Tom 51, 2002
Numer 1 (254)
Strony 5 12
PIOTR WIDŁAK
Zakład Radiobiologii DoS
wiadczalnej i Klinicznej
Centrum Onkologii - Instytut im. Marii Składowskiej-Curie, Oddział w Gliwicach
Wybrzeże Armii Krajowej 15, 44-100 Gliwice
e-mail: [e-mail]
STRUKTURA CHROMATYNY A POWSTAWANIE I NAPRAWA USZKODZEŃ DNA
WPROWADZENIE
Genomy wszystkich organizmów narażone waż replikacja DNA zawierającego uszkodzenia
są na działanie czynników mających zdolnoS
ć wiąże się z ryzykiem powstania mutacji, obec-
modyfikacji chemicznej struktury DNA, czyli in- noS
ć takich uszkodzeń jest szczególnie niebez-
dukowania uszkodzeń DNA. Do takich czynni- pieczna w komórkach dzielących się.
ków, nazywanych genotoksycznymi, należą róż- Komórki dysponują detektorami uszkodzeń
norodne substancje chemiczne i niektóre ro- DNA i po ich wykryciu uruchamiają kilka typów
dzaje promieniowania elektromagnetycznego. odpowiedzi. Podstawową odpowiedzią komór-
Jednym z rodzajów endogennych czynników ki na uszkodzenia DNA jest jego naprawa, po-
genotoksycznych są reaktywne formy tlenu, zwalająca na usunięcie uszkodzenia i odtworze-
będące produktami metabolizmu komórkowe- nie prawidłowej struktury DNA. JednoczeS
nie z
go. Efektem działania substancji takich jak wol- zainicjowaniem naprawy, w komórkach uru-
ne rodniki tlenowe są oksydacyjne modyfikacje chamiane są mechanizmy prowadzące do zablo-
zasad azotowych DNA (w tym 8-okso-deoksyg- kowania cyklu komórkowego (ang. checkpoint
uanina, traktowana często jako znacznik oksy- control system). Zablokowanie cyklu komórko-
dacyjnych uszkodzeń DNA) oraz pęknięcia jed- wego wydłuża czas na naprawę DNA przed re-
nej lub obu nici DNA (ang. single-, do- plikacją i podziałem chromosomów. Uszkodze-
uble-strand breaks). R
rodowiskowe czynniki ge- nia DNA, które nie mogą być naprawione, są
notoksyczne to przede wszystkim promienio- często eliminowane razem z całą komórką. Pro-
wanie ultrafioletowe i promieniowanie joni- ces umożliwiający takie rozwiązanie nazywamy
zujące, ale również liczne chemiczne związki al- apoptozą, czy inaczej  programowaną S
mier-
kilujące i arylujące (wS
ród nich policykliczne cią komórki. W organizmach funkcjonują różne
węglowodory aromatyczne). Fotouszkodzenia mechanizmy naprawy DNA. Najprostszy z nich
DNA indukowane przez promieniowanie UV to to tak zwana naprawa bezpoS
rednia, pozwa-
głównie dimery pirymidynowe, zaS
promienio- lająca na naprawę niektórych typów fotouszko-
wanie jonizujące indukuje przede wszystkim dzeń (proces katalizowany przez fotoliazy
oksydacyjne modyfikacje zasad i pęknięcia nici DNA), czy alkilowanych nukleotydów (katalizo-
DNA. Alkilujące i arylujące związki chemiczne wany przez odpowiednie metylotransferazy).
mogą kowalencyjnie wiązać się z nukleotydami Wiele typów uszkodzeń usuwanych jest z DNA
tworząc tak zwane addukty DNA. Wszystkie ta- za poS
rednictwem naprawy przez wycinanie. W
kie uszkodzenia DNA w mniejszym lub więk- naprawie takiej uszkodzony nukleotyd usuwa-
szym stopniu zmieniają strukturę chromoso- ny jest wraz z fragmentem jednej nici DNA, a
mów i zaburzają procesy ich replikacji. Ponie- brakujący fragment syntetyzowany jest na ma-
6 PIOTR WIDŁAK
trycy nici komplementarnej. W mechanizmie ne w bardziej skomplikowane struktury o róż-
naprawy przez wycięcie zasady (ang. base exci- nym stopniu upakowania; największy stopień
sion repair, BER) naprawiane są głównie zasady upakowania osiąga chromatyna w chromoso-
oksydowane lub alkilowane. Z kolei w mechani- mie metafazowym. Włókna chromatyny ko-
zmie naprawy przez wycięcie nukleotydu (ang. mórek interfazowych mogą oddziaływać z la-
nucleotide excision repair, NER) usuwane są fo- miną jądrową i z hipotetyczną, wewnątrz-
touszkodzenia indukowane przez promienio- jądrową strukturą szkieletową, tak zwaną ma-
wanie UV czy addukty indukowane przez poli- cierzą jądrową. Oddziaływania chromatyny z
cykliczne węglowodory aromatyczne. W me- takimi białkami szkieletowymi umożliwiają
chanizm ten zaangażowanych jest ponad trzy- tworzenie strukturalnie i funkcjonalnie wyod-
dzieS
ci białek o różnej aktywnoS
ci enzymatycz- rębnionych domen, tak zwanych pętli chro-
nej (miedzy innymi helikazy, nukleazy, polime- matyny. Kolejne struktury chromatyny po-
razy i ligazy DNA). Pęknięcia obu nici DNA, zwalają na uporządkowane upakowanie
uszkodzenia szczególnie niebezpieczne dla ko- długich cząsteczek DNA na terenie jądra ko-
mórek, naprawiane są dzięki mechanizmom re- mórkowego oraz mają istotne znaczenie dla
kombinacyjnym: rekombinacji homologicznej regulacji wszystkich procesów metabolicz-
(HR) oraz łączenia końców niehomologicznych nych przebiegających w jądrze. Informacje
(NHEJ). Ponieważ powstawanie uszkodzeń dotyczące struktury nukleosomów i organiza-
DNA jest procesem ciągłym, sprawnoS
ć mecha- cji chromatyny w jądrze znajdzie Czytelnik w
nizmów naprawy DNA ma ogromne znacznie innych pracach przeglądowych (HAYES i
dla utrzymania stabilnoS
ci genomu. Osłabienie HANSEN 2001, WOODCOCK i DIMITROV 2001).
