Zastosowanie drożdży w syntezie 1,2-dioli
Prowadzący: mgr inż. Maciej Chrubasik
Opracował: mgr inż. Maciej Chrubasik
Fermentacja alkoholowa
Zdecydowanie najstarszym mikroorganizmem, z którym człowiek nawiązał "współpracę"
były drożdże. Produktem tej współpracy był oczywiście etanol - na poniższym rysunku
przedstawiono uproszczony schemat przemian chemicznych jakim ulega glukoza pod
wpływem drożdży:
OH
O
OH glukoza
OH
HO
OH
4H
4H
O
H3C
H3C
H3C
2
2
2
OH
OH
O
O CO2
2
kwas pirogronowy aldehyd octowy alkohol etylowy
(etanal)
(kwas Ä…-ketopropionowy)
W pierwszych etapach glukoza ulega degradacji do dwóch cząsteczek kwasu pirogronowego,
który następnie ulega dekarboksylacji do aldehydu octowego. Dzięki zmagazynowanemu
wodorowi, drożdże przeprowadzają w końcowym etapie redukcję aldehydu do alkoholu
etylowego.
Drożdże
Drożdże (Saccharomyces) - grzyby jednokomórkowe z klasy workowców, rozmnażające się
głównie przez pączkowanie (tworząc kolonie), rzadziej przez zarodniki (drożdże
zarodnikujące). Znanych jest około 1500 gatunków drożdży. Średnica komórki drożdży
wynosi Å›rednio od 3 do 4 µm, ale niektóre gatunki osiÄ…gajÄ… rozmiary nawet o rzÄ…d wyższe. Do
rozwoju, drożdże nie potrzebują światła.
Zależnie od gatunku, tlen może być dla nich niezbędny lub nie, ale wszystkie gatunki mogą
go wykorzystywać w celu pozyskiwania energii w cyklu Krebsa. Jest z tym związane
zahamowanie produkcji etanolu, gdy przez zawiesinę drożdży przepuszcza się tlen - drożdże
uzyskują w cyklu Krebsa o wiele więcej energii, ale jako produkty rozkładu glukozy
otrzymuje się wyłącznie wodę i dwutlenek węgla.
Etanol powstający w fermentacji alkoholowej jest dla drożdży trucizną - nawet drożdże
gorzelnicze giną, gdy stężenie etanolu przekroczy 18% obj.
Kondensacja acyloinowa
1) Informacje ogólne
Jednym z ciekawszych działów chemii organicznej jest synteza związków zawierających
centra chiralne. W ostatnich latach dużym zainteresowaniem cieszy się wykorzystanie w
takich procesach mikroorganizmów. W tym ćwiczeniu zaprezentowane zostanie
wykorzystanie drożdży w syntezie (1R, 2S)-1-fenylopropanodiolu:
OH
O
O
H3C
0,5 OH
OH OH
HO
O
2H
OH
CO2
OH
2H
O
H3C
H3C
H3C
O
HO
HO
O
aldehyd benzoesowy (1R, 2S)-1-fenylopropanodiol
Ä…-hydroksy keton
Drożdże katalizują proces kondensacji acyloinowej aldehydu benzoesowego i aldehydu
octowego, przy czym (co najważniejsze) produkt charakteryzuje się wysoką czystością
optyczną (ee = 97%). Wydajność 1,2-diolu wynosi od 33% do 47% w stosunku do
zastosowanego aldehydu benzoesowego.
Na ostateczną wydajność 1,2-diolu wpływają reakcje uboczne:
- reakcja kondensacji dwóch cząsteczek aldehydu benzoesowego
- reakcja redukcji aldehydu benzoesowego do odpowiedniego alkoholu
Pomimo niskiej wydajności, proces ten jest bardzo opłacalny ponieważ wysoka czystość
optyczna produktu pozwala na uniknięcie kosztownego i czasochłonnego rozdzielania
enancjomerów.
2) Kondensacja acyloinowa jako przykład reakcji z odwróceniem polaryzacji (efekt
umpolung)
Kondensacja acyloinowa jest przykładem reakcji z wykorzystaniem odwrócenia polaryzacji
czÄ…steczki (efekt umpolung).
Grupy karbonylowe mają charakter akceptorowy. Przykładem może być reakcja addycji
nukleofilowej siarczynu sodu (nukleofil) do aldehydu (elektrofil) :
OH
O
+
- +
Na HSO3-
H
+ R SO3
Na
R
H
W dużym uproszeniu, enzymy obecne na powierzchni drożdży odwracają polaryzację
cząteczki aldehydu octowego i sprawiają, że staje się on nukleofilem:
O
O
HO
CH3
CH3
+
O
Podobne reakcje można przeprowadzić w laboratorium, bez udziału drożdży. Jedną z metod
jest zastosowanie estrów zamiast aldehydów i przeprowadzenie reakcji w obecności
metalicznego sodu:
O O O OH
O O
+
Na
REt Et R RR
Inną metodą jest przeprowadzenie aldehydu w cyjanohydrynę i jej następczą kondensację z
aldehydem:
-
O OH
OH
HO O
O
- -
C N C CN R
+
RR
R R
R
CN
-
CN
O
R
Żadna z tych metod nie jest jednak stereospecyficzna i w ich wyniku uzyskujemy mieszaniny
enancjomerów.
