniejszego tego DICER dzięki posiadanym dwóm domenom RNazy
opisania eksperymentalnego wykorzystania RNA do in- III może katalizować jednorazowo przerwanie wiązań fos-
hibicji ekspresji nowo odkrytą metodę zaczęto określać fodiestrowych kwasu nukleinowego w 4 miejscach, two-
mianem RNA interference (RNAi). Mechanizm RNAi za- rząc w ten sposób siRNA o typowej charakterystyce. Do-
obserwowano również w organizmach roślin, niektórych tychczas odkryte enzymy RNazy III nie wymagały do swo-
bezkręgowców i kręgowców. Następnie dowiedziono, że jego funkcjonowania energii czerpanej z hydrolizy ATP,
jest to ewolucyjnie konserwatywny mechanizm obecny od tym bardziej może zastanawiać obecność domeny ATP-
dawna w świecie zwierzęcym i roślinnym [9, 19]. Fizjolo- -zależnej w strukturze DICER. Jednak domena helikazo-
giczna rola mechanizmu RNAi sprowadza się głównie do wa może sugerować konieczność chwilowego rozdziele-
ochrony genomu komórki gospodarza przed inwazją mo- nia nici dsRNA tuż przed przecięciem 2-niciowego RNA
bilnych nośników informacji genetycznej, takich jak trans- [33]. Alternatywnie ATP może regulować przyłączanie się
pozony czy wirusy [19 23]. Podejrzewa się również, że DICER do dsRNA lub modulować aktywność domeny
cząstki 2-niciowego RNA zaangażowane w mechanizm katalitycznej. Należy jednak podkreślić, że badania pro-
RNAi mogÄ… odpowiadać za metylacjÄ™ wybranych sekwen- wadzone przez Nykänen i wsp. jednoznacznie wskazujÄ…
cji promotorowych DNA, hamując w ten sposób transkryp- na udział energii pochodzącej z rozpadu ATP w procesie
cję wybranych genów [24 26]. Możliwe, że metylacja DNA generowania krótkich siRNA [34]. Różnice w długościach
ma na celu inhibicję rozwoju retrowirusów, których mate- powstających małych interferencyjnych RNA (21 25 nu-
riał genetyczny zintegrował się z genomem zainfekowa- kleotydów) u różnych organizmów mogą wynikać z typo-
nej komórki [27]. W ostatnio prowadzonych badaniach na wych dla danego gatunku zmian w domenach katalitycz-
komórkach drożdży dowiedziono, że mutanty pozbawio- nych enzymu DICER [35]. W przypadku ludzkich komó-
ne komponentów niezbędnych do istnienia zjawiska RNAi rek niestety nie jest możliwe zainicjowanie zjawiska RNAi
tracą zdolność do metylacji chromatyny i supresji trans- przez wprowadzenie długołańcuchowego dsRNA. Prze-
pozonów w genomie [28]. Może to sugerować wpływ me- szkodą jest indukcja w komórkach większości ssaków nie-
chanizmu RNAi na strukturę chromatyny w jądrze komór- specyficznej odpowiedzi interferonowej. Odpowiedz
in-
kowym. Jak dotąd w pełni nie poznano mechanizmu dzia- terferonowa jest swego rodzaju mechanizmem obronnym
łania RNAi. Pierwsze obserwacje przebiegu RNAi po- komórek, uruchamianym m.in. w czasie infekcji wiruso-
twierdzały istnienie korelacji między destabilizacją mRNA wych. W odpowiedzi tej wprowadzony obcy materiał ge-
a wprowadzaniem komplementarnego netyczny aktywuje kinazę białkową zależną od dsRNA
dsRNA do komórki [29, 30]. (PKR, dsRNA-dependent protein kinase) oraz 2 ,5 -oligoA
Obecnie wiadomo, że RNAi przebiega w komórkach syntetazę (2 ,5 -AS) [36 38]. Aktywna forma PKR powo-
w 2 etapach: inicjacyjnym i efektorowym. Mechanizm duje zahamowanie translacji poprzez fosforylację małej
RNAi zostaje w komórce zainicjowany przez enzym nale- podjednostki eukariotycznego czynnika inicjacji trans-
żący do rodziny RNazy III. Enzym ten specyficznie tnie lacji eIF2a, a zaaktywowana 2 ,5 -AS katalizuje proces
wprowadzoną do komórki, długą, 2-niciową cząsteczkę degradacji mRNA za pośrednictwem rybonukleazy L [36
RNA (zarówno pochodzenia egzo- lub endogennego) na  38]. Zainicjowana inhibicja ekspresji genów ma charak-
krótkie, długości rzędu 21 23 nukleotydów dsRNA ter niespecyficzny i nie zależy od sekwencji wprowadzo-
(dsRNA, double stranded RNA) [23, 31]. Powstałe krótkie nego długoniciowego dsRNA, a częstym jej następstwem
oligonukleotydy, określane mianem siRNA (siRNA, short jest szybka śmierć komórki (zarówno na drodze apopto-
interefering RNA), mają po 2 3 niesparowane nukleotydy zy, jak i na ścieżce nieapoptotycznej) [22]. Ścieżki interfe-
