Otrzymywanie białek rekombinowanych w komórkach CHO
Chomik chiński (Circetulus griseus) pochodzi z terenów pustynnych północnych Chin i Mongolii. Po
raz pierwszy zastosowano chomiki chińskie do badań medycznych w 1919 roku.
Jednym z ważnych powodów było wykrycie, że chomiki chińskie są nosicielami pasożyta Laishmania,
wywołującego u ludzi chorobę zwaną leiszmaniozą (kala-azar, czarna febra, gorączka dum-dum).
W 1948 roku dwóch amerykańskich naukowców przemyciło chomiki chińskie do USA. Badacze ci
zostali uznani przez chińską komisję do spraw badania zbrodni wojennych za amerykańskich
dywersantów i oskarżeni i popełnienie  zbrodni wojennej .
W połowie XX wieku krzyżując wsobnie chomiki otrzymano osobniki cierpiące na rozmaite
schorzenia genetyczne. Wykryto również, że chomik chiński ma znaczniej mniej chromosomów niż
człowiek (2n = 22).
W roku 1957 udało się wyprowadzić stabilne linie komórkowe z jajnika chomików. Linie te stały się
cennym narzędziem do badań genetycznych, a zwłaszcza mechanizmów powstawania aberracji
chromosomowych.
Otrzymane stabilne linie komórkowe m.in. wykorzystano do badań mutagenezy. Jednym ze skutków
tych badań było otrzymanie linii pochodnych, ze zmutowanym (unieczynnionym) genem DHFR.
Gen DHFR koduje reduktazę dihydrofolianu.
DHFR jest niewielkim enzymem, który katalizuje konwersję kwasu foliowego do tetrahydrofolianu
(THF). THF jest konieczny, jako koenzym w rozmaitych procesach biosyntetycznych, a w
szczególności w syntezie glicyn, puryn i tymidyny.
Reduktaza dihydrofolianowa Reduktaza dihydrofolianowa
NADPH + H+ NADP+ NADPH + H+ NADP+
Kwas foliowy DH2-folian TH4-folian
Ponieważ komórki CHO zawierające zmutowany gen DHFR wymagają do wzrostu glicyny,
hipoksantyny i tymidyny można tę właściwość wykorzystać w badaniach selekcyjnych.
Jeśli komórki ze zmutowanym genem DHFR transfekuje się plazmidami zawierającymi prawidłową
formę genu DHFR, wtedy pozytywne transfektanty można wyselekcjonować hodując komórki w
pożywce niezawierającej hipoksantyny i tymidyny.
Ponadto, w komórkach CHO z defektem genu DHFR można łatwo osiągnąć amplifikację
wklonowanego plazmidowego DNA. W tym celu komórki hoduje się w obecności metotreksatu.
Metotreksat jest analogiem kwasu foliowego, inhibitorem blokującym aktywność DHFR.
Dodanie metotreksatu do komórek ze zmutowanym genem DHFR (ale transferowanych plazmidem
zawierającym funkcjonalny gen DHFR) zmusza komórki do poradzenia sobie z obniżoną (przez
hamujący wpływ metotreksatu) ilością produktu genu DHFR.
Komórki przeciwdziałają obniżeniu poziomu DHFR poprzez amplifikację plazmidu kodującego gen
DHFR.
1
1. Kwas foliowy
2. Metotreksat
Właściwości komórek CHO:
ci komórek CHO:
Komórki CHO mają liczne cechy, jakich oczekuje się od komórek, w których zamierza się
cechy, jakich od komórek, w których zamierza si
otrzymywać rekombinowane białka terapeutyczne.
rekombinowane białka terapeutyczne.
1) Są komórkami eukariotycznymi, w których zachodzi proces glikozylacji białek bardzo
komórkami eukariotycznymi, w których zachodzi proces glikozylacji białek bardzo
komórkami eukariotycznymi, w których zachodzi proces glikozylacji białek bardzo
zbliżony do glikozylacji zachodz
ony do glikozylacji zachodzącej w ludzkich komórkach.
2) Spośród licznych wirusów (badano 44, w tym: HIV, wirus grypy, polio, opryszczki, świnki
ród licznych wirusów (badano 44, w tym: HIV, wirus grypy, polio, opryszczki,
ród licznych wirusów (badano 44, w tym: HIV, wirus grypy, polio, opryszczki,
etc.), które są dla człowieka patogenami, żaden ni Ema zdolności replikacji w komórkach
dla człow ci replikacji w komórkach
CHO.
