Ćwiczenie 8 (MOiŚ)
T: Ocena wrażliwości bakterii na antybiotyki
1) Metoda krążkowo-dyfuzyjna
2) Metoda rozcieńczeniowa
a) w bulionie Mq
llera-Hintona
b) w agarze Mq
llera-Hintona
3) MIC
Antybiotyki  produkty metabolizmu drobnoustrojów działające w sposób wybiórczy bakteriobójczo lub
bakteriostatycznie w niskich stężeniach.
Chemioterapeutyki  leki przeciwdrobnoustrojowe uzyskane za pomocÄ… syntezy chemicznej, nie majÄ…ce swojego
odpowiednika w substancjach produkowanych przez organizmy żywe.
1) Metoda krążkowo dyfuzyjna
a) przygotowanie wyjściowej zawiesiny komórek bakteryjnych (monokultury)
Należy przygotować taką zawiesinę, aby w 1 ml znajdowało się 105  106 komórek bakteryjnych. W tym
celu 24-godzinną hodowlę bakteryjną rozcieńcza się w płynnym jałowym podłożu M-H w następujący
sposób:
·ð dla G(-) paÅ‚eczek 1:10000
·ð dla gronkowców 1:1000
·ð dla paciorkowców 1:100 (1:10)
Przykład: w celu otrzymania zawiesiny wyjściowej gronkowców pobieramy 1 ml z 24-godzinnej
płynnej zawiesiny i rozcieńczamy w 9 ml bulionu M-H (powstaje zawiesina 1:10). Następnie z
otrzymanego rozcieńczenia pobieramy także 1 ml i rozpuszczamy w 9 ml M-H (powstaje
zawiesina 1:100). Z powstałego rozcieńczenia pobieramy 1ml i dodajemy do 9 ml M-H
otrzymując końcowe rozcieńczenie 1:1000.
Różne wartości rozcieńczeń dla różnych organizmów wynikają z ich naturalnego tempa podziałów
komórkowych, a więc z liczebności komórek w 24-godzinnej hodowli.
Opcjonalnie można wykonać zawiesinę komórek mającą 0,5 w skali McFarlanda.
b) 0,1 ml odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej nanosimy na podłoże stałe (agar Mq
llera-
Hintona), a następnie rozprowadzamy po całym podłożu zgiętą bagietką   hokejówką .
c) Na podłoże wykładamy 2 lub 3 krążki bibułowe nasycone antybiotykami. Każdy krążek jest odpowiednio
oznaczony i zawiera jeden rodzaj antybiotyku. Krążki muszą być ułożone co najmniej 2 cm od brzegu
szalki Petriego i 2cm od siebie nawzajem
d) PodÅ‚oże z krążkami nastÄ™pnie inkubujemy przez 24 h w temperaturze 37°C
e) Antybiotyk dyfunduje do podłoża. W miejscu, gdzie w podłożu jest odpowiednie stężenie antybiotyku i
szczep jest na niego wrażliwy powstaje strefa zahamowanego wzrostu.
f) Mierzymy średnicę strefy zahamowanego wzrostu wokół każdego krążka bibułowego. Porównujemy z
danymi podanymi przez producenta aby stwierdzić wrażliwość, średnią oporność lub oporność badanego
szczepu bakteryjnego.
Bulion/agar Mq
llera-Hintona:
·ð hydrolizat kazeiny
·ð wyciÄ…g miÄ™sny
·ð skrobia
·ð agar 2% (opcjonalnie)
·ð brak NaCl oraz glukozy, które mogÄ… ograniczać dziaÅ‚anie niekt. antybiotyków
Podłoże zapewnia wszystkie składniki odżywcze oraz jest izoosmotyczne względem komórek bakteryjnych. Nie
zawiera jednak NaCl ani glukozy.
2) Metoda rozcieńczeniowa
a) w bulionie M-H
·ð SporzÄ…dzamy rozcieÅ„czenia antybiotyku w probówkach w podÅ‚ożu pÅ‚ynnym. RozcieÅ„czenia
wykonuje się w postępie geometrycznym tzn. każda kolejna próbówka zawiera antybiotyk o
dwukrotnie niższym stężeniu.
·ð Do każdej probówki dodajemy takÄ… samÄ… objÄ™tość zawiesiny bakteryjnej zawierajÄ…cej 105-106
komórek (1 ml).
·ð Inkubujemy 24h w temp 37°C.
·ð Odczytujemy wynik i okreÅ›lamy MIC
W części probówek obserwujemy wzrost, a reszta jest klarowna. Na podstawie tych obserwacji odczytujemy MIC.
MIC (minimal inhibition concentration)  najniższe stężenie antybiotyku hamujące wzrost drobnoustrojów.
Wartość MIC porównujemy ze średnim osiągalnym stężeniem antybiotyku w surowicy krwi przy optymalnej dawce
dziennej. Dane te są podane przez producenta. Jeżeli MIC jest większe od średniego osiągalnego stężenia w surowicy
to antybiotyk jest w takim przypadku bezskuteczny w leczeniu.
b) w agarze M-H
·ð Przygotowujemy szereg rozcieÅ„czeÅ„ antybiotyku w postÄ™pie geometrycznym podobnie jak w
przypadku metody rozcieńczeniowej w bulionie M-H. Różnica polega na tym, że stężenia
antybiotyku są 10 x wyższe niż końcowe stężenia jakie chcemy uzyskać. Takie podejście stosuje
się dlatego, że antybiotyk zostanie następnie rozcieńczony przez agar M-H.
·ð Na szereg pÅ‚ytek Petriego wylewamy po 1ml zawiesiny antybiotyku o odpowiednim stężeniu, a
nastÄ™pnie zalewamy 10 ml podÅ‚oża M-H ostudzonego do 42°C. Do jednej pÅ‚ytki nie dodajemy
antybiotyku  będzie to płytka kontrolna
·ð Kiedy agar ulegnie zestaleniu posiewamy badany szczep bakteryjny w postaci paska (lub wiÄ™kszÄ…
liczbę szczepów  wtedy dzielimy płytkę na sektory)
·ð Inkubujemy 24h w 37°C
·ð Odczytujemy wynik i okreÅ›lamy MIC
Jeżeli we wszystkich probówkach lub szalkach Petriego rosną bakterie to znaczy, że są oporne na dany szczep
bakteryjny.
Zadanie do samodzielnego wykonania:
Opisz podział antybiotyków ze względu na ich budowę chemiczną. Do każdego typu wymień przykładowe antybiotyki.