na każdym końcu 3 (tzw. lepkie końce), grupę fosfora- ronowej nie stwierdzono w niezróżnicowanych komórkach
nową na końcach 5 oraz hydroksylową na końcach 3 . Jed- embrionalnych, co umożliwiło zainicjowanie specyficzne-
na z nici siRNA, określana jako antysensowna, ma sekwen- go wyciszania ekspresji genów za pomocą długiego dsR-
cję nukleotydów komplementarną do sekwencji mRNA NA w mysich oocytach lub embrionach, jak również ko-
wybranego odcinka docelowego genu. Taka budowa po- mórkach nowotworowych wywodzących się z komórek em-
wstałych krótkich, interferujących oligonukleotydów RNA brionalnych [38, 39]. Ta ostatnia informacja jest bardzo
(siRNA) jest niezbędna do prawidłowego przebiegu eta- istotna dla prowadzenia dalszych badań nad nowotwora-
pu efektorowego [32]. Enzym katalizujący reakcję  cię- mi wywodzącymi się z tego typu komórek. Kittler i Buch-
cia długiego dsRNA należy pod względem swojej budo- holz w swoich badaniach stwierdzili, że minimalna dłu-
wy do III klasy enzymów RNazy III. Rodzina enzymów gość dsRNA, która indukuje śmierć komórki w następ-
III klasy, nazwana DICER, jest ewolucyjnie konserwatyw- stwie odpowiedzi interferonowej dla komórek ssaków,
na i można ją znalez
ć w wielu organizmach w świecie roś- wynosi 30 par zasad [40]. Przeszkodę tę ostatecznie poko-
linnym i zwierzęcym [33]. Rodzina DICER składa się nano, wprowadzając do komórek gotowe, laboratoryjnie
z N-końcowej domeny helikazowej, zależnej od ATP, do- syntetyzowane 21- 22-nukleotydowe siRNA [20, 22].
meny PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille), podwójnej domeny Etap efektorowy, obejmujący degradację mRNA, za-
RNazy III i domeny przyłączającej dsRNA (dsRBD) [33]. chodzi w cytoplazmie, w przeciwieństwie do etapu inicju-
213
Ann. Acad. Med. Siles. 2005, 59, 3
jącego, który wg Waterhouse a może wystąpić w jądrze
komórkowym [27]. Hipotezę o przebiegu etapu efektoro-
wego w cytoplazmie prawdopodobnie potwierdzajÄ… bada-
nia z wykorzystaniem znaczników fluorescencyjnych wpro-
wadzonych do siRNA, które wykazały, że w 48 godzin po
transfekcji oligonukleotydy znajdowały się w pobliżu bło-
ny jądrowej po stronie cytoplazmy [41]. Istnieją założe-
nia, że siRNAs znajdują się w cytoplazmie w pobliżu por
błony jądrowej i odgrywają rolę, tzw.  skanerów trans-
kryptów wydostających się z jądra komórkowego, dzięki
czemu mogą kontrolować większość mRNA wchodzących
do cytoplazmy [41]. Powstałe siRNAs przyłączają się do
wielobiałkowego kompleksu enzymatycznego, określane-
go jako RISC (RISC, RNA-induced silencing complex),
który następnie ulega aktywacji. Przejście RISC ze stanu
latencji do stanu aktywnego odbywa siÄ™ na drodze roz-
działu nici kwasów nukleotydowych siRNA [11, 34]. Jed-
noniciowe siRNAs przyłączone do RISC występują w roli
przewodnika i naprowadzajÄ… kompleks na homologiczny
mRNA. Nie stwierdzono jednak dokładnie, który enzym
odpowiada za proces rozdziału nici siRNA; podejrzewa
się udział helikazy [29]. Istnieją także dowody, że proces
rozdziału nici RNA zależy od energii dostarczonej z hy-
drolizy ATP [34]. Należy podkreślić, że rozpoznawanie
sekwencji docelowej mRNA przez naprowadzającą nić
siRNA jest bardzo specyficzne  wystarczy niezgodność
1 2 nukleotydów między mRNA a 1-niciowym RNA na-
prowadzajÄ…cym, by zapobiec dopasowaniu siÄ™ RISC do
danego fragmentu mRNA i tym samym uniemożliwić
jego degradację. Uważa się, że antysensowna nić siRNA
Rycina 1. Mechanizm RNAi w wyciszaniu genów
naprowadza kompleks enzymatyczny na docelowy trans-
Figure 1. RNAi mechanism in gene silencing
krypt, dlatego w przypadku nici sensownej siRNA 2 lub
3 niesparowane nukleotydy na końcu 3 nie muszą być
komplementarne do degradowanego mRNA. Po znale-
zieniu komplementarnej sekwencji docelowej następuje białek Argonaute, co z kolei sprzyja ich wiązaniu z cząs-
hybrydyzacja RISC do mRNA i kompleks enzymatyczny teczkami kwasu nukleinowego [43]. Dodatkowym i bar-
przecina hybrydę: siRNA/mRNA w miejscu znajdującym dzo istotnym  fenomenem RNAi jest możliwość jego
się w środku (w odległości około 10 12 nukleotydów od rozprzestrzeniania się na komórki sąsiednie i potomne.