3) Wymagania wzrostowe komórek CHO nie są zbyt złożone. Można adaptować komórki do
Wymagania wzrostowe komórek CHO nie s na adaptowa
wzrostu w pożywkach niezawieraj
ywkach niezawierających surowicy.
4) Można adaptować komórki CHO do wzrostu w zawiesinie (np. linia  Freestyle Max ), oraz do
komórki CHO do wzrostu w zawiesinie (np. linia  Freestyle Max ), oraz do
wzrostu w dużej gęstości.
ści.
5) Transfekowanie komórek plazmidami nie nastręcza znaczących trudności.
Transfekowanie komórek plazmidami nie nastr ści.
6) Manipulowanie genetyczne w odniesieniu do komórek CHO nie nastręcza znacznych
Manipulowanie genetyczne w odniesieniu do komórek CHO nie nastr
Manipulowanie genetyczne w odniesieniu do komórek CHO nie nastr
trudności.
7) Jednym z istotnych ograniczeń jest brak pełnej wiedzy o sekwencji genom chomika
Jednym z istotnych ogranicze k pełnej wiedzy o sekwencji genom chomika
chińskiego.
2
Pierwszym rekombinowanym lekiem białkowym otrzymanym w komórkach CHO był tkankowy
Pierwszym rekombinowanym lekiem białkowym otrzymanym w komórkach CHO był tkankowy
Pierwszym rekombinowanym lekiem białkowym otrzymanym w komórkach CHO był tkankowy
aktywator plazminogenu (r-tPA, Activase), dopuszczony do obrotu w 1987 roku.
tPA, Activase), dopuszczony do obrotu w 1987 roku.
Problemy związane ze stabiln eukariotycznych komórek plazmidami
zane ze stabilną transfekcją eukariotycznych komórek plazmidami
ekspresyjnymi. Efekt pozycji.
ekspresyjnymi. Efekt pozycji.
Udana integracja transgenu z genomem gospodarza zale
Udana integracja transgenu z genomem gospodarza zależy gł. od
struktury chromatyny w okolicy miejsca integracji.
struktury chromatyny w okolicy miejsca integracji.
Większość chromatyny eukariontów ma strukturę
chromatyny eukariontów ma struktur
heterochromatyny, transkrypcyjnie nieaktywnej.
ypcyjnie nieaktywnej.
Jeśli stosuje się konwencjonalne wektory ekspresyjne i standardową metodą transfekcji większość
konwencjonalne wektory ekspresyjne i standardow ą transfekcji wi
integracji zachodzi w regionach nieaktywnych transkrypcyjnie. Sytuacja ta powoduje, że wydajność
integracji zachodzi w regionach nieaktywnych transkrypcyjnie. Sytuacja ta powoduje,
integracji zachodzi w regionach nieaktywnych transkrypcyjnie. Sytuacja ta powoduje,
ekspresji trans genów, a co za Tm idzie wydajność syntezy rekombinacyjnego białka jest niska.
ekspresji trans genów, a co za Tm idzie syntezy rekombinacyjnego białka jest niska.
Ponadto w miarę wzrostu komórek i ich kolejnych podziałów, może dochodzić do całkowitej
wzrostu komórek i ich kolejnych podziałów, mo e dochodzi
inaktywacji transgenu, lub szybszego wzrostu komórek nieprodukuj cych transgenu ni
inaktywacji transgenu, lub szybszego wzrostu komórek nieprodukujących transgenu niż komórek
aktywnych transgenicznie. Ostatecznym skutkiem tych efektów jest niska wydajność otrzymanego
nie. Ostatecznym skutkiem tych efektów jest niska wydajno
nie. Ostatecznym skutkiem tych efektów jest niska wydajno
produktu.
Zapobieganie inaktywacji transkrypcji transgenu. Sekwencje insulatorowe
Zapobieganie inaktywacji transkrypcji transgenu. Sekwencje insulatorowe
Zapobieganie inaktywacji transkrypcji transgenu. Sekwencje insulatorowe
(izolujące).
