Materiały do ćwiczenia 4.
Metody chromatograficzne w oczyszczaniu białek.
Chromatografia metalopowinowactwa.
PodstawÄ… chromatografii metalopowinowactwa (IMAC  Immobilized Metal
Affinity) jest fakt, że białka posiadają liczne reszty funkcyjne, które mają zdolność
kompleksowania jonów metali przejściowych (i nie tylko)  są to grupy tiolowe Cys,
imidazolowe His, karboksylowe Glu i Asp oraz fenolanowe Tyr.
Rys. 1 Schemat oczyszczania przy użyciu chromatografii metalopowinowactwa.
Złoże do oczyszczania w systemie IMAC powinno być zbudowane z hydrofobowego
polimeru posiadającego powierzchniowe hydrofilowe grupy zapewniające jego zwilżalność,
np. agaroza, celuloza. Złoże IMAC powinno być tak zmodyfikowane chemicznie, aby
posiadało zdolność chelatowania jonów metali przejściowych, które stanowią właściwe
ligandy oddziałujące z białkami. Ważne jest, aby chelatowanie jonów metali było na tyle
silne, żeby nie następowało ich wymywanie podczas procesu oczyszczania. Wyróżniamy trzy
złoża opracowane dla układu IMAC:
1
" IDA-agaroza (ang. iminodiacetate)  złoże agarozowe posiadające jako grupy
aktywne reszty kwasu iminodioctowego. Grupa ta stosunkowo słabo chelatuje
jony metali, ponieważ posiada tylko trzy ligandy zdolne do kompleksowania.
Chelatowany jon metalu w geometrii oktaedrycznej posiada aż trzy wolne miejsca
koordynacyjne, które potencjalnie mogą służyć do wiązania oczyszczonego biała
(rys. 2). IDA jest grupą wywierającą niewielki efekt steryczny na pozostałe wolne
miejsca koordynacyjne jonu metalu  w efekcie obniża to selektywność wiązania
oczyszczanych białek.
Rys. 2 Schemat złoża IDA.
X Å›' wolne miejsce koordynacyjne jonu metalu zdolne do kompleksowania z
resztami białka.
Me ś'chelatowany przez złoże jon metalu, np. Ni2+
" TED-agaroza (ang. tris(carboxymethyl)ethylenediamine)  złoże agarozowe
posiadajÄ…ce jako grupÄ™ chelatujÄ…cÄ… jony metali
tris(karboksymetylo)etylenodiaminę. Grupa ta posiada pięć miejsc ligandowych
zdolnych do chelatowania jonu metalu. Powoduje to, że złoże TED silnie wiąże
jony metali i w efekcie nie następuje wypływ jonów podczas oczyszczania.
Chelatowany przez TED jon metalu w układzie oktaedrycznym posiada wolne
tylko jedno miejsce koordynacyjne (rys.3). Wynikiem tego jest mniejsza
pojemność złoża TED niż złoża IDA. TED jest złożoną grupą przestrzenną
wywierającą silny efekt steryczny na wiązanie białka przez jon metalu  złoże
TED jest znacznie bardziej selektywne od złoża IDA.
2
Rys. 3 Schemat złoża TED.
X Å›' wolne miejsce koordynacyjne jonu metalu zdolne do kompleksowania z
resztami białka.
Me ś'chelatowany przez złoże jon metalu, np. Ni2+
" NTA (ang. nitrilotriacetic acid)  złoże agarozowe zawierające jako grupę
chelatujÄ…cÄ… jon metalu reszty kwasu nitrylotrioctowego. NTA posiada cztery
miejsca ligandowe chelatujące jony metalu. Związany przez złoże jon metalu
zachowuje jeszcze dwa miejsca koordynacyjne wolne (rys.4). Oznacza to, że jest
to złoże pośrednie w własnościach pomiędzy IDA a TED, wykazujące dużą siłę
wiązania jonów metalu oraz stosunkowo dużą pojemność. Podstawową wadą
tego złoża jest wysoki koszt jego syntezy w stosunku do IDA i TED.
Rys. 4 Schemat złoża NTA.
X Å›' wolne miejsce koordynacyjne jonu metalu zdolne do kompleksowania z
resztami białka.