końca 3 ) rozpoznanej 21-nukleotydowej sekwencji [37]. Mechanizm tego procesu sugeruje jednoznacznie koniecz-
Nie poznano dokładnie enzymu odpowiedzialnego za ność obecności w komórce enzymu amplifikującego efekt
przecięcie obu nici, wiadomo jednak, że musi on posia- wyciszania. Podejrzewa się, że rolę tę pełni polimeraza
dać właściwości endonukleazy. Według Waterhouse a oba RNA zależna od RNA [22]. Byrom i wsp. wykazali, że
etapy mechanizmu RNAi można ująć w następującym w czasie podziału komórek siRNA jest zlokalizowane do-
stwierdzeniu: najpierw dsRNA jest przecinany periodycz- kładnie w centralnym regionie komórki, co sugeruje, że
nie, w odstępach ~21 nukleotydów od strony obu koń- jest przekazywany obu komórkom potomnym [41]. Nie-
ców dsRNA, a następnie docelowy mRNA ulega prze- stety, badania wykazują, że w przypadku ssaków efekty
cięciu z tą sama częstotliwością, ale w miejscu nacięcia wywołane RNAi mają charakter przejściowy, okres jego
przesuniętym o ~10 nukleotydów [27]. Mechanizm utrzymywania się zależy od liczby wprowadzonych cząstek
RNAi schematycznie przedstawiono na rycinie 1. siRNA oraz częstości podziału komórek [41]. Według
Przypuszcza się, że duży udział w procesie RNAi mogą Kima czas utrzymywania się efektu RNAi w komórkach
odgrywać białka należące do rodziny Argonaute, zwane ssaków równa się 5 czasom podwojenia liczby komórek
czasem ze względu na swoją budowę białkami PPD (PPD, (five doubling limest) [44]. Wskazuje to raczej na brak me-
PAZ and PIWI domains) [34, 42]. Białka te mogą odpo- chanizmu amplifikującego w komórkach ssaków. Stwier-
wiadać za interakcje z DICER lub spełniać funkcję prze- dzenie to prawdopodobnie potwierdza fakt, że zaledwie
nośnika siRNA do odpowiedniego kompleksu enzymatycz- kilka molekuł potrzeba do wywołania RNAi w Caenor-
nego. Może za tym przemawiać silnie zasadowy charakter habditis elegans, podczas gdy w ludzkich komórkach po-
214
RNAi w modulacji oporności wielolekowej
Magdalena Czajka Uhryn i wsp., RNAi w modulacji oporności wielolekowej
RNAi w modulacji oporności wielolekowej
RNAi w modulacji oporności wielolekowej
RNAi w modulacji oporności wielolekowej
trzebna jest znacznie większa liczba wprowadzonego tańszą metodą jest enzymatyczny proces preparowania
siRNA do uzyskania tego samego efektu wyciszenia [9]. czÄ…stek siRNA poprzez kontrolowanÄ… inkubacjÄ™ w warun-
Warto nadmienić, że mechanizm RNAi uznaje się za kach in vitro długoniciowego dsRNA z oczyszczoną RNazą
jeden ze składowych mechanizmów ogółu procesów po- III, wyizolowaną z Escherichia coli lub też z oczyszczoną
transkrypcyjnego wyciszania ekspresji genów (PTGS, formą enzymu DICER [36, 49, 50]. Powstałe w wyniku
post-transcriptional gene silencing). W potranskrypcyjnej inkubacji produkty, określane często mianem esiRNA
regulacji ekspresji genów oprócz siRNA mogą uczestni- (esiRNA, endoribonuclease-prepared short interfering
czyć również inne cząstki kwasu rybonukleinowego. Przy- RNA), są mieszaniną cząstek RNA przyłączających się w
kładem takich cząstek są miRNA (miRNA, microRNA) wielu miejscach docelowego fragmentu mRNA, co znacz-
 krótkie cząsteczki RNA o długości około 22 nukle- nie zwiększa szanse powodzenia eksperymentu [36, 49, 50].