3) Tautomeria keto - enolowa
Wszystkie związki karbonylowe posiadające wodór ą mogą ulegać tautomerii keto-enolowej.
Tautomeria ta może być przyczyną powstawania mieszanin racemicznych - forma enolowa
nie zawiera centrów chiralnych, a ich odtworzenie (czyli powtórne przejście do ketonu) nie
jest stereospecyficzne:
HO O HO OH O OH
CH3 CH3 CH3
forma enolowa
Jest to między innymi powodem, dla którego nadmiar enancjomeryczny (ee - enantiomeric
excess) produktu kondensacji acyloinowej z udziałem drożdży wynosi 97%, a nie 100%.
4) Stereoselektywność reakcji redukcji grupy karbonylowej przez drożdże
Drożdże można również wykorzystać w procesie selektywnej redukcji wiązań podwójnych.
Przy syntezie 1,2-dioli mamy do czynienia z redukcjÄ… grupy karbonylowej, przy czym
najważniejszą cechą tej reakcji jest jej wysoką stereospecyficzność. Na rysunku poniżej
przedstawiono model, który pozwala przewidzieć konfigurację produktu redukcji:
O
H
OH
H3C
H3C
H
D
D-H jest donorem wodoru. Redukcji ulega czÄ…steczka acetofenonu (metylofenylo ketonu).
Grupa metylowa (-CH3) jest grupą małą, za to grupa fenylowa jest dużą grupą i stwarza
zawadę steryczną. Cząsteczkę acetofenonu obracamy w ten sposób, że grupa duża (fenylowa)
wystaje ponad płaszczyznę tej strony, a grupa mała (metylowa) znajduje się pod nią. Wtedy,
donor wodoru (D-H), atakuje grupę karbonylową z lewej strony, co daje produkt o określonej
konfiguracji - w tym wypadku konfiguracji S.
Odczynniki
Odczynniki potrzebne do przeprowadzenia procesu kondensacji acyloinowej:
Benzaldehyd 0,6 cm3
Aldehyd octowy 0,75 cm3
Drożdże piekarskie 19 g
Glukoza 15 g
Woda (kranowa) 50 cm3
Odczynniki potrzebne do przeprowadzenia 1,2-diolu w eter benzylowy:
DMF (N,N-dimetyloformamid) 10 cm3
Bromek benzylu 0,5 cm3
Wodorek sodu (NaH) 0,2 g
Odczynniki pomocnicze (wykorzystywane przy wydzielaniu produktu):
Celite® Hyflo Supercell 10 g
Octan etylu 300 cm3
Siarczan sodu (bezwodny)
Toluen 20 cm3
Wykonanie ćwiczenia
1) Przeprowadzenie procesu kondensacji acyloinowej:
Do zawiesiny drożdży (12,5g) w wodzie dodajemy glukozę (10g). Mieszamy w temperaturze
pokojowej przez 15 minut. Następnie dodajemy benzaldehyd (0,6 cm3) oraz aldehyd octowy
(0,75 cm3).
Aldehyd octowy dodaje się do mieszaniny w celu ograniczenia niepożądanej reakcji redukcji
aldehydu benzoesowego do alkoholu - redukcji tej będzie teraz ulegał głównie aldehyd
octowy.
Mieszamy aż do zaniku benzaldehydu (ok 1,5 h) - postęp reakcji monitorujemy techniką
cienkowarstwoej chromatografii (TLC = tight liquid chromatography). Skład eluentu toluen :
octan etylu 3 : 1. Płyki wybarwiamy w komorze z I2, a następnie poprzez wypalanie w kwaie
siarkowym.
Dodajemy kolejną porcję drożdży (6,5g) oraz glukozy (5g). Postęp redukcji monitorujemy
również za pomocą techniki TLC.
Dodatek nowej porcji drożdży oraz glukozy zapewnia szybszą redukcję hydroksy ketonu do
1,2-diolu, a więc ograniczenie tautomerii keto-enolowej na czystość optyczna produktu.
2) Wydzielenie produktu:
MieszaninÄ™ reakcyjnÄ… sÄ…czymy pod ciÅ›nieniem przez warstwÄ™ Celite® Hyflo supercel w celu
pozbycia się zawiesiny drożdży. Osad przemywamy wodą.