Me ś'chelatowany przez złoże jon metalu, np. Ni2+
3
Selektywność układu oczyszczającego w chromatografii metalopowinowactwa można
uzyskać poprzez przyłączenie do oczyszczanego białka domeny fuzyjnej zawierającej kilka
występujących kolejno po sobie reszt aminokwasowych tworzących kompleksy z jonem
metalu. W tym momencie pojedyncze reszty aminokwasowe występujące na powierzchni
białek będą znacznie słabiej wiązane ze złożem. Białko hydrofobowe zawierające na
powierzchni wyeksponowaną do otoczenia domenę fuzyjną zawierającą ciąg aminokwasów
chelatujących będzie wypierać z kompleksów z jonami metali inne białka wiążące się
znacznie słabiej. Z aminokwasów występujących w białkach, zdolnych do kompleksowania
jonów metali, tylko histydyna i tyrozyna nadają się do konstrukcji domen fuzyjnych. Wynika
to z tego, że aminokwasy te w warunkach fizjologicznych nie są obdarzone ładunkiem i nie
mają zdolności do tworzenia wiązań kowalencyjnych z innymi resztami występującymi w
białku  gwarantuje to minimalny wpływ domeny fuzyjnej na aktywność oczyszczanego
białka. Domena fuzyjna w postaci aminokwasów kwaśnych nadawałaby białku silny
wypadkowy ładunek, który znacznie wpłynąłby na rozpuszczalność i aktywność
oczyszczanego białka; domena fuzyjna w postaci reszt cysteiny mogłaby wpłynąć na strukturę
hybrydu poprzez tworzenie mostków disiarczkowych z cysteinami występującymi w łańcuchu
peptydowym oczyszczanego białka.
W celu wybrania jonu metalu do systemu IMAC można posłużyć się teorią miękkich i
twardych kwasów i zasad. Zgodnie z tą teorią miękkie zasady najchętniej oddziałują z
twardymi zasadami tworząc układy jonowe. Histydyna zawierająca pierścień imidazolowy
jest stosunkowo miękką zasadą i będzie tworzyć trwałe termodynamicznie kompleksy z
miękkimi kationami metali, np. Co2+, Ni2+ czy Zn2+. Właśnie te trzy jony metali stosuje się
jako ligandy złoża wiążące białka fuzyjne zawierające domeny polihistydynowe (His rzadziej
6
His ) lub mieszane histydynowo-tyrozynowe w chromatografii metalopowinowactwa IMAC.
10
Warunki prowadzenia oczyszczania:
" wszystkie bufory stosowane do oczyszczania powinny zawierać wysokie stężenie
soli
(0,5 M NaCl). Niweluje to niespecyficzne oddziaływania jonowe ujemnie
naładowanych reszt aminokwasowych ze złożem, nie wpływa natomiast na
tworzenie kompleksów metalu  His lub Trp, ponieważ mają one charakter
bardziej kowalencyjny;
" wszystkie bufory powinny mieć pH powyżej punktu izoelekrycznego histydyny
tak, aby nie następowało protonowanie reszt His;
4
" elucji związanego białka można dokonać za pomocą kompetytora  imidazolu o
wysokim stężeniu (0,5 M) lub poprzez protonację histydyn przez obniżenie pH do
5,9;
" następujące związki nie mają wpływu na wiązanie się białka fuzyjnego do złoża: 6
M chlorowodorek guanidyny, 8 M mocznik, 2% Triton X  100, 2% Tween 20,
20 mM ²-merkaptoetanol, 50% glicerol, 30% etanol, 2 M NaCl, 4 M MgCl , 20
2
mM imidazol.
Wady i zalety metody:
" domena fuzyjna typu His" Tag jest jednÄ… z najmniejszych stosowanych obecnie
domen fuzyjnych w chromatografii powinowactwa  ok. 1 kDa. Powoduje to, że
wywiera ona nikły wpływ na aktywność oczyszczanego białka i nie ma
konieczności jej proteolitycznego odcinania;
" stosowanie domen poli(His) pozwala na potwierdzenie oczyszczania w warunkach
natywnych i denaturujÄ…cych;
" układ ten pozwala nie tylko na oczyszczanie, ale i na silne zagęszczanie próbki ze
względu na dużą pojemność złoża;
" systemy IMAC pozwalają na uzyskanie białka rekombinantowego o czystości
powyżej 90% w czasie krótszym niż 1 godzina;
" podstawową wadą stosowania domeny fuzyjnej w postaci układu
polihistydynowego jest spowalnianie procesu translacji, co nieco osłabia ekspresję.
y
ródło: Materiały do ćwiczeń z Biologii Molekularnej, Politechnika Gdańska.
5