otydów, które podobnie jak siRNA są ewolucyjnie kon- Inną metodą dającą szanse nawet na otrzymanie względ-
serwatywne i występują w świecie roślin i zwierząt. Cząst- nie trwałej ekspresji, a tym samym wysokiej produkcji siR-
ki miRNA w odróżnieniu od siRNA są 1-niciowe. Inhi- NA w komórce, jest projektowanie odpowiednich ekspre-
bicja ekspresji genu przy udziale miRNA odbywa się syjnych wektorów plazmidowych czy wektorów wirusowych
prawdopodobnie poprzez tworzenie hybryd miRNA/ [51]. Wektory te sÄ… zbudowane z DNA i zawierajÄ… wbudo-
mRNA, co uniemożliwia prawidłowy przebieg procesu wane sekwencje DNA, odpowiadające sekwencjom obu
translacji docelowych transkryptów. W tym przypadku nici siRNA. Poszczególne sekwencje DNA znajdują się
nie obserwuje się degradacji mRNA; parametry, takie pod kontrolą określonych, odrębnych promotorów, dzię-
jak stabilność mRNA, poziom poliadenylacji czy inicja- ki czemu ekspresja obu nici siRNA może przebiegać nie-
cja translacji wydają się być niezmienione [45]. Dotych- zależnie [52]. Bardziej wydajna i korzystna okazała się
czas jednoznacznie potwierdzono udział miRNA w re- ekspresja siRNA w formie struktury  krótkiej spinki do
gulacji czasu trwania poszczególnych etapów rozwoju włosów (shRNA, short hairpin RNA). Gdy shRNA ule-
nicienia Caenorhabditis elegans [46]. Nadal poszukuje się gnie ekspresji w komórce, jest rozpoznawana przez DI-
istnienia pewnych analogii między miRNA a mechani- CER i pocięta w celu otrzymania funkcjonalnego siRNA
zmem RNAi. Godnym uwagi jest fakt, że zarówno siR- [21]. Zaletą shRNA jest fakt, że w czasie generowania
NA, jak i miRNA, powstają w komórce na skutek dzia- wektora DNA niezbędny jest tylko 1 etap ligacji, czyli włą-
Å‚ania enzymu DICER na terenie cytoplazmy. Szlak po- czania sekwencji DNA odpowiadajÄ…cej sekwencji shRNA,
wstawania miRNA jest jednak charakterystyczny  pre- do struktury wektora [21].
kursory miRNA (pri-miRNA oraz pre-miRNA) dojrze- Wektory wirusowe  zbudowane na bazie retrowiru-
wają na terenie jądra komórkowego, następnie pre-miR- sów czy lentiwirusów  zwiększają pulę komórek docelo-
NA przedostają się do cytoplazmy, przyjmując strukturę wych, gdyż mają one zdolność infekowania komórek dzie-
przestrzenną typu  spinki do włosów (hairpin). W cyto- lących się i nieulegających podziałom. Wektory lentiwiru-
plazmie nukleaza DICER przecina je i powstają cząstki sowe mogą uczestniczyć w inicjacji procesu RNAi w ko-
miRNA [47]. mórkach macierzystych i transgenicznych modelach zwie-
Badacze są zdania, że mimo licznych w ostatnim czasie rząt. Przy wykorzystaniu zrekombinowanych wektorów
odkryć wielu nowych cząstek RNA, pełniących istotne adenowirusowych udało się wyciszyć ekspresję genu ko-
funkcje katalityczne czy regulatorowe, znaczna ich część dującego białko p53 w komórkach nowotworu piersi
nadal pozostaje nieodkryta [48]. Nasuwa to przypuszcze- (linia komórkowa MCF7) i nowotworu płuc (linia komór-
nie, że w przyszłości liczba cząstek RNA zaangażowanych kowa A549) [53]. Uważa się jednak, że wektory adenowi-
w proces PTGS może jeszcze wrosnąć. rusowe, choć wysoce wydajne, pozwalają tylko na przej-
ściową ekspresję siRNA [53]. Z wektorami wirusowymi
i plazmidowymi wiąże się duże nadzieje na wzrost specy-
Egzogenne krótkie oligonukleotydy (siRNA)
ficzności terapii względem komórek docelowych, gdyż wy-
jako regulatory ekspresji genów
bór odpowiedniego, tkankowo-specyficznego promotora
W przypadku ludzkich komórek w celu wyciszenia umożliwi ekspresję wektora tylko w wybranych komórkach.
genu za pomocą RNAi konieczne jest wprowadzenie Istotną rolę w wydajności RNAi ma również dobór
gotowych oligonukleotydów siRNA. Jest to proces skom- metody transferu do wybranych komórek siRNAs lub
plikowany, ponieważ wymaga wcześniejszego zaprojek- wektorów kodujących siRNA. Obecnie najczęściej wyko-
towania siRNA. Należy precyzyjnie dobrać sekwencje rzystywaną metodą transfekcji jest metoda chemiczna
docelową z uwzględnieniem struktury drugorzędowej z udziałem czynników lipofilowych. W piśmiennictwie ist-
docelowego mRNA i wykluczeniem obecności w geno- nieje wiele doniesień potwierdzających wysoką wydajność
mie komórki drugiej, identycznej sekwencji nukleotydów RNAi w komórkach ludzkich po wprowadzeniu siRNA
[44]. Laboratoryjna synteza czÄ…stek siRNA jest metodÄ… metodÄ… lipofekcji [9, 12, 26]. AlternatywnÄ… technikÄ… wpro-
bardzo kosztowną  tym bardziej, że często konieczne wadzania siRNA do komórek jest elektroporacja; jednak
jest kilkakrotne projektowanie oligonukleotydów dla 1 ze względu na wysoką śmiertelność transferowanych ko-
docelowego transkryptu. Alternatywną i niewątpliwie mórek metodę tę stosują rzadziej.