PrzesÄ…cz ekstrahujemy octanem etylu (4 razy po 75 cm3), suszymy bezwodnym siarczanem
sodu. Rozpuszczalnika pozbywamy się pod zmniejszonym ciśnieniem, uzyskując ciecz,
będącą mieszaniną 1,2-diolu i alkoholu benzylowego.
3) Przeprowadzenie produktu w pochodnÄ… benzylowÄ…:
CH3 CH3
HO Br O
OH O
2 2 NaH
+ +
DMF
-10oC -> temp. pok.
Aby wyodrębnić czysty 1,2-diol przeprowadza się go w pochodną benzylową - eter
benzylowy - , którą można wykrystalizować z etanolu, pozbywając się w ten sposób alkoholu
benzylowego.
Surowy produkt kondensacji acyloinowej rozpuczcza się w DMF`ie i ochładza na łaz
ni lód-
sól. Następnie wsypuje się stechiometryczną ilość wodorku sodu i miesza do uzyskania
zawiesiny. Wlewamy stechiometryczną ilość bromku benzylu. Po około 15min. odstawiamy
Å‚az
nię chłodzącą i pozwalamy mieszaninie ogrzać się do temperatury pokojowej. Postęp
reakcji monitorujemy za pomocÄ… chromatografii cienkowarstwowej (TLC) - eluent
toluen:octan etylu 8:1.
Obróbka mieszaniny poreakcyjnej: do mieszaniny wlewamy ostrożnie wodę (neutralizacja
pozostałego wodorku sodu). Całość przenosimy do rozdzielacza i ekstahujemy toluenem.
Rozdzielamy fazy i warstwÄ™ wodnÄ… jeszcze raz ekstrahujemy toluenem. Fazy organiczne
łączymy i zatężamy pod ciśnieniem. Przeprowadzamy krystalizację z etanolu.
4) Porównanie aktywności drożdży po procesie kondensacji acyloinowej
a) Badania mikroskopowe
Na szkiełko mikroskopowe nanosimy kroplę zawiesiny drożdży w wodzie i przykrywamy
folią spożywczą. Porównujemy rozproszenie i kształt komórek drożdży przed procesem oraz
po ich odsÄ…czeniu z mieszaniny reakcyjnej.
b) Porównanie szybkości rozkładu glukozy
Do kolby naważamy 0,1 g drożdzy, wlewamy 30 cm3 i mieszamy aż do uzyskania zawiesiny.
Dodajemy 10 cm3 r-ru glukozy w wodzie. Po 10min. dodajemy kolejne 10 cm3 r-ru glukozy i
dokładnie po 5 minutach rozpoczynamy pomiar szybkości wydzielania się dwutlenku węgla.
Porównujemy szybkość rozkładu glukozy przez drożdże przed procesem oraz po ich
odsÄ…czeniu z mieszaniny reakcyjnej.
biureta
lewar wyrownujacy
cisnienie
(nasycony r-r NaCl)
mieszanina
reakcyjna
Aparatura do pomiaru szybkości wydzielania się dwutlenku węgla.
Zagrożenia !!!
Wodorek sodu (NaH) jest bardzo silnÄ… zasadÄ… - powoduje oparzenia w kontakcie ze
skórą. Reaguje bardzo gwałtownie z wodą ! Pracować wyłącznie w rękawicach i
okularach ochronnych !
Bromek benzylu - silnie toksyczny, powoduje łzawienie. Pracować wyłącznie pod
sprawnie działającym wyciągiem !
Wypalanie płytek TLC kwasem siarkowym - powstaje mgła kwasu siarkowego!
Powoduje oparzenia dróg oddechowych ! Pracować wyłącznie pod sprawnie
działającym wyciągiem !
Zaliczenie ćwiczenia
Warunki zaliczenia ćwiczenia:
1) Zaliczenie kartkówki na ocenę conajmniej dostateczną
2) Aktywny udział w wykonywaniu ćwiczenia
3) Oddanie sprawozdania z przebiegu ćwiczenia
Ocena z ćwiczenia jest średnią z kartkówki, aktywności oraz sprawozdania.
Przykładowe zadania
1) Jaką konfigurację bezwzględną (R,S) posiada poniższy związek:
CH3
CH3
OH
2) Nadmiar enancjomeryczny (ee, enantiomeric excess) jest wyrażony wzorem:
R - S
ee = 100%
R + S
gdzie: R - ilość moli enancjomeru będącego w nadmiarze , S - ilość moli drugiego
enancjomeru.
Obliczyć ułamek molowy enancjomeru R (R/(R+S), jeśli ee = 97%
3) Gdyby w omawianym ćwiczeniu zastąpić aldehyd benzoesowy poniższym aldehydem, jaki
powstałby produkt:
CH3
H3C
CH3 O
Odpowiedzi:
1) konfiguracja S
2) R/(R+S) = 0,985
3)
OH
CH3
H3C
CH3
HO
H3C