wydajnoS
ci naprawy DNA (wynikające na Nukleosomowa organizacja chromatyny ma,
przykład z mutacji w genach kodujących białka poza funkcjami strukturalnymi, decydujące
naprawcze) wiąże się ze zwiększonym ryzy- znaczenie dla regulacji ekspresji materiału ge-
kiem powstawania mutacji i rozwoju chorób netycznego. We frakcji chromatyny o dużym
nowotworowych. Szczegółowe omówienie stopniu kondensacji (tzw. heterochromatyna)
procesów prowadzących do powstawania nukleosomy są czynnikiem odpowiedzialnym
uszkodzeń DNA i mechanizmów ich naprawy za represję transkrypcji. Zmiana struktury nu-
oraz związków z procesami mutagenezy i nowo- kleosomów i osłabienie oddziaływań DNA z
tworzenia znajdzie Czytelnik w innych pracach histonami pozwala na udostępnienie DNA dla
przeglądowych, w tym wielu pracach publiko- swoistych czynników transkrypcyjnych i poli-
wanych w języku polskim (PIETRZYKOWSKA i meraz RNA. Zmiany struktury nukleosomów i
KRWAWICZ 1999, TRZECIAK i BŁASIAK 1999, stopnia upakowania chromatyny, pozwa-
TUDEK 1999, ZDZIENICKA 1999). lające na regulację transkrypcji, zależne są
Materiał genetyczny ma w komórkach eu- między innymi od kowalencyjnych modyfika-
kariotycznych postać chromatyny, czyli kom- cji DNA (metylacja) i histonów (acetylacja,
pleksu DNA, histonów i innych białek. Podsta- metylacja i fosforylacja) oraz od aktywnoS
ci
wową jednostką strukturalną chromatyny jest kompleksów remodelujących chromatynę.
nukleosom, zbudowany z oktameru histono- Szersze omówienie związków między tran-
wego (centralny tetramer [H3/H4]2 i dwa pe- skrypcją a nukleosomową strukturą chroma-
ryferyjne dimery [H2A/H2B]), wokół którego tyny można znalex
ć w licznych pracach
owinięte jest 146 par nukleotydów. Pomiędzy przeglądowych (KORNBERG 1999, ALFS i
kolejnymi nukleosomami znajduje się, wrażli- KINGSTON 2000, WU i GRUNSTEIN 2000).
wy na działanie nukleaz, DNA łącznikowy o Struktura nukleosomowa chromatyny (i jej
zmiennej długoS
ci (10-90 par zasad), który ewentualne zmiany) jest czynnikiem decy-
może oddziaływać z histonem H1 lub innymi dującym również o przebiegu procesów na-
niehistonowymi białkami chromatyny. prawy. Zagadnienie to jest przedmiotem ni-
Włókno nukleosomowe może być pofałdowa- niejszej pracy.
STRUKTURA CHROMATYNY MODULUJE PODATNOR
Ć DNA NA CZYNNIKI GENOTOKSYCZNE
Decydujące znaczenie dla powstania dane- czynnikiem uszkadzającym. Przykładowo: do-
go typu uszkodzeń DNA ma struktura nukle- datkowe wiązania indukowane przez promie-
otydu i jej swoiste oddziaływania chemiczne z niowanie UV tworzą się między pierS
cieniami
Chromatyna a powstawanie i naprawa uszkodzeń DNA 7
sąsiadujących pirymidyn, a związki alkilujace stywany jest do mapowania miejsc wiązania
preferują atom N7 guaniny. Jednak podatnoS
ć czynników transkrypcyjnych w żywej komór-
konkretnego nukleotydu na uszkodzenia mo- ce (ang. footprinting); wykorzystuje się do
dulowana jest przez szereg innych czynników. tego najczęS
ciej proste czynniki alkilujace ta-
Należą do nich struktura przestrzenna danego kie jak siarczan dwumetylu (DMS). Stwierdzo-
fragmentu DNA czy kontekst sekwencji DNA no, że wiązanie takich czynników transkrypcyj-
(czyli rodzaj sąsiadujących nukleotydów). Do- nych jak Sp1, AP-1 czy NF-1 wielokrotnie zwię-
datkowo podatnoS
ć konkretnego fragmentu ksza poziom fotouszkodzeń indukowanych
DNA na uszkodzenia modulowana jest przez przez promieniowanie UV. Wskazuje to, że po-
oddziałujące z nim białka. Od lat znany jest fakt, ziom uszkodzeń w pewnych regionach DNA
iż struktura nukleosomowa ma wpływ na iloS
ć może mieć charakter swoisty tkankowo
uszkodzeń DNA. Poziom adduktów indukowa- (TORNALETTI i PFEIFER 1995).