215
Ann. Acad. Med. Siles. 2005, 59, 3
Metoda RNAi  sposób na modulację MDR interakcji ze struktura drugorzędową mRNA [12]. Ponadto
w obu eksperymentach zauważalne były różnice w wydaj-
Metoda RNAi jest nowatorskim sposobem wyciszania
ności wyciszania tego samego genu zależnie od rodzaju
genów, który będzie mógł przyspieszać rozwój terapii cho-
badanych komórek nowotworowych. Może to świadczyć
rób nowotworowych, również w aspekcie znoszenia czy
o specyficzności tkankowej mechanizmu RNAi, czyli o róż-
osłabiania oporności wielolekowej komórek nowotworo-
nych zdolnościach komórek, wywodzących się z poszcze-
wych. Badania nad modulacjÄ… MDR w nowotworach
gólnych tkanek do wychwytu siRNA lub o innej efektyw-
z wykorzystaniem opisanej powyżej metody prowadziły
ności samego procesu RNAi w poszczególnych tkankach
m.in. dwie grupy naukowe, które wyniki swoich ekspery-
[12]. Oba przeprowadzone eksperymenty dowiodły wyso-
mentów badawczych opublikowały w 2003 roku. Nieth
kiej specyficzności siRNA względem sekwencji docelowej.
i wsp. podjęli próbę inhibicji ekspresji jednego z białek
Świadczyć o tym może niezmieniona ekspresja białek kon-
transporterowych rodziny ABC  glikoproteiny P (P-gp),
trolnych przy zachodzącym jednocześnie spadku ekspre-
produktu ekspresji genu MDR1. W swoich eksperymen-
sji glikoproteiny P. Ponadto Wu i wsp. ocenili zdolność
tach Nieth wykorzystał ludzkie komórki wywodzące się
transfekowanych komórek do akumulacji leków. Wyniki
z nowotworów żołądka i trzustki [12]. Z kolei Wu i wsp. pró-
ich badania jednoznacznie wykazały, że wzrosła zdolność
bowali wyciszyć ekspresję genu MDR1, w liniach komórko-
akumulacji w komórkach tylko leków będącymi substra-
wych wyprowadzonych z raka piersi i raka jajników [9].
tami dla P-gp, podczas gdy akumulacja innego leku nie
Linie komórkowe wykorzystane w obu eksperymentach
zmieniła się [9]. Uzyskana przez badaczy inhibicja ekspresji
charakteryzowały się nadmierną ekspresją glikoproteiny
białka rodziny ABC w obu przypadkach miała charakter
P uzyskaną w wyniku wcześniejszej ekspozycji komórek
przejściowy i po kilku dniach poziom ekspresji MDR1
na działanie leku wywołującego, będącego substratem dla
wracał do stanu wyjściowego. Nieth i wsp. zaobserwowali,
P-gp. Obie grupy naukowców prowadziły badania w wa-
że widoczny efekt działania RNAi na poziomie białka jest
runkach in vitro i próbowały zainicjować mechanizm RNAi
nieco przesunięty w czasie względem spadku stężenia
przez wprowadzenie do komórek metodą lipofekcji goto-
mRNA [12]. Wiąże się to prawdopodobnie z długim cza-
wych egzogennych siRNAs. Badaczom udało się przepro-
sem półtrwania białek P-gp (14 17 godzin).
wadzić RNAi w komórkach nowotworowych, w następ-
Osiągnięto zamierzony cel w obu grupach badawczych.
stwie czego uzyskano obniżoną ekspresję genu MDR1, co
Dzięki metodzie RNAi udało się wpłynąć na ekspresję
znalazło swoje odzwierciedlenie zarówno na poziomie
białka odpowiedzialnego za powstanie fenotypu oporno-
transkryptu  mRNA , jak i białka  glikoproteiny P.
ści wielolekowej komórek nowotworowych, co pozwoliło
Potwierdziły to obie grupy na podstawie techniki Western
na wzrost (choć przejściowy) stężenia wewnątrzkomórko-
Blot i odwrotnej transkrypcji sprzężonej z łańcuchową re-
wego stosowanego leku. Stwarza to nowe możliwości
akcjÄ… polimerazowÄ… (RT-PCR, reverse transcription-poly-
i budzi wielkie nadzieje na modyfikacjÄ™ MDR nowotwo-
merase chain reaction). Nieth i wsp. obniżyli poziom eks-
rów przy użyciu RNAi, co z kolei byłoby szansą na sku-
presji P-gp do 9% w przypadku linii komórkowej nowo-
teczna terapiÄ™ antynowotworowÄ… dla wielu chorych.
tworu trzustki (91% aktywności wyciszania genu), a do
13% (87% aktywności wyciszania genu) dla komórek no-
wotworu żołądka [12]. Oporność badanych linii komórko-
Perspektywy wykorzystania metody RNAi
wych wobec stosowanego leku spadła do 42% wartości po-
Metoda RNA interference jest narzędziem o wielu moż-
czątkowej dla komórek trzustki, a dla komórek żołądka
liwościach, dzięki czemu znajduje duże zastosowanie w na-
 do 11% wartości początkowej [12]. Ze względu na róż-
uce i medycynie. Odkrycie RNAi umożliwiło tzw. funk-
nice w procedurach eksperymentów trudno bezpośrednio
cjonalną analizę genomu wielu organizmów, a także lep-
porównać wyniki eksperymentów Nietha i wsp. z efektami
sze poznanie funkcji niektórych genów w komórkach bak-
pracy Wu i wsp. Należy jednak wspomnieć, że maksymalna
teryjnych czy roślinnych [54, 55]. Metoda RNAi umożli-
inhibicja ekspresji P-gp w badaniach Wu wynosiła 65% [9].