Na transgen włączony w genom gospodarza mogą
czony w genom gospodarza mog
oddziaływać zarówno pozytywnie jak i negatywnie elementy
zarówno pozytywnie jak i negatywnie elementy
regulatorowe znajdujące się czasem w znacznych
czasem w znacznych
odległościach od miejsca integracji transgenu.
ciach od miejsca integracji transgenu.
W chromatynie eukariontów wykryto struktury chromatynowe
W chromatynie eukariontów wykryto struktury chromatynowe
chroniące niektóre geny przez przypadkową aktywacją lub
ce niektóre geny przez przypadkow
inaktywacją lub inaktywacją wywołaną przez odległe
wywołan
elementy regulatorowe. Te struktury (sekwencje DNA) nazywane są sekwencjami izolującymi lub
Te struktury (sekwencje DNA) nazywane s sekwencjami izoluj
insulatorami. Najlepiej poznaną sekwencją izolującą jest sekwencja izolująca otaczająca geny hsp
. Najlepiej poznaną ąca otaczaj
Drosophila melanogaster. `
Jedną ze strategii ochrony transgenu przez negatywnymi skutkami chromatyny otaczającej miejsce
ze strategii ochrony transgenu przez negatywnymi skutkami chromatyny otaczaj
integracji jest włączenie w plazmid sekwencji insulatorowych/izoluj
czenie w plazmid sekwencji insulatorowych/izolujących.
Zastosowanie insulatorów:
torów:
Otoczenie transgenu sekwencjami izoluj e ekspresja transgenu w rozmaitych
Otoczenie transgenu sekwencjami izolującymi powoduje, że ekspresja transgenu w rozmaitych
klonach komórek zawierających stabilnie wbudowany transgen zachodzi z podobn
cych stabilnie wbudowany transgen zachodzi z podobną
cych stabilnie wbudowany transgen zachodzi z podobną wydajnością.
Jeśli w wektorze ekspresyjnym nie umieszcza się sekwencji insulatorowych przed i po genie
li w wektorze ekspresyjnym nie umieszcza si owych przed i po genie
kodującym zrekombinowane białko, to większość komórek, które włączyły transgen syntetyzuje
cym zrekombinowane białko, to wi czyły transgen syntetyzuje
badane białko z różną wydajnością
ścią.
3
Schematyczny model funkcjonowania regionów przyczepu do macierzy jądrowej
Schematyczny model funkcjonowania regionów przyczepu do macierzy j
Schematyczny model funkcjonowania regionów przyczepu do macierzy j
(MAR).
Aktywacji transkrypcji towarzyszy zakotwiczenie si matrix atachements regions)
owarzyszy zakotwiczenie się sekwencji MAR (matrix atachements regions
w macierzy jądrowej.
W efekcie powstają pętle chromatyny, które są chronione od stymulującego lub hamującego
tle chromatyny, które s ącego lub hamuj
transkrypcję wpływu otaczającej chromatyny (innej p
ącej chromatyny (innej pętli).
Maszyneria transkrypcyjna formuje si ądrowej. Oddziaływanie
Maszyneria transkrypcyjna formuje się w miejscu przyczepu do macierzy jądrowej. Oddziaływanie
MAR z macierzą zbliża do siebie elementy
siebie elementy układu transkrypcyjnego.
Otoczenie genu kodującego terapeutyczne białko sekwencjami MAR zwiększa szansę integracji
cego terapeutyczne białko sekwe ększa szans
transgenu w okolicę przyczepu chromatyny do macierzy jądrowej i utworzenia kompleksu
przyczepu chromatyny do macierzy j drowej i utworzenia kompleksu
transkrypcyjnego.
Zastosowanie sekwencji UCOE:
Zastosowanie sekwencji UCOE:
Najnowszą strategią minimalizowania efektu pozycji jest otaczanie trans genów sekwencjami UOCE
minimalizowania efektu pozycji jest otaczanie trans genów sekwencjami UOCE
minimalizowania efektu pozycji jest otaczanie trans genów sekwencjami UOCE
(Ubiquitous Chromatin Opening Element).
(Ubiquitous Chromatin Opening
Pomysł powstał w wyniku analizy struktury regionów chromatyny, w których znajduj
Pomysł powstał w wyniku analizy struktury regionów chromatyny, w których znajdują się geny stale
Pomysł powstał w wyniku analizy struktury regionów chromatyny, w których znajduj
transkrybowane, kodujące białka stale wykorzystywane do zabezpieczania podstawowych funkcji
ce białka stale wykorzystywane do zabezpieczania podstawowych funkcji
ce białka stale wykorzystywane do zabezpieczania podstawowych funkcji
komórki.
Geny te znane są pod angielską nazwą  house-keeping genes . Okazało się, że w regionach gdzie
pod angielską ę, że w regionach gdzie
znajdują się także sekwencje DNA, które nadaj ści , a więc umożliwiają
e sekwencje DNA, które nadają chromatynie cechę  otwartości , a wi
zachodzenie w tym obszarze chromatyny ci
zachodzenie w tym obszarze chromatyny ciągłej aktywnej transkrypcji.
Włączenie do wektora ekspresyjnego sekwencji UOCE powoduje, że transgen jest aktywny nawet
czenie do wektora ekspresyjnego sekwe e transgen jest aktywny nawet
wtedy, jeśli zostanie włączony w region znajdujący się w obszarze heterochromatyny, w tym tak
czony w region znajduj w obszarze heterochromatyny, w tym także w
regionie centromerowym.
4
Korzyści technologii UCOE:
znacznie większa częstość powstawania klonów ekspresyjnych niż w przypadku transfekcji
komórek wektorami niezawierającymi UCOE;
wysoka wydajność otrzymywania produktu bez konieczności stosowania etapu amplifikacja
matrycy;
skrócenie czasu i objętości hodowli;
stabilność ekspresji transgenu aż do ponad 100 generacji komórek;
sekwencje UCOE nie są zbyt długie, co pozwala na konstruowanie plazmidów mogących kodować
równocześnie dwa białka (np. przeciwciała);
znacząco poprawia się standard wielkoskalowej (przemysłowej) produkcji białek
rekombinowanych oraz bardzo znacząco obniża się koszty produkcji.
Poprawa warunków wzrostu komórek CHO:
W celu poprawy wydajności oraz minimalizowania kosztów otrzymywania żądanego białka mogą być
stosowane następujące zabiegi:
1) Modyfikowanie składu pożywki.
2) Genetyczne modyfikowanie komórek poprzez wprowadzenie genów kodujących białka
antyapoptyczne, np.:
a. gen EIB19K adenowirusa kodujący białko o właściwościach podobnych do białka BcL2
b. gen kodujący białko Aven hamujące aktywację kaspaz.
Oba białka powodują przedłużenie czasu życia komórek o 1-2 dni, natomiast ich wspólna
ekspresja wydłuża czas życia komórek o 3 dni. Efektem działania obu białek
antyapoptycznych jest zwiększenie wydajności produkcji o ok. 40-50%.
3) Zwiększanie poziomu białek czaperonowych.
Kontrola proliferacji komórek CHO:
Jednym z zabiegów zmierzających do zwiększenia wydajności otrzymywania białek rekombinowanych w
komórkach smacznych (w tym gł. CHO) jest jak najdłuższe zarzymanie komórek w cyklu komórkowym w
fazie G1, która jest fazą produkcyjną.
Dokonuje się tego gł. poprzez np.:
1. Wtransfekowanie genu kodującego inhibitor cyklu komórkowego p21CIP, pod kontrolą
indukowanego promotora. Po wyhodowaniu dostatecznej ilości komórek aktywuje się gen białko
p21, co powoduje zwolnienie podziałów komórkowych poprzez zatrzymanie komórek w fazie G1,
natomiast procesy syntezy biegną dalej. Ten zabieg może zwiększyć wydajność syntezy
produkowanego białko kilkukrotnie.
2. Stosowanie niskocząsteczkowych stymulatorów wzrostu Najczęściej stosowany jest maślan sodu
będący inhibitorem deacylazi histonów. Dodatek do pożywki maślanu sodu przedłuża czas w
jakim chromatyna znajduje się w stanie  otwartym . Przy zastosowaniu maślany sodu należy mieć
na uwadze, że związek ten także może (w zależności od komórek, składu pożywki i innych
okoliczności) przyspieszyć apoptozę.
3. Obniżanie temperatury hodowli komórek. Na ogół obniża się temperaturę z 37 do 30-32�C.
5