nych przez wiele chemicznych związków ge- W niektórych sekwencjach DNA prawdo-
notoksycznych, podobnie jak poziom tzw. podobieństwo zaistnienia mutacji jest wielo-
(6-4)-fotoproduktów indukowanych przez krotnie wyższe niż w innych fragmentach tego
promieniowanie UV, jest wielokrotnie wyższy samego genu. Powstanie takich gorących
w DNA łącznikowym niż w DNA z rdzenia nu- punktów mutacyjnych (ang. mutation hot
kleosomów. Z kolei w plemnikach, gdzie histo- spots) jest wypadkową kilku czynników, mie-
ny zastąpione są przez protaminy (co pozwala dzy innymi: (i) szybkoS
ci uszkadzania danego
na silniejszą niż w nukleosomach kondensację nukleotydu, (ii) wydajnoS
ci naprawy tego nu-
chromatyny), DNA jest bardziej oporny na kleotydu i (iii) dokładnoS
ci z jaką polimerazy
uszkadzenia niż DNA z komórek somatycznych DNA odczytują dane uszkodzenie. Struktura
(WIDŁAK 1994, 1997). Innymi białkami, któ- chromatyny i obecnoS
ć związanych białek jest
rych oddziaływania z DNA modulują jego po- jednym z czynników decydujących o częstoS
ci
datnoS
ć na uszkodzenia są czynniki transkryp- z jaką dany nukleotyd jest uszkadzany. Podob-
cyjne. Związanie czynnika transkrypcjnego nie, oddziaływanie z białkami jest czynnikiem
może zmniejszyć lub zwiększyć wydajnoS
ć z modulującym wydajnoS
ć naprawy tego nukle-
jaką czynniki genotoksyczne uszkadzają DNA otydu. Zagadnienie to zostanie omówione w
w obrębie miejsca wiązania. Fakt ten wykorzy- dalszej częS
ci artykułu.
STRUKTURA CHROMATYNY DECYDUJE O SZYBKOR
CI NAPRAWY DNA
Już w latach 70. stwierdzono, że naprawcza wanej, (ang. transcription-coupled NER
synteza DNA jest szybsza w DNA łącznikowym TC-NER), całkowicie zależna jest od transkryp-
niż w DNA związanym z rdzeniem nukleoso- cji, a sygnałem dla jej rozpoczęcia jest zabloko-
mów. Natomiast rekonstytucja nukleosomów wanie polimerazy II RNA na uszkodzonym nu-
na DNA plazmidowym (tworzenie tak zwa- kleotydzie. W komórkach bakteryjnych prze-
nych minichromosomów) jest czynnikiem bieg TC-NER zależny jest od białka TRCF, które
wielokrotnie spowalniającym jego naprawę inicjuje dysocjację polimerazy RNA z uszko-
(WIDŁAK 1997). W połowie lat 80. w laborato- dzonej matrycy i stymuluje wiązanie z uszko-
rium P. Hanawalta wykryto, że indukowane dzonym DNA kompleksu naprawczego
przez promieniowanie UV dimery pirymidyno- UvrABC nukleazy. Mechanizm TC-NER w ko-
we usuwane są wielokrotnie szybciej z aktyw- mórkach eukariotycznych nie jest do końca
nego genu reduktazy dwuhydrofolianowej niż wyjaS
niony; czynniki swoiS
cie związane z tym
z innych częS
ci genomu tych samych komórek. rodzajem naprawy w komórkach ludzkich to
Wkrótce potem stwierdzono, że fotouszkodze- białka CSA i CSB. DNA nieaktywny transkryp-
nia usuwane są szybciej z nici będącej matrycą cyjnie i nić sensowna genów transkrybowa-
w procesie transkrypcji (nić antysensowna), nych naprawiana jest w mechanizmie okreS
lo-
niż z nie transkrybowanej nici sensownej nym z ang. global genome NER, GG-NER. Czyn-
(BOHR 1991). Taka preferencyjna naprawa nikiem swoistym dla GG-NER jest białko XPC;
DNA dotyczy naprawy przez wycinanie nukle- pozostałe białka reperacyjne są wspólne dla
otydu (NER). Obecnie wiadomo, że w komór- obu rodzajów naprawy przez wycięcie nukle-
kach funkcjonują dwa rodzaje tego mechani- otydu (WIDŁAK 1997, PIETRZYKOWSKA i
zmu reperacyjnego. Naprawa nici transkrybo- KRWAWICZ 1999, TRZECIAK i BŁASIAK 1999).
8 PIOTR WIDŁAK
Preferencyjna naprawa nici transkrybowanej promotora w regionie oddziałującym z czynni-
sprawia, że mutacje znacznie częS
ciej kami transkrypcyjnymi (GAO i współaut.
wywoływane są przez uszkodzenia nici sen- 1994). Jedną z cech chromatyny aktywnej tran-
sownej niż uszkodzenia nici antysensownej, skrypcyjnie są jej oddziaływania ze strukturami
nawet jeS
li obie nici uszkadzane są z podobną szkieletowymi jądra, a frakcja DNA związanego
częstoS
cią. Przykładem może być wolna napra- z macierzą jądrową jest zwykle wzbogacona w
wa uszkodzeń nici sensownej w miejscach od- geny transkrybowane. Wiadomo, że te rodzaje
powiedzialnych za powstawanie  gorących uszkodzeń, które mogą być naprawiane prefe-
punktów mutacyjnych w genie p53 rencyjnie w mechanizmie TC-NER (np. foto-
(DENISSENKO i współaut. 1998). uszkodzenia) usuwane są najszybciej z frakcji
Chociaż, poza aktualnie transkrybowanymi DNA związanego z macierzą jądrową
nićmi DNA, cały genom naprawiany jest przy (MULLENDERS i współaut. 1990). Ostatnio
udziale mechanizmu GG-NER, to różne obszary stwierdzono, że swoiste dla TC-NER białko CSA
genomu naprawiane są różną szybkoS
cią. ulega przemieszczeniu do macierzy jądrowej
Uszkodzenia usuwane są 2-3-krotnie wolniej z w komórkach poddanych działaniu czynników
DNA znajdującego się w silnie skondensowa- uszkadzających DNA (KAMIUCHI i współaut.
