Ćwiczenie 3
ANALIZA I OCZYSZCZANIE BIAA
EK
Część doświadczalna obejmuje:
- rozdział białek zawartych w surowicy krwi metodą elektroforezy w \
elu agarozowym
- rozdział hemoglobiny od chromianu potasu metodą sączenia \
elowego na kolumnie
Sephadex G-15 (odsalanie hemoglobiny)
WPROWADZENIE
Poznanie funkcji określonego białka wymaga jego wyizolowania i oczyszczenia (oddzielenia)
od tysięcy innych białek obecnych w badanych ekstraktach komórkowych lub tkankowych. Białko
mo\
na oddzielić od innych cząsteczek, w tym równie\
od innych białek, wykorzystując ró\
nice w:
rozpuszczalności, wielkości cząsteczek, w wielkości ładunku, a tak\
e ró\
nic w powinowactwie
do specyficznych grup chemicznych. Ró\
nice między poszczególnymi białkami w ich rozpusz-
czalności wykorzystywane są w metodzie frakcjonowania białek poprzez wysalanie lub wytrąca-
nie na skutek obni\
ania stałej dielektrycznej roztworu. Białka zawierające małe cząsteczki (np.
siarczan amonu u\
ywany do wysalania) mo\
na oddzielić metodą dializy przez błonę półprzepusz-
czalną (np. błona celulozowa) bądz
metodą filtracji \
elowej. Chromatografia metodą filtracji \
elo-
wej umo\
liwia rozdział cząsteczek ró\
niących się wielkością. Powszechnie stosowanymi \
elami są
preparaty handlowe takie jak: Sephadex, Sepharose czy Biogel. Sephadex produkuje się z natural-
nego dekstranu wytwarzanego przez Leuconostoc mesenteroides (paciorkowce heterofermentatyw-
ne; fakultatywne anaeroby). Ten wielkocząsteczkowy glikan zawiera 90-95% wiązań ą-1-6 gliko-
zydowych, a pozostałe wiązania są typu 1-3 (Ryc. 1). Ró\
ne rodzaje Sephadex uzyskuje się z dek-
stranu o ró\
nej masie cząsteczkowej, który dodatkowo sieciuje się w reakcji z epichlorohydryną.
Liczba wytworzonych mostków określa rozmiary oczek w utworzonej w ten sposób sieci. Im więcej
poprzecznych mostków znajduje się w sieci, tym mniejsze są jej oczka. W ten sposób produkuje się
serię \
eli Sephadex o ró\
nych liczbach G ró\
niących się rozmiarami oczek, umo\
liwiających
frakcjonowanie i rozdział analizowanych związków w szerokim zakresie mas cząsteczkowych
(Tabela I) . śelem o najmniejszych oczkach jest Sephadex G-10, natomiast o największych G-200.
Do oddzielenia związków o małej masie cząsteczkowej od wielkocząsteczkowych białek najlepiej
nadają się kolumny Sephadex G-10 lub G-15, natomiast do rozdziału białek ró\
niących się wielko-
1
ścią  kolumny Sephadex G-50 do G-200 (Ryc. 2). Na ryc. 2 pokazano zasadę rozdziału substancji
ró\
niących się wielkością cząsteczek na kolumnie Sephadex.
Ryc. 1. Fragment struktury \
elu Sephadex (widoczne są wiązania ą-1-6 glikozydowe oraz mostki
powstałe w reakcji z epichlorohydryną) (Kłyszejko- Stefanowicz 2005)
Tabela I. Charakterystyka \
eli Sephadex G (Kłyszejko-Stefanowicz 2005)
2
Ryc. 2. Rozdział cząsteczek o ró\
nej wielkości na kolumnie Sephadex (Koolman, R�hm 2005)
Chromatografia jonowymienna wykorzystuje ró\
nice w ładunkach wypadkowych poszczegól-
nych białek. Białka, które w określonym pH będą naładowane ujemnie mo\
na rozdzielać na anioni-
tach np. na dietyloaminoetylocelulozie (DEAE-celuloza), białka naładowane dodatnio mo\
na roz-
dzielać na kationitach np. karboksymetylocelulozie (CM-celuloza). W chromatografii powinowac-
3
twa wykorzystuje się powinowactwo wielu białek do specyficznych grup chemicznych. W ten spo-
sób mo\
na związać określone białko enzymatyczne do nośnika chromatograficznego, do którego
wcześniej został sprzęgnięty substrat, analog substratu bądz
specyficzny inhibitor tego enzymu.
