SEKWENCJONOWANIE - S
JUŻ DO TEGO MASZYNY file:///C:/Users/Madzia/Desktop/Nowy%20folder%20-%20materialy...
SEKWENCJONOWANIE - S
JUŻ DO TEGO MASZYNY.
Sekwencjonowanie - metoda , dzięki której możliwe jest ustalenie sekwencji czyli
określenie kolejności nukleotydów. Jeden z etapów analizy genu. Na podstawie
sekwencji istnieje możliwość przewidzenia kolejności aminokwasów w białku , które
jest kodowane przez dany gen.
Są dwie metody sekwencjonowania :
- Enzymatyczna - metoda Sangera
Na jednoniciowej matrycy syntetyzuje się in vitro DNA. Syteza przebiega od
radioaktywnego , oligonukleotydowego startera komplementarnego do 3` końca
matrycy. Reakcję wykonuje się równolegle w czterech probówkach , w których
oprócz kompletu deoksytrifosforanów nukleotydów (dATP , dCTP , dTTP , dGTP)
dodana jest niewielka ilość jednego z nich w postaci dideoksytrifosforanu nukleotydu
, co uniemożliwia kontynuowanie reakcji w momencie włączenia takiego nukleotydu
w syntetyzowany łańcuch , ponieważ brakuje wtedy grupy hydroksylowej na 3`
końcu.
1 z 5 2010-04-04 13:23
SEKWENCJONOWANIE - S
JUŻ DO TEGO MASZYNY file:///C:/Users/Madzia/Desktop/Nowy%20folder%20-%20materialy...
Synteza zostaje zahamowana losowo - powstaje mieszanina fragmentów o różnej
długości.
2 z 5 2010-04-04 13:23
SEKWENCJONOWANIE - S
JUŻ DO TEGO MASZYNY file:///C:/Users/Madzia/Desktop/Nowy%20folder%20-%20materialy...
Produkty reakcji poddawane są elektroforezie w czterech
równoległych ścieżkach na żelu poliakrylamidowym. Pozwala to
na ustalenie sekwencji nici komplementarnej do badanej.
- Chemiczna - metoda Maxama-Gilberta
Jest to metoda praktycznie już nie stosowana.
Polega na degradacji wyznakowanych na 5` końcu cząsteczek DNA związkami
chemicznymi przecinającymi specyficznie wiązania fosfodiestrowe za nukleotydem
odpowiadającym określonej zasadzie azotowej. Wynikiem reakcji jest zbiór
fragmentów DNA o różnej długości co spowodowane jest takim doborem warunków ,
że w poszczególnych cząsteczkach przecinane jest tylko jedno lub dwa wiązania.
Fragmenty z czterech niezależnych reakcji (dGTP , dGTP i dATP , dCTP , dCTP i
dTTP) rozdziela się elektroforetycznie po czym poddaje autoradiografii. Prążki na
3 z 5 2010-04-04 13:23
SEKWENCJONOWANIE - S
JUŻ DO TEGO MASZYNY file:///C:/Users/Madzia/Desktop/Nowy%20folder%20-%20materialy...
autoradiogramie odpowiadają fragmentom DNA posiadającym na końcu 5`
znakowany fosfor a na końcu 3` określoną zasadę.
Obydwie metody pozwalają na odczytanie sekwencji około 400 do 700 nukleotydów
w jednym doświadczeniu. Jeśli sekwencjonujemy dłuższy odcinek należy go pociąć
enzymem restrykcyjnym i ustalać sekwencję każdego fragmentu osobno.
4 z 5 2010-04-04 13:23
SEKWENCJONOWANIE - S
JUŻ DO TEGO MASZYNY file:///C:/Users/Madzia/Desktop/Nowy%20folder%20-%20materialy...
IZOLACJA Z ŻELU CZYLI JAK ODZYSKAĆ DNA
PCR
(c) 1997, 1998 Biologia Molekularna w Internecie Webmaster
5 z 5 2010-04-04 13:23