nej heterochromatynie niż z genów aktywnych 2002). Sugeruje to, że mechanizmy naprawy
lub potencjalnie aktywnych znajdujących się DNA (a przynajmniej mechanizm TC-NER) zlo-
chromatynie o lux
niejszej strukturze (BOHR kalizowane są w macierzy jądrowej. Nie można
1991). Również różne fragmenty tego samego jednak wykluczyć, że szybka naprawa DNA
genu mogą być naprawiane z różną szybkoS
cią. związanego z macierzą jądrową jedynie od-
Decydują o tym swoiste oddziaływania z histo- zwierciedla preferencyjną naprawę genów ak-
nami lub innymi białkami niehistonowymi. tywnych transkrypcyjnie, zlokalizowanych w
Przykładem może być bardzo wolna naprawa pobliżu tej struktury.
ZMIANY STRUKTURY CHROMATYNY W TRAKCIE NAPRAWY DNA
Typową cechą niemal wszystkich mechani- czenie dla regulacji aktywnoS
ci transkrypcyj-
zmów naprawy jest to, że biorą w nich udział nej. Jednym z nich jest acetylacja histonów ka-
olbrzymie kompleksy białkowe, a naprawiany talizowana przez swoiste acetylotransferazy.
DNA poddany jest wielu zmianom struktural- Acetylacja reszt lizynowych w aminowych koń-
nym (rozplatanie, obróbka nukleolityczna czy cach histonów neutralizuje dodatni ładunek
synteza nici). Można więc łatwo wyobrazić so- grup aminowych, zmieniając ich oddziaływa-
bie, że upakowana struktura chromatyny (czy nia z DNA i innymi białkami, co inicjuje lokalną
sama obecnoS
ć nukleosomów) jest czynni- dekondensację włókna nukleosomowego. Na-
kiem spowalniającym lub nawet uniemożli- tomiast deacetylacja histonów katalizowana
wiającym naprawę uszkodzeń. Szereg danych przez swoiste deacetylazy zwiększa stopień
wskazuje, że w trakcie naprawy DNA struktura kondensacji chromatyny (BROWN i współaut.
chromatyny ulega istotnym zmianom. Stwier- 2000, CHEN i współaut. 2001). Drugim czynni-
dzono na przykład, że dimery pirymidynowe kiem ułatwiającym wiązanie czynników tran-
usuwane są z DNA rdzenia nukleosomu z szyb- skrypcyjnych jest aktywnoS
ć kompleksów re-
koS
cią niezależną od ich położenia względem modelujących chromatynę. Kompleksy te
oktameru histonowego. Sugeruje to, że w trak- składają się z kilku-kilkunastu podjednostek, w
cie naprawy zachodzi rearanżacja struktury nu- ich skład wchodzą białka posiadające domenę
kleosomów (lub nawet ich całkowite usuwa- helikazy, a ich aktywnoS
ć zależna jest od hydro-
nie) (SMERDON 1991). lizy ATP. Efektem działania kompleksów remo-
Procesy, które ułatwiają oddziaływanie delujących chromatynę jest zwykle przemiesz-
białek naprawczych z uszkodzeniami mają czenie DNA względem oktameru histonowego
swoje analogie w znacznie lepiej poznanych (mechanizm ich działania nie jest jednak jasny)
mechanizmach regulujących aktywnoS
ć tran- (CALIKOWSKI 2001, FLAUS i OWEN-HUGHES
skrypcyjną chromatyny i ułatwiających wiąza- 2001). Zarówno acetylotransferazy (i deacety-
nie czynników transkrypcyjnych. Dwa spoS
ród lazy) histonów, jak i kompleksy remodelujące
wielu mechanizmów modyfikujących struktu- chromatynę swoiS
cie oddziałują z czynnikami
rę chromatyny wydają się mieć decydujące zna- transkrypcyjnymi, mając charakter aktywato-
Chromatyna a powstawanie i naprawa uszkodzeń DNA 9
rów (lub represorów) transkrypcji. Przykła- istotne w regionach regulujących aktywnoS
ć
dem mogą być oddziaływania acetylotransfe- genów. Tak więc mechanizmy rekonstytucji
raz z czynnikiem transkrypcyjnym E2F lub de- chromatyny muszą wydajnie współdziałać z
acetylaz z kompleksem białek pRB i E2F, regu- mechanizmami naprawy DNA. Zaobserwowa-
lujące aktywnoS
ć genów decydujących o wejS
- no, że jeS
li DNA plazmidowy zawierający
ciu komórek w fazę S cyklu komórkowego uszkodzenia indukowane przez promienio-
(HARBOUR i DEAN 2000). wanie UV inkubowany był z ekstraktami ko-
Wyniki badań prowadzonych w ostatnich mórkowymi, to naprawa uszkodzeń skorelo-
latach wskazują, że aktywnoS
ć acetylotransfe- wana była z upakowaniem plazmidu w nukle-
raz histonów i kompleksów remodelujących osomy. Taka rekonstytucja chromatyny prze-
chromatynę ma istotne znaczenie dla stymula- biegała jednoczeS
nie z syntezą naprawczą
cji naprawy DNA (przynajmniej w przypadku DNA i zależna była od kompleksu białkowego
mechanizmu NER). We wszystkich znanych CAF1 (ang. chromatin assembly factor 1),
kompleksach remodelujących chromatynę czynnika związanego z replikacją DNA