wia także regulację czasu trwania poszczególnych etapów
Wyniki obu opisanych eksperymentów badawczych
rozwoju w Caenorhabditis elegans [56]. Uważa się, że od-
dostarczyły nowych i bardzo przydatnych wskazówek i spos-
krycie mechanizmu RNAi znacznie przyspieszy i ułatwi
trzeżeń dotyczących stosowania i mechanizmu RNAi
poznanie funkcji wszystkich genów zawartych w genomie
w modulacji MDR nowotworów. Przede wszystkim obser-
ludzkim. Obecnie część naukowców, wykorzystując tech-
wacje te potwierdziły możliwość zainicjowania i efektyw-
nikę RNAi, bada funkcje genów podejrzanych o udział
nego działania RNAi w ludzkich komórkach nowotworo-
w procesie transformacji nowotworowej komórek. Są
wych. Nieth i wsp., testując kilka różnych sekwencji
siRNA, wywnioskowali, że w wyborze sekwencji docelo- wśród nich geny kodujące białka uczestniczące w proce-
wej warto sugerować się sprawdzonymi dotychczas sekwen- sie apoptozy, w regulacji cyklu komórkowego, transdukcji
sygnału wewnątrzkomórkowego czy białka supresorowe
cjami mRNA dla oligonukleotydów antysensownych czy
rybozymów. Nieth i wsp. przypuszczają, że w tym wypad- [40]. Mechanizm RNAi rozpatruje się jako metodę przy-
ku zmniejsza się prawdopodobieństwo niepowodzenia eks- datną do poszukiwania specyficznych terapeutyków. Wie-
perymentu, choćby poprzez wykluczenie potencjalnych le współczesnych laboratoriów interesuje się wykorzysta-
216
RNAi w modulacji oporności wielolekowej
Magdalena Czajka Uhryn i wsp., RNAi w modulacji oporności wielolekowej
RNAi w modulacji oporności wielolekowej
RNAi w modulacji oporności wielolekowej
RNAi w modulacji oporności wielolekowej
niem RNAi do kontroli przebiegu infekcji wirusowej. Wy- Badania nad metodą RNAi muszą być jednak nadal
kazano już zdolność RNAi do inhibicji infekcji wirusem kontynuowane, zanim będzie można stosować ją u pacjen-
HIV, polio, oraz wirusami zapalenia wątroby typu B i C tów. Jedną z przeszkód, być może najtrudniejszą, będzie
[57 60]. Metoda RNAi daje również szanse na leczenie specyficzne dostarczanie efektywnych molekuł wyciszają-
wielu chorób związanych z zaburzeniami genetycznymi cych do wybranych komórek w organizmie; jednak nowe
i neurodegeneracyjnymi [61]. prace badawcze wciąż przynoszą interesujące rezultaty.
24. Mette M.F., Aufsatz W., van der Winden J., Matzke M.A., Matzke A.J.M.
PI ÅšMI ENNI CTWO
Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-
1. Doyle L.A., Ross D.D. Multidrug resisitance mediated by the breast can- stranded RNA. EMBO J. 2000; 19: 5194 5201.
cer resistance protein BCRP (ABCG2). Oncogene 2003; 22: 7340 7358. 25. Dudley N.R., Labbe J-C., Goldstein B. Using RNA interference to identify
2. Thomas H., Coley H.M. Overcoming multidrug resistance in cancer: an genes required for RNA interference. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002;
update on the clinical strategy of inhibiting P-glycoprotein. Cancer Con- 99: 4191 4196.
trol 2003; 10: 159 165. 26. Elbashir S.M., Harborth J., Lendeckel W., Yalcin A., Weber K., Tuschl T.
3. Arts H.J.G., Van der Zee A.G.J., de Jong S., de Vries E.G.E. Options for Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured
modulation of drug resistance in ovarian cancer. Int. J. Gynecol. Cancer mammalian cells. Nature 2001; 411: 494 498.
2000; 10: 47 52. 27. Waterhouse P.M., Wang M-B., Lough T. Gene silencing as an adaptive
4. Jones P.M., George A.M. Mechanism of ABC transporter: a molecular defence against viruses. Nature 2001; 411: 834 842.
dynamics simulation of a well characterized nucleotide-binding subunit. 28. Allashire R. Molecular biology. RNAi and heterochromation a hushed-up
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99: 12639 12644. affair. Science 2002; 297: 1818 1819.
5. Scotto K.W. Transcriptional regulation of ABC drug transporters. Onco- 29. Hammond S.M., Bernstein E., Beach D., Hannon G.J. An RNA-directed
gene 2003; 22: 496 7511. nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells.
6. Michieli M., Damiani D., Ermacora A. i wsp. P-glycoprotein, lung resi- Nature 2000; 404: 293 296.
stance-related protein and multidrug resistance associated protein in de 30. Montgomery M.K., Xu S., Fire A. RNA as a target of double-stranded
novo acute non-lymphocytic leukaemias: biological and clinical implica- RNA-mediated genetic interference in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl.
tions. Br. J. Haematol. 1999; 104: 328 335. Acad. Sci. USA 1998; 95: 15502 15507.
7. Michieli M., Damiani D., Ermacora A. i wsp. P-glycoprotein (PGP), lung 31. Provost P., Silverstein R.A., Dishart D. i wsp. Dicer is required for chro-
resistance-related protein (LRP) and multidrug resistance-associated pro- mosome segregation and gene silencing in fission yeast cells. Proc. Natl.
tein (MRP) expression in acute promyelocytic leukaemia. Br. J. Haema- Acad. Sci. USA 2002; 99: 16648 16653.
tol. 2000; 108: 703 709. 32. Elbashir S.M., Martinez J., Patkaniowska A., Lendeckel W., Tuschl T.
8. Kast C., Canfield V., Levenson R., Gros P. Transmembrane organization Functional anatomy of siRNAs for mediating efficient RNAi in Drosophila
of mouse P-glycoprotein determined by epitope insertion and immuno- melanogaster embryo lysate. EMBO J. 2001; 20: 6877 6888.
fluorescence. J. Biol. Chem. 1996; 271: 9240 9248. 33. Bernstein E., Caudy A.A., Hammond S.M., Hannon G.J. Role for a biden-
9. Wu H., Hait W.N., Yang J.-M. Small interfering RNA-induced suppression tate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature 2001;
of MDR1 (P-Glycoprotein) restores sensitivity to multidrug-resistant can- 409: 363 366.
cer cells. Cancer Res. 2003; 63: 1515 1519. 34. Nykänen A., Haley B., Zamore P.D. ATP Requirements and small Interfering
10. Fojo T., Bates S. Strategies for reversing drug resistance. Oncogene RNA structure in the RNA interference pathway. Cell 2001; 107: 309 321.
2003; 22: 7512 7523. 35. Hannon G.J. RNA interference. Nature 2002; 418: 244 251.
11. Di Pietro A., Conseil G., Perez-Victoria J.M. i wsp. Modulation by flavo- 36. Yang D., Buchholz F., Huang Z. i wsp. Short RNA duplexes produced by
noids of cell multidrug resistance mediated by P-glycoprotein and related hydrolysis with Escherichia coli RNase III mediate effective RNA inter-
ABC transporters. Cell. Mol. Life Sci. 2002; 59: 307 322. ference in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002; 99:
12. Nieth C., Prebisch A., Stege A., Lage H. Modulation of the classical 9942 9947.
multidrug resistance (MDR) phenotype by RNA interference (RNAi). FEBS 37. Kawasaki H., Suyama E., Iyo M., Taira K. siRNAs generated by recombi-
Lett. 2003; 545: 144 150. nant human Dicer induce specific and significant but target site-indepen-
13. Bahr O., Wick W., Weller M. Modulation od MDR/MRP by wild-type and dent gene silencing in human cells. Nucleic Acid Res. 2003; 31: 981 987.
mutant p53. J. Clin. Invest. 2001; 107: 643 646. 38. Billy E., Brondani V., Zhang H., Mueller U., Filipowicz W. Specific interfe-
14. Sampath J., Sun D., Kidd V.J. i wsp. Mutant p53 Cooperates with ETS rence with gene expression induced by long, double-stranded RNA in
and selectively up-regulates human MDR1 Not MRP1. J. Biol. Chem. mouse embryonal teratocarcinoma cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
2001; 276: 39359 39367. 2001; 98: 14428 14433.
15. Bush J.A., Li G. Regulation of the Mdr1 isoforms in a p53-deficient 39. Svoboda P., Stein P., Hayashi H., Schultz R.M. Selective reduction of
mouse model. Carcinogenesis 2002; 23: 1603 1607. dormant maternal mRNA in mouse oocytes by RNA interference. Deve-
16. Kim S-H., Hur W-Y., Kang C-D., Lim Y-S., Kim D-W., Chung B-S. Invo- lopment 2000; 127: 4147 4156.
lvement of heat shock factor in regulating transcriptional activation of 40. Kittler R., Buchholz F. RNA interference: gene silencing in the fast lane.
MDR1 gene in multidrug-resistant cells. Cancer Lett. 1997; 115: 9 14. Semin. Cancer Biol. 2003; 13: 259 265.
17. Niewiarowski W., Gendaszewska E., Rębowski G. i wsp. Multidrug resi- 41. Byrom M., Pallotta V., Brown D., Ford L. Visualizing siRNA in mammalian
sitance-associated protein-reduction of expression in human leukaemia cells: fluorescence analysis of the RNAi effect. Ambion TechNotes 2002; 9.
cells by antisense phosphorothioateoligonucleotides. Acta Biochim. Pol. Dostępne na stronie: www.ambion.com/techlib/tn/93/935.html.