Białka regulujące ekspresję genów mo\
na związać do odpowiedniej sekwencji nukleotydowej DNA
unieruchomionej na nośniku chromatograficznym itd. Wysokociśnieniowa chromatografia cie-
czowa (HPLC) wykorzystuje materiały wypełniające kolumnę o znacznie większym rozdrobnie-
niu ni\
w klasycznych chromatografiach cieczowych i dlatego aby uzyskać odpowiednią szybkość
przepływu konieczne jest zastosowanie zwiększonego ciśnienia.
Powszechną metodą rozdziału białek jest elektroforeza w ró\
nych nośnikach. Cząsteczka ob-
darzona ładunkiem wypadkowym porusza się w polu elektrycznym, a szybkość jej wędrówki (v)
zale\
y od natę\
enia pola elektrycznego (E), od wypadkowego ładunku cząsteczki białka (z) i
współczynnika tarcia (f).
v = Ez/f
Współczynnik tarcia zale\
y od wielkości i kształtu cząsteczki migrującej oraz od lepkości śro-
dowiska.
Rozdział elektroforetyczny prowadzi się prawie zawsze w \
elu lub na bibule. Dawniej jako no-
śników, oprócz bibuły chromatograficznej, u\
ywano tak\
e \
elowanej skrobi oraz folii z octanu ce-
lulozy; obecnie poza octanem celulozy powszechnie u\
ywa się \
eli agarozowych i poliakryloami-
dowych, umo\
liwiających najwy\
szą rozdzielczość.
Agaroza jako antykonwekcyjny nośnik do elektroforezy została zaproponowana przez Hjertena w 1961 r. Od
tego czasu jest niezastąpionym nośnikiem, zwłaszcza do ró\
nego typu immunoelektroforez, a tak\
e do roz-
działu i analiz kwasów nukleinowych. Rozdziały elektroforetyczne tych biopolimerów w agarozie mo\
na wy-
konywać zarówno na skalę analityczną jak i preparatywną.
Agaroza jest polisacharydem (główny składnik agaru) zbudowanym z powtarzających się reszt �-D-
�
�
�
galaktopiranozy i 3,6-anhydro-ą
ą-L-galaktopiranozy połączonych wiązaniami 1-3 oraz 1-4. Ryc. 3 przed-
ą
ą
stawia powtarzającą się podjednostkę agarozy
O
HO
CH2OH O
O
O O
HO
HO O
Ryc. 3. Budowa agarozy (powtarzający się fragment)
Obie reszty galaktozowe w agarozie mogą być w ró\
nym stopniu podstawione grupami siarczanowymi, me-
toksylowymi, karboksylowymi i pirogronianowymi. Agaroza u\
ywana do elektroforezy powinna charaktery-
zować się jak najni\
szą zawartością zjonizowanych grup (siarczanowych, karboksylowych), które otoczone
są dodatnio naładowanymi przeciwjonami. W polu elektrycznym ruchliwe przeciwjony, wraz z towarzyszącą
im otoczką, migrują w kierunku katody. Taki przepływ solwentu (nazywany elektroendoosmozą), zale\
ny jest
od liczby zjonizowanych grup w agarozie i zachodzi w kierunku przeciwnym ni\
wędrówka rozdzielanych
4
białek, wpływając niekorzystnie na jakość ich rozdziału. Wielkość elektroendosmozy jest wyznaczana na
podstawie wędrówki substancji nie posiadającej ładunku elektrycznego np. dekstranu i jest wyra\
ana jako
względna ruchliwość elektroforetyczna (Mr) dekstranu w odniesieniu do ruchliwości elektroforetycznej al-
buminy. Poniewa\
dekstran wędruje w kierunku przeciwnym do albuminy, wartość Mr ma znak ujemny. W
sprzeda\
y występują trzy podstawowe typy agarozy: o niskiej (Mr <0.02), średniej (Mr < 0.13) i wysokiej
(Mr > 0.25) elekroendosmozie. Do elektroforezy białek u\
ywa się dwóch pierwszych typów agarozy. W stę-
\
eniach > 0.1% i w temperaturze ni\
szej od 400 C agaroza zestala się, tworząc \
el. Po ogrzaniu do tempera-
tury >900C,  topi się przechodząc w postać zolu. Podczas ochładzania poszczególne łańcuchy polisacha-
rydowe tworzą podwójne helisy, które następnie łączą się w pęczki i tworzą stabilny \
el o oczkach, których
wielkość uzale\
niona jest od stę\
enia agarozy. Elektroforezę białek i kwasów nukleinowych wykonuje się
najczęściej w 1  2% \
elach agarozowych.