obecne są białka z rodziny SWI2/SNF2, ATP-azy (GAILLARD i współaut. 1996). Również inny
mające domenę strukturalną helikazy DNA. Do czynnik związany z replikacją, kompleks
rodziny SWI2/SNF2 należy również kilka białkowy RCAF (ang. replication-coupling as-
białek biorących udział w naprawie DNA: sembly factor), może brać udział rekonstytucji
Rad16 (mechanizm GG-NER u drożdży), nukleosomów na DNA zawierającym fotousz-
CSB/Rad26 (mechanizm TC-NER), Rad5 (na- kodzenia (TYLER i współaut. 1999). Mogłoby
prawa postreplikacyjna) i Rad54 (naprawa re- to sugerować, że rekonstytucja nukleosomów
kombinacyjna) (FYODOROV i KADONAGA na naprawianym DNA jest mechanicznie
2001). Stwierdzono, że białko CSB wykazuje związana z reperacyjną syntezą DNA. Jednak
zdolnoS
ć remodelowania struktury nukleoso- fakt, że w trakcie naprawy DNA rearanżacji
mów (CITTERIO i współaut. 2000). Z kolei na- ulega fragment chromatyny o długoS
ci nawet
prawa fotouszkodzeń obecnych w minichro- kilku tysięcy par nukleotydów, a nowosynte-
mosomach stymulowana była przez czynnik re- tyzowana nić DNA ma około 30 nukleotydów
modelujący chromatynę ACF (URA i współaut. (w przypadku NER), wskazuje na bardziej
2001). Jednym z czynników związanych z NER złożony związek miedzy naprawą a rekonsty-
jest białko XPE, składające się dwu podjedno- tucją chromosomów. Stwierdzono, że rekon-
stek p48 i p127. Białko to swoiS
cie wiążę się z stytucja nukleosomów w trakcie naprawy
DNA uszkodzonym przez promieniowanie UV DNA plazmidowego obejmuje kilka (4 do 6)
(inna jego nazwa to białko UV-DDB), a jego nukleosomów w obu kierunkach od uszko-
obecnoS
ć jest niezbędna dla naprawy chroma- dzenia. Co ciekawe, taką rekonstytucję nukle-
tyny, lecz nie  nagiego DNA. Stwierdzono, że osomów obserwowano nawet jeS
li reperacyj-
podjednostka p48 oddziałuje z acetylotransfe- na synteza DNA (lecz nie wczeS
niejsze etapy
razą histonów CBP/p300 (DATTA i współaut. naprawy) została zablokowana przez inhibi-
2001). Kolejną acetylotransferazą histonów tor polimerazy DNA (GAILLARD i współaut.
jest białko GCN5, wchodzące między innymi w 1997). Wskazuje to, że sygnałem dla rekonsty-
skład kompleksu transkrypcyjnego TFTC. In- tucji nukleosomów są poS
rednie produkty na-
nym składnikiem tego kompleksu jest białko prawy.
SAP130, wykazujące bardzo silną homologię z Mechanizm NER jest w obecnej chwili naj-
podjednostką p127 białka UV-DDB. Stwierdzo- lepiej zbadanym mechanizmem naprawy DNA.
no, że czynnik TFTC preferencyjnie wiąże się z Najlepiej znane są również zmiany struktury
chromatyną uszkodzoną przez promieniowa- chromatyny towarzyszące temu rodzajowi na-
nie UV i katalizuje acetylację histonów w miej- prawy (Ryc. 1). Można przypuszczać, że podob-
scu uszkodzenia (BRAND i współaut. 2001). ne zmiany, to jest rearanżacja struktury nukle-
CzęS
ć  instrukcji o sposobie ekspresji in- somów ułatwiająca dostęp białek naprawczych
formacji genetycznej zawarta jest w struktu- do uszkodzenia i kończące naprawę odtworze-
rze chromatyny. Toteż naprawa DNA, poza nie struktury chromatyny, towarzyszą również
przywróceniem prawidłowej struktury i se- innym mechanizmom naprawy DNA. Przykład-
kwencji nukleotydów, musi pozwalać na od- owo, aktywnoS
ć kompleksu RCAF niezbędna
tworzenie pierwotnej struktury chromatyny jest dla naprawy pęknięć nici DNA (TYLER i
w miejscu uszkodzenia. Precyzyjne odtworze- współaut. 1999).
nie struktury nukleosomów jest szczególnie
10 PIOTR WIDŁAK
STRUKTURA CHROMATYNY A ROZPOZNANIE USZKODZEŃ DNA
Rozpoznanie uszkodzenia jest pierwszym Detektorami rozpoznającymi takie zmiany
etapem wszystkich mechanizmów naprawy struktury DNA są kompleksy XPC/HR23B i
DNA. Biorą w nim udział swoiste białka detek- XPA/RPA, związane z mechanizmem NER. Na-
torowe. Podobne detektory uszkodzeń rozpo- tomiast dwuniciowe pęknięcia DNA rozpozna-
czynają również szlaki przekazywania sygnału wane są przez dimer Ku70/Ku86, podjednost-
prowadzącego do blokady cyklu komórkowe- kę kinazy białkowej zależnej od DNA
go czy indukcji apoptozy. Białka naprawcze (DNA-PK), które to białko bierze udział w me-
rozpoznające uszkodzenia mają dwojaki cha- chanizmie łączenia końców niehomologicz-
rakter. CzęS
ć z nich jest enzymami, dla których nych (NHEJ) (WOOD 1999, WIDŁAK 2000).