2000; 47: 1183 1188. 42. Carmell M.A., Xuan Z., Zhang M.Q., Hannon G.J. The Argonaute family:
18. Fire A., Xu S., Mongomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell mainte-
Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in nance, and tumorigenesis. Genes Dev. 2002; 16: 2733 2742.
Caenorhabditis elegans. Nature 1998; 391: 806 811. 43. Kataoka Y., Takeichi M., Uemura T. Developmental roles and molecular
19. Aravin A.A., Naumova N.M., Tulin A.V., Vagin V.V., Rozovsky Y.M., Gvoz- characterization of a Drosophila homologue of Arabidopsis Argonaute1,
dev V.A. Double-stranded RNA- mediated silencing of genomic tandem the founder of a novel gene superfamily. Genes Cells 2001; 6: 313 325.
repeats and transposable elements in the D.melanogaster germline. Curr. 44. Kim V.N. RNA interference in functional genomics and medicine. J.
Biol. 2001; 11: 1017 1027. Korean Med. Sci. 2003; 18: 309 318.
20. Elbashir S.M., Lendeckel W., Tuschl T. RNA intereference is mediated by 45. Grosshans H., Slack F.J. Micro-RNAs: small is plentiful. J. Cell Biol.
21- and 22-nucleotide RNAs. Genes Dev. 2001; 15: 188 200. 2002; 156: 17 21.
21. Cheng J.C., Moore T.B., Sakamoto K.M. RNA interference and human 46. Olsen P.H., Ambros V. The lin-4 Regulatory RNA Controls developmental
disease. Mol. Genet. Metab. 2003; 80: 121 128. timing in Caenorhabditis elegans by blocking LIN-14 protein synthesis
22. Caplen N.J., Parrish S., Imani F., Fire A., Morgan R.A. Specific inhibition after the initiation of translation. Dev. Biol. 1999; 216: 671 680.
of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and 47. Król J., Kaczyńska D., Krzyżosiak W.J. MikroRNA  nowi członkowie
vertebrate systems. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001; 98: 9742 9747. rodziny niekodujÄ…cych RNA. Post. Biochem. 2003; 49: 214 228.
23. Zamore P.D., Tuschl T., Sharp P.A., Bartel D.P. RNAi: double-stranded 48. Kiss T. Small nucleolar RNA-guided post-transcriptional modification of
RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA an 21 to 23 nucleoti- cellular RNAs. EMBO J. 2001; 20: 3617 3622.
de intervals cell 2000; 101: 25 33. 49. Kittler R., Putz G., Pelletier L. i wsp. An endoribonuclease  prepared
217
Ann. Acad. Med. Siles. 2005, 59, 3
siRNA screen in human cells identifies genes essential for cell division. 56. Grishok A., Pasquinelli A.E., Conte D. i wsp. Genes and mechanisms
Nature 2004; 432: 1036 1040. related to RNA interference regulate expression of the small temporal
50. Buchholz F. RNA-interference i mammalian cells. Euro. Biotech. News RNAs that control C. elegans developmental timinig. Cell 2001; 106: 23 34.
2005; 4: 39 42. 57. Randall G., Graukoui A., Rice C.M. Clearance of replicating hepatitis C
51. Brummelkamp T.R., Bernards R., Agami R. Stable suppression of tumorige- virus replicon RNAs in cell culture by small interfering RNAs. Proc. Natl.
nicity by virus-mediated RNA interference. Cancer Cell 2002; 2: 243 247. Acad. Sci. USA 2003; 100: 235 240.
52. Sui G., Soohoo C., Affar E.B. i wsp. A DNA vector-based RNAi technolo- 58. Wilson J.A., Jayasena S., Khvorova A. i wsp. RNA interference blocks
gy to suppress gene expression in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. gene expression and RNA synthesis from hepatitis C replicons propaga-
Sci. USA 2002; 99: 5515 5520. ted in human liver cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003; 100: 235 240.
53. Shen C., Buck A.K., Liu X., Winkler M., Reske S.N. Gene silencing by 59. Gitlin L., Karelsky S., Andino R. Short interfering RNA confers intracellu-
adenovirus-delivered siRNA. FEBS Lett. 2003; 539: 111 114. lar antivirial immunity in human cells. Nature 2002; 418: 430 434.
54. Ashrafi K., Cheng F.Y., Watts J.L. i wsp. Genome-wide RNAi analysis of 60. Novina C.D., Murray M.F., Dykxhoorn D.M. i wsp. siRNA-directed inhibi-
Caenorhabditis elegans fat regulatory genes. Nature 2003; 421: 268 272. tion of HIV-1 infection. Nat. Med. 2002; 8: 681 686.
55. Gönczy P., Echeverri Ch., Oegema K. i wsp. Functional genomic analysis 61. Caplen N.J., Taylor J.P., Statham V.S., Tanaka F., Fire A., Morgan R.A.
of cell division in C.elegans using RNAi of genes on chromosome III. Rescue of polyglutamine-mediated cytotoxicity by double-stranded RNA-
Nature 2000; 408: 331 336. -mediated RNA interference. Hum. Mol. Genet. 2002; 11: 175 184.
218