Warunki elektroforezy (pH i siłę jonową) dobiera się najczęściej tak, aby sumaryczny ładunek
elektryczny poszczególnych białek obecnych w próbie poddanej elektroforezie był ujemny i tak
\
eby ró\
niły się one tylko wielkościami ładunku netto. W praktyce najczęściej stosuje się bufory
zasadowe, których pH jest wy\
sze od wartości pI najbardziej zasadowych białek. W tych wa-
runkach wszystkie rozdzielane białka poruszają się w jednym kierunku (do anody) lecz z ró\
ną
szybkością, zale\
ną od stopnia jonizacji. Nale\
y dodać, \
e na jakość rozdziału wpływ ma równie\

rodzaj u\
ytego buforu.
Po zakończeniu elektroforezy białka na elektroforegramie denaturuje się (utrwala) w mieszani-
nie kwasu octowego i metanolu (lub etanolu), wskutek czego białka stają się nierozpuszczalne.
Unieruchomione białka mo\
na teraz wybarwiać. Do wybarwiania u\
ywa się ró\
nych barwników
oddziałujących jonowo z białkami (są to najczęściej barwniki sulfonowe, pochodne lub analogiczne
do stosowanych w przemyśle tekstylnym do barwienia wełny). Nadmiar niezwiązanego barwnika
odmywa się, a wybarwione elektroforegramy poddaje się analizie jakościowej lub ilościowej. Po-
niewa\
ilość związanego barwnika jest proporcjonalna do zawartości białka w danym prą\
ku, dla-
tego mierząc densytometrycznie intensywność zabarwienia poszczególnych pasm mo\
na ozna-
czyć względne stę\
enie białek w rozdzielonych frakcjach (Tabela IIB). Metoda ta znajduje zasto-
sowanie do analizy klinicznej białek surowicy krwi. Wzajemne proporcje białek surowicy krwi
utrzymują się w określonych granicach, a zmiany tych proporcji są charakterystyczne dla ró\
nych
stanów patologicznych.
WYKONANIE
Elektroforetyczny rozdział białek zawartych w surowicy krwi z u\
yciem aparatu
i zestawu odczynników firmy Cormay (Gel protein 100)
1, Zestaw odczynników do elektroforezy firmy Cormay (Gel protein 100)
A, Płytki z agarozą (folie)
5
B, Bufor Tris-barbital (bufor weronalowy)  koncentrat. Do elektroforezy rozcieńczyć wodą de-
stylowaną zawartość ampułki 76 ml do 100 ml. Trwałość roztworu roboczego  około dwa tygo-
dnie w temp. pokojowej.
C, Koncentrat barwnika (Czerń amidowa 10 B). Przygotować roztwór roboczy przez rozcieńcze-
nie wodą destylowaną 1 ampułki 100 ml koncentratu do 300 ml. Trwałość roztworu roboczego-
powy\
ej miesiąca w temp. pokojowej.