uszkodzony nukleotyd jest swoistym substra- Chociaż oddziaływania białek detektoro-
tem (na przykład glikozylazy DNA związane z wych z uszkodzonym DNA są doS
ć dobrze po-
mechanizmem BER). Inne białka detektorowe znane, to wiedza na temat rozpoznawania tych
rozpoznają nie tyle zmianę struktury chemicz- samych uszkodzeń znajdujących się w S
rodowi-
nej nukleotydu, co wywołane przez uszkodze- sku chromatyny jest bardzo ograniczona. Mię-
nia zaburzenia dwuniciowej struktury DNA. dzy innymi nie jest w pełni jasne, czy rozpozna-
nie uszkodzeń obecnych w chromatynie wyma-
ga dodatkowych białek (takim czynnikiem
1.
1. wspomagającym mogłoby być w przypadku me-
chanizmu NER białko UV-DDB). Nie wiadomo
również czy (i do jakiego stopnia) sygnałem dla
białek detektorowych są zmiany struktury chro-
DDB
DDB
DDB
DDB
2.
2.
matyny wywołane uszkodzeniem DNA. Takie
zmiany w strukturze chromatyny poznane są
najlepiej w przypadku dwuniciowych pęknięć
HAT
HAT
HAT
DNA. W laboratorium W. Bonnera zaobserwo-
DDB
DDB
DDB
DDB
3.
3.
wano, że w ciągu kilku minut od powstania pęk-
nięć DNA, indukowanych przez promieniowa-
nie jonizujące (ale również powstających w
4.
4. trakcie apoptozy lub rekombinacji V(D)J), do-
chodzi do lokalnej fosforylacji histonu H2AX
(jeden z wariantów histonu H2A). Taka fosfory-
lacja katalizowana jest przez serynowo/treoni-
5.
5.
nowe kinazy białkowe z rodziny ATM  białka
pol DNA
pol DNA
pol DNA
pol DNA
DNA-PK, ATM lub ATR i może prowadzić do
zmian w strukturze nukleosomów. W ciągu kil-
CAF1
CAF1
CAF1
kudziesięciu minut od powstania dwunicio-
6.
6.
pol DNA
pol DNA
pol DNA
pol DNA wych pęknięć DNA fosforylację histonu H2AX
obserwuje się w obszarach chromatyny obej-
mujących nawet milion par nukleotydów
7.
7. wokół uszkodzenia, tworzących widoczne w
mikroskopie foci. W domenach chromatyny, za-
Ryc. 1. Hipotetyczne zmiany struktury chromaty-
wierających ufosforylowany histon H2AX, ob-
ny związane z naprawą przez wycinanie nukle-
serwuje się następnie nagromadzenie szeregu
otydu (NER).
białek związanych mechanizmami rekombina-
Kolejne etapy naprawy: 1) powstanie uszkodzenia
cyjnej naprawy pęknięć DNA: BRCA1, Rad51,
(biały romb); 2) rozpoznanie uszkodzenia przez
Rad50, Mre11, Nbs1 (MODESTI i KAANAR 2001).
białko DDB; 3) rozlux
nienie struktury włókna nukle-
Można więc spekulować, że sygnałem rozpo-
osomowego (np. dzięki acetylacji histonów); 4) utwo-
znawanym przez te białka są zmiany struktury
rzenie kompleksu naprawczego, zmiana struktury
(lub usunięcie) nukleosomu zawierającego uszkodze- nukleosomów inicjowane przez fosforylację hi-
nie (biały owal); 5) usunięcie fragmentu uszkodzonej
stonu H2AX. Co ciekawe, dane biochemiczne
nici DNA, reperacyjna synteza DNA; 6) rekonstytucja
wskazują, że białka które nagromadzają się w
nukleosomu na nowosyntetyzowanym DNA (ciemny
domenach zawierających ufosforylowany hi-
owal); 7) odtworzenie struktury włókna nukleosomo-
ston H2AX (ATM, BRCA1, Rad51, Rad50, Mre11,
wego.
Chromatyna a powstawanie i naprawa uszkodzeń DNA 11
Nbs1) tworzą wraz z innymi białkami napraw- mi sekwencjami zawierającymi uszkodzenia in-
czymi (BLM, MSH2, MSH6, MLH1) olbrzymie dukowane przez cis-platynę (WIDŁAK 2000).
