Badanie funkcji białek
Oddziaływania DNA-białko i
białko-białko
Metoda  zmiany ruchliwości elektroforetycznej
(EMSA)
Do tej metody można też zastosować przeciwciała, które identyfikują białko obecne w
kompleksie z DNA i powodują dalszą zmianę ruchliwości elektroforetycznej
kompleksu (supershift)
przeciwciało
super
shift
Sekwencjonowanie DNA
(metoda dideoxy-)
Znakowany
radioaktywnie
starter
Nukleotydy prawidłowe
w nadmiarze
Dideoxy nukleotydy
Polimeraza DNA
Poszukiwanie sekwecji nukleotydowych wiążących się z białkiem
Metoda  footprint
1. Znakowanie końca
2. Reakcja z białkiem
3. Trawienie DNA
kontrolnego
4. Trawienie DNA
skompleksowanego
5. Reakcja sekwencjonowania
DNA kontrolnego
6. Elektroforeza
 DNA footprint
.
Metoda służy określaniu
sekwencji nukleotydowej
fragmentów reagujących z
białkami
Do cięcia używa się nukleaz
(DNazy I)
lub metod chemicznych
(z rodnikiem hydroksylowym)
Badanie regulacji ekspresji genów
" Badanie mechanizmów regulacji ekspresji
genów polega na poszukiwaniu sekwencji
regulatorowych i detekcji czynników, które z nimi
oddziałują
" Geny reporterowe  to geny, których ekspresję
można łatwo wykryć, wprowadzane metodami
inżynierii genetycznej do komórek lub
organizmów
Przykłady genów reporterowych
Gen reporterowy Właściwości Niedogodności
systemu
CAT (bakterie) Nie występuje u Wąski zakres liniowości
eukartiontów, tani odpowiedzi
�-galaktozydaza Stabilny, odczyt Aktywność endogenna
kolorymetryczny
(bakterie)
Lucyferaza (świetlik) Nie występuje w Wymaga substratu
komórkach ssaków, (lucyferyny)
wysoka specyficzność
Alkaliczna fosfataza Białko wydzielane przez Aktywność endogenna w
(człowiek) łożysko, tania reakcja niektórych komórkach
kolorymetryczna
GFP Autofluoryzujące białko, Niska czułość
nie występuje u ssaków
(meduza)
Test acetylo transferazy
chloramfenikolu
CAT Assay - Chloramphenicol Acetyl
Transferase
" Gen acetylotransferazy chloramfenikolu (CAT) jest genem bakteryjnym.
" Funkcją białka kodowanego przez ten gen jest neutralizacja antybiotyku 
chloramfenikolu przez jego acetylację.
" Gen acetylotransferazy chloramfenikolu jest powszechnie używanym w badaniach
sekwencji promotorowych i regulujących transkrypcję genem reporterowym.
" Konstrukt zawierający badaną sekwencję promotorową umieszcza się przed genem
CAT i wprowadza do komórek
" Aktywacja promotora w komórkach może być obserwowana jako pojawienie się
mRNA dla acetylotransferazy lub/i pojawienie się produktu  enzymu katalizującego
reakcję
Rozdział acetylowanych form chloramfenikolu metodą
chormatografii cienkowarstwowej
 Zielone białko
(Green florescent protein  GFP)
Białko wyizolowane z fluoryzującej meduzy
Aequorea victoria zostało sklonowane w
1992. Jest jednym z najczęściej stosowanych
białek reporterowych. Jest stabilne w różnych
warunkach (zmiany pH, temperatura), nie
wymaga substratów dla wydzielania światła
 Zielone białko
(Green florescent protein  GFP)
Utworzony przez
cyklizację reszt seryny
65, tyrozyny 66 i
glicyny 67 chromofor
jest  schowany
wewnątrz cząsteczki
białka dzięki czemu
fluorescencja jest
odporna na zmiany
warunków zewnątrz
Chemiczna struktura fluoroforu GFP
Fluorofor powstaje z
trójpeptydu -Ser 65 -
Tyr 66  Gly 67 
Tworzenie fluoroforu
następuje na drodze
autokatalitycznej
Lokalizacja białek przy użyciu hybryd z GFP
Fuzja badanego białka z GFP pozwala na określenie
lokalizacji białka.
Badania ekspresji u zwierząt
GFP-tagged plakoglobin
transgenicznych
Oddziaływania białko-białko
Białka bardzo często działają w formie dużych kompleksów (homo i
hetero dimerów, trimerów, tetramerów i ogólnie polimerów).
Oznaczanie powinowactwa poszczególnych białek względem siebie
i tworzenia kompleksów jest ważnym elementem w
rozszyfrowywaniu mechanizmów molekularnych procesow
biologicznych.
Metody molekularne stosowane w tej dziedzinie:
" Immuno-koprecypitacja
" Detekcja przy użyciu białek fuzyjnych z GST
" Systemy dwu i wielohybrydowe
Immunoprecypitacja białek
kompleksujących z białkiem X
Wykorzystanie
białek hybrydowych
(fuzyjnych) do
badania
oddziaływań białko-
białko
Badanie oddziaływań białko-białko
Użycie hybrydy GST-X
(GST-transferaza glutationu,
X-badane białko)
do wykrywania i
oczyszczania białek
reagujących z X
Systemy dwuhybrydowe
Narzędzie do identyfikacji cDNA z biblioteki ekspresyjnej, które
kodują białka reagujące z określonym badanym białkiem
sklonowanym w innym plazmidzie.
Drożdżowy system dwuhybrydowy wykorzystuje zbudowany z
dwóch domen aktywatora transkrypcji Gal4p (domeny Gal4-AD
i Gal4-BD).
Klonowanie
" Trawienie wektora enzymem restrykcyjnym
" Trawienie interesującego nas fragmentu DNA tym samym
enzymem
" A
ączenie  fragmentu z wektorem (ligacja)
" Wprowadzenie plazmidu do bakterii (transformacja)
" Wysiewanie bakterii na płytkę z odpowiednim antybiotykiem
" Minipreparatyka DNA z pojedynczych kolonii
" Trawienie enzymem restrykcyjnym (wycinanie  wstawki )
" Elektroforeza
" Namnażanie bakterii z kolonii zawierających wstawkę
" Bankowanie
Niebieskie kolonie zawierają bakterie oporne na ampicylinę, w
których ekspresji ulega także gen LacZ
Kolonie białe zawierają bakterie oporne na ampicylinę, w których
Lac Z jest nie ulega ekspresji
Biblioteka genomowa Biblioteka cDNA
System dwuhybrydowy
korzysta z właściwości
czynników transkrypcyjnych
System dwuhybrydowy
Pytanie: Które białka oddziałują z badanym przez nas
białkiem X?
1. Gen dla białka X jest klonowany za fragmentem kodującym
domenę wiązania do DNA czynnika transkrypcyjnego, tworząc
gen dla białka hybrydowego
2. Zbiór przypadkowych sekwencji cDNA jest klonowany za
fragmentem kodującym domenę aktywującą czynnika
transkrypcyjnego. W wyniku otrzymujemy bibliotekę różnych
kodujących białko sekwencji tworzących geny fuzyjne z tą
samą domeną aktywującą
3. Klon zawierający hybrydowe białko X-domena wiążąca DNA
jest wprowadzany do komórek zawierających hybrydowe geny
cDNA-domena aktywująca. Jeśli białko X oddziałuje z którymś
z białek hybrydowych następuje transkrypcja z genu
reporterowego aktywowanego czynnikiem transkrypcyjnym
podzielonym przez nas na domeny
Drożdżowy system dwuhybrydowy
Drożdżowy system dwuhybrydowy
Selekcja kolonii w których gen reporterowy ulega ekspresji
Oddziaływania białko-białko: drożdżowy system
dwuhybrydowy