D, Roztwór odbarwiający- koncentrat. 10 ml koncentratu rozcieńczyć woda destylowaną do 1000
ml. Trwałość  1 miesiąc w temp. pokojowej.
E, Utrwalacz (135 ml 96% etanolu, 30 ml stę\
. kwasu octowego i 135 ml wody destylowanej.
Roztwór trwały około 3 miesiące w szczelnie zamkniętym naczyniu w temp. pokojowej.
2, Surowica krwi do analizy, rozcieńczona 7-krotnie, bezpośrednio przed u\
yciem, roboczym bufo-
rem
3, Zasilacz prądu stałego (do 150 V) i komora do elektroforezy Cormay S20.
Folia poliestrowa Miejsce naniesienia
z \
elem agarowym i kierunek wędrówki
(po stronie wewnętrznej) rozdzielanych białek Pokrywa komory
anoda katoda
Zbiorniki z buforem
Ryc. 4. Schemat aparatu do elektroforezy firmy Cormay
Postępowanie:
1. Przygotowanie aparatury i prób do rozdziału
a, Ustawić poziomo komorę do elektroforezy i wlać po 150 ml buforu (B) do ka\
dego z naczyń
elektrodowych
b, Delikatnie wyjąć płytkę z agarozą z opakowania (nie dotykać powierzchni \
elu!) i poło\
yć na
bibule \
elem do góry. Wykonać tę czynność bezpośrednio przed naniesieniem próbek, tak by
uniknąć wysuszenia \
elu agarozowego
c, Osuszyć miejsce naniesienia próbek przez przyło\
enie paska bibuły. Po kilku sekundach usu-
nąć wilgotną bibułę
6
d, W osuszonym miejscu umieścić folię ze szczelinami (studzienkami) do nanoszenia próbek.
Dwie skrajne szczeliny powinny pokrywać się ze znakami orientacyjnymi na folii. Delikatnie
docisnąć folię do powierzchni \
elu
e, Nanieść po 5 �l rozcieńczonej surowicy do ka\
dej studzienki i pozostawić na kilka minut w
�
�
�
celu przedyfundowania białek do \
elu
e, Usunąć nadmiar surowicy przez przyło\
enie paska bibuły. Zdjąć ostro\
nie bibułę i folię
g, Zgiąć delikatnie płytkę z agarozą i umieścić ją w komorze tak, aby końce były zanurzone w na-
czyniach elektrodowych, \
el był skierowany do dołu, a miejsca naniesienia znajdowały się
od strony katody (-)
2, Rozdział elektroforetyczny
a, Zamknąć komorę pokrywą i połączyć przewodami z zasilaczem
b, Włączyć zasilacz i prowadzić elektroforezę 20  30 minut przy napięciu 100 V
c, Po zakończeniu elektroforezy wyłączyć zasilacz, wyjąć płytkę i zanurzyć ją na 15 minut w
utrwalaczu w pozycji pionowej
d, Bardzo dokładnie wysuszyć płytkę suszarką fryzjerską lub w suszarce laboratoryjnej w 800 C
3, Wybarwianie elektroforegramów
a, Zanurzyć płytkę w barwniku na 10 minut, a następnie odbarwić w 2  3 kolejnych kąpielach w
odbarwiaczu (odczynnik firmy Cormay a).
b, Odbarwioną płytkę wypłukać w wodzie destylowanej i wysuszyć.
Opracowanie wyników:
Dokonać oceny wizualnej rozdzielonych frakcji, przygotować dokumentację rozdziału (rysu-
nek lub kserokopię płytki, opisać rozdzielone frakcje białkowe). Przy opracowywaniu wyników
nale\
y zwrócić uwagę, \
e ka\
da z wybarwionych frakcji zawiera po kilka białek, które nie ró\
nią
się ruchliwością elektroforetyczną (patrz Tabela IIA). Wyniki te świadczą więc o tym, \
e białka
zawarte w poszczególnych frakcjach (albuminy, ą1-, ą2-, �- i ł-globuliny) mają podobne wartości
pI (Tabela II)
7
Tabela II. Białka osocza krwi (Koolman, R�hm 2005)
8
Usuwanie chromianu potasowego z roztworu hemoglobiny (odsalanie) metodą
sączenia \
elowego na kolumnie Sephadex G-15
W laboratoriach biochemicznych często zachodzi potrzeba oddzielenia od białek cząsteczek o
małej masie (soli) np. usuwanie siarczanu amonu po wysalaniu białek. Odsolić białka lub zmienić
ich środowisko mo\
na na drodze dializy. Wielkość porów w stosowanej do tego celu błonie pół-
przepuszczalnej umo\
liwia przenikanie cząsteczek o małej masie, podczas gdy cząsteczki białka o
znacznie większej masie nie przenikają przez błonę (Rys. 5). Jednak dializa jest czasochłonna i
wymaga wielokrotnej wymiany roztworu dializacyjnego, dlatego obecnie mo\
na ją z powodzeniem
zastąpić sączeniem \
elowym na kolumnie Sephadex G-10 lub G-15
Ryc. 5. Schemat dializy (Koolman, R�hm 2005)
WYKONANIE
Odczynniki i sprzęt:
- kolumna Sephadex G-15 w 0,9% roztworze NaCl
- 1% roztwór chromianu (VI) potasu (m.cz. 194 Da); roztwór hemoglobiny (m.cz. 67 000 Da) w
0,9% roztworze NaCl
- butla z tubusem
- probówki z zaznaczoną objętością 2 ml- 20 szt
- spektrofotometr
Postępowanie:
A, Przy zamkniętym wypływie kolumny nało\
yć na jej górną, odsłoniętą powierzchnię 1 ml roz-
tworu uzyskanego po zmieszaniu 0,5 ml 1% chromianu (VI) potasu z 0,5 ml roztworu hemo-
globiny. Po naniesieniu próby otworzyć wylot kolumny i poczekać a\
cała naniesiona próba wnik-
nie do nośnika (Uwaga ! nie dopuścić do wniknięcia powietrz do nośnika (zapowietrzenia) ko-
lumny). Zamknąć wylot kolumny i ostro\
nie nanieść około 3 ml roztworu do elucji, a następnie
9
podłączyć butlę z roztworem elucyjnym. Otworzyć wylot kolumny i zbierać do probówek frakcje o
objętości 2 ml (zebrać około 15 frakcji). Doświadczenie zakończyć po wypłynięciu z kolumny
chromianu (VI) potasu. Następnie kolumnę dokładnie przemyć roztworem 0,9% NaCl (dwiema
objętościami kolumny). Zmierzyć absorbancję poszczególnych frakcji przy długości fali  = 410
nm (chromian (VI) potasu), a następnie przy 540 nm (hemoglobina) względem roztworu elucyjnego
W opracowaniu nale\
y zestawić uzyskane wyniki w tabeli oraz przedstawić graficznie wyniki roz-
działu.
Zagadnienia do przygotowania:
- metody chromatograficzne stosowane w oczyszczaniu białek (chromatografia jonowymienna,
chromatografia adsorpcyjna, filtracja \
elowa, chromatografia powinowactwa, HPLC)
- elektroforeza i ogniskowanie izoelektryczne  metody rozdziału białek wykorzystujące
ró\
nice w ich pI
- dializa i sączenie \
elowe (filtracja \
elowa)  zasada i zastosowanie
- oczyszczanie białka, jako niezbędny etap w poznawaniu jego sekwencji aminokwasowej, struktu-
ry przestrzennej, w ustalaniu jego funkcji, szukaniu kodującego go genu i szukaniu ewolucyjne-
go pokrewieństwa z innymi białkami
- oznaczanie sekwencji aminokwasowej białek metodą degradacji Edmana
Piśmiennictwo:
Biochemia  JM Berg, JL Tymoczko, L Stryer PWN, Warszawa, 2005
Ćwiczenia z biochemii - (pod redakcją L. Kłyszejko-Stefanowicz) PWN, Warszawa, 2005
Biochemia. Ilustrowany przewodnik  J Koolman, K-H R�hm, PZWL, Warszawa 2005
10