kompleksy białkowe, tak zwany BRCA1-associ- Cis-platyna jest związkiem genotoksycznym wy-
ated genome surveillance complex (BASC) korzystywanym w terapii przeciwnowotworo-
(WANG i współaut. 2000). Białkiem wiążącym wej, który indukuje w DNA między- i wewnątrz-
się z dwuniciowymi pęknięciami DNA jest hete- niciowe wiązania sieciujące. Zaobserwowano,
rodimer Ku. Stwierdzono, że białko Ku wiąże że dwie grupy białek chromatyny: białka
się z białkiem Sir3, które wraz z białkami Sir2 i HMG-1/2 i histon H1 wykazują bardzo silne po-
Sir4 tworzy kompleksy oddziałujące z histona- winowactwo do tych fragmentów DNA, któ-
mi w gęsto upakowanej heterochromatynie rych struktura została zmieniona przez takie
(Sir2 jest deacetylazą histonów). Rezerwuarem wiązania sieciujące. Stwierdzono również, że
kompleksów Ku i Sir są telomery i regiony sub- HMG-1 (i inne białka z tej rodziny) mogą hamo-
telomerowe chromosomów. Zaobserwowano, wać naprawę DNA uszkodzonego przez cis-pla-
że w wyniku powstania dwuniciowych pęknięć tynę. Na podstawie takich obserwacji zapropo-
DNA dochodzi do przemieszczenia tych białek z nowana została hipoteza opisująca wpływ
obszarów telomerowych w miejsce uszkodzeń i białek chromatyny na wrażliwoS
ć komórek na
formowanie heterochromatyny w regione za- cis-platynę. Zgodnie z tą hipotezą (ang. repair-
wierającym uszkodzenie (HABER 1999). Znacze- shielding model), białka chromatyny mogą
nie tego zjawiska dla procesów naprawy DNA współzawodniczyć z białkami naprawczymi w
nie jest jasne. Można jednak spekulować, że wiązaniu uszkodzonego DNA. Po związaniu
tworzenie struktury heterochromatyny w re- białka HMG uszkodzony fragment DNA nie
gionie pęknięcia DNA jest czynnikiem uniemo- byłby rozpoznawany przez białka naprawcze,
żliwiającym transkrypcję uszkodzonych genów. co powodowałoby opóx
nienie lub uniemożli-
Odrębnym zagadnieniem jest wiązanie z wienie jego naprawy (ZAMBLE i LIPPARD 1995).
uszkodzonym DNA białek nie biorących udziału Ponieważ białka HMG-1/2 mają podwyższone
w naprawie: białek chromatyny i czynników powinowactwo również do innych typów
transkrypcyjnych. Powstanie uszkodzeń DNA w uszkodzeń DNA (fotouszkodzenia lub addukty
obrębie sekwencji rozpoznawanych przez indukowane przez policykliczne węglowodory
czynniki transkrypcyjne zwykle blokuje wiąza- aromatyczne), zaproponowany model ma bar-
nie tych czynników (TOMMASI i współaut. dziej uniwersalny charakter i może być roz-
1996). Jednak obecnoS
ć niektórych uszkodzeń ciągnięty na wiele typów uszkodzeń DNA
indukuje wiązanie czynników transkrypcyj- (WIDŁAK 2000). Hipotetycznie, związanie z
nych do przypadkowych sekwencji DNA. uszkodzonym DNA czynników transkrypcyj-
Przykładem może być czynnik transkrypcyjny nych, białek HMG czy histonu H1 mogłoby mieć
Sp1, wiążący się z nieswoistymi sekwencjami przeciwny efekt. Białka te wiążąc się z uszkodze-
zawierającymi addukty indukowane przez ben- niem mogłyby wymuszać przesunięcie uszko-
zo(a)pyren, lub czynniki transkrypcyjne zawie- dzonego fragmentu do DNA łącznikowego,
rające domenę HMG, wiążące się z nieswoisty- przyczyniając się do jego szybszej naprawy.
CHROMATIN STRUCTURE AND DNA REPAIR
S u mma r y
Chromatin structure modulates the rate of DNA tion of nucleosomes is required to recover primary
damage formation and repair in different regions of chromatin structure. Such chromatin assembly is cou-
eukaryotic genomes. Chromatin rearrangement takes pled to repair DNA synthesis. DNA damages induce
place during repair to increase accessibility of damage some modifications to chromatin structure (e.g.
to repair proteins. Activity of histone acetyl- phosphorylation of a histone H2A variant in response
transferases and chromatin remodeling complexes to DNA double-strand breaks). Such chromatin modifi-
seems to be essential for nucleosome rearrangement cations may serve as signals recognized by DNA repair
during repair. Once repair is completed, reconstitu- systems.
LITERATURA
ALFS J. D., KINGSTON R. E., 2000. What does :  chromatin BOHR V. A., 1991. Gene specific DNA repair. Carcinoge-
remodeling mean. Trends Bioch. Sci. 25, nesis 12, 1983 1992.
548 555.
12 PIOTR WIDŁAK
BRAND M., MOGGS J. G., OULAD-ABDELGHANI M., LEKEUNE MODESTI M., KAANAR R., 2001. DNA repair: spot(light)s
F., DILWORTH F. J., STEVENIN J., ALMOUZNI G., TORA L., on chromatin. Curr. Biol. 11, R229 R232.
2001. UV-damaged DNA-binding protein in the MULLENDERS L. H. F., VENEMA J., VAN HOFFEN A., MAYNE L.
TFTC complex links DNA damage recognition to V., NATARAJAN A. T. VAN ZEELAND A. A., 1990. The
nucleosome acetylation. EMBO J. 20, 3187 3196. role of the nuclear matrix in DNA repair. [W:] Mu-
BROWN C. E., LECHNER T., HOWE L., WORKMAN J. L., 2000. tation and the Environment, part A, Wiley-Liss,
The many HATs of transcription coactivators. Inc., 223 232.
Trends Bioch. Sci. 25, 15 19. PIETRZYKOWSKA I., KRWAWICZ J., 1999. Mechanizmy na-
CALIKOWSKI T. T., 2001. Przebudowa struktur chroma- prawy DNA u bakterii i człowieka. Kosmos 48,
tynowych przez kompleksy wielobiałkowe. Post. 315 328.
Biochem. 47, 129 137. SMERDON M. J, 1991. DNA repair and the role of chro-
CITTERIO E., VAN DEN BOOM V., SCHNITZLER G., KAANAR R., matin structure. Curr. Opin. Cell Biol. 3, 422 428.
BONTE E., KINGSTON R. E., HOEIJMAKERS J. H. J., TOMMASI S., SWIDERSKI P. M., TU Y., KAPLAN B. E., PFEIFER
VERMEULEN W., 2000. ATP-dependent chromatin G. P., 1996. Inhibition of transcription factor bin-
remodeling by the Cockayne syndrome B DNA re- ding by ultraviolet-induced pyrimidine dimers.
pair-transcription-coupling factor. Mol. Cell. Biol. Biochemistry 35, 15693 15703.
20, 7643 7653. TORNALETTI S., PFEIFER G. P., 1995. UV light as a foot-
CHEN H., TINI M., EVANS R. M., 2001. HATs on and bey- printing agent: modulation of UV-induced DNA
ond chromatin. Curr. Opin. Cell Biol. 13, 218 224. damage by transcription factors bound at the pro-
DATTA A., BAGCHI S., NAG A., SHIYANOV P., ADAMI G. R., moters of three human genes. J. Mol. Biol. 249,
YOON T., RAYCHAUDHURI P., 2001. The p48 subunit 714 728.
of the damaged-DNA binding protein DDB asso- TRZECIAK A., BŁASIAK J., 1999. Naprawa DNA w komór-
ciates with the CBP/p300 family of histone acetyl- kach ssaków. Post. Biol. Kom. 26, 707 729.
transferases. Mutat. Res. 486, 89 97. TUDEK B., 1999. Mechanizmy naprawy utlenionych
DENISSENKO M. F., PAO A., PFEIFER G. P., TANG M., 1998. zasad DNA. Kosmos 48, 339 352.
Slow repair of bulky DNA adducts along the non- TYLER J. K., ADAMS C. R., CHEN S. R., KOBAYASHI R.,
transcribed strand of the human p53 gene may KAMAKAKA R. T., KADONAGA J. T., 1999. The RCAF
explain the strand bias of transversion mutations complex mediates chromatin assembly during
in cancers. Oncogene 16, 1241 1247. DNA replication and repair. Nature 402, 555 560.
FLAUS A., OWEN-HUGHES T., 2001. Mechanism for URA K., ARAKI M., SAEKI H., MASUTANI C., ITO T., IWAI S.,
ATP-dependent chromatin remodelling. Curr. MIZUKOSHI T., KANEDA Y., HANAOKA F., 2001. ATP-de-
Opin. Gen. Devel. 11, 148 154. pendent chromatin remodeling facilitates nucleo-
FYODOROV D. V., KADONAGA J. T., 2001. The many faces tide excision repair of UV-induced DNA lesions in
of chromatin remodeling: SWItching beyond synthetic dinucleosomes. EMBO J. 20, 2004 2014.
transcription. Cell 106, 523 525. WANG Y., CORTEZ D., YAZDI P., NEFF N., ELLEDGE S.J., QIN
GAILLARD P. H. L., MARINI E. M. D., KAUFMAN P. D., J., 2000. BASC, a super complex of BRCA1-associ-
STILLMAN B., MOUSTACCHI E., ALMOUZNI G., 1996. ated proteins involved in the recognition and re-
Chromatin assembly coupled to DNA repair: a pair of abberant DNA structures. Genes Dev. 14,
new role for chromatin assembly factor 1. Cell 86, 927 939.
887 896. WIDŁAK P., 1994. Specyfika powstawania i naprawy
GAILLARD P. H. L., MOGGS J. G., ROCHE D. M. J., QUIVY J. P., mutagennych uszkodzeń materiału genetyczne-
BECKER P. B., ALMOUZNI G., 1997. Initiation and bi- go. Post. Bioch. 40, 194 199.
directional propagation of chromatin assembly WIDŁAK P., 1997. Struktura nukleosomowa chromaty-
from a target site for nucleotide excision repair. ny a naprawa DNA. Post. Biol. Kom. 24, 325 337.
EMBO J. 16, 6281 6289. WIDŁAK P., 2000. Białka rozpoznające i wiążące się z
GAO S., DROUIN R., HOLMQUIST G. P., 1994. DNA repair uszkodzonym DNA; udział w mechanizmach na-
rates mapped along the human PGK1 gene at nuc- prawy DNA i kancerogenezie. Post. Bioch. 46,
leotide resolution. Science 263, 1438 1440. 198 206.
HABER J. E., 1999. Sir-Ku-itous routes to make ends WOOD R. D., 1999. DNA damage recognition during
meet. Cell 97, 829 832. nucleotide excision repair in mammalian cells.
HARBOUR J. W., DEAN D. C., 2000. Chromatin remode- Biochimie 81, 39 44.
ling and Rb activity. Curr. Opin. Cell Biol. 12, WOODCOCK C. L., DIMITROV S., 2001. Higher-order struc-
685 689. ture of chromatin and chromosomes. Curr. Opin.
HAYES J. J., HANSEN J. C., 2001. Nucleosomes and the Gen. Devel. 11, 130 135.
chromatin fiber. Curr. Opin. Gen. Devel. 11, WU J., GRUNSTEIN M., 2000. 25 years after the nucleoso-
124 129. me model: chromatin modifications. Trends
KAMIUCHI S., SAIJO M., CITTERIO E., DE JAGER M., Bioch. Sci. 25, 619 623.
HOEIJMAKERS J. H., TANAKA K., 2002. Translocation ZAMBLE D. B., LIPPARD S. J., 1995. Cisplatin and DNA re-
of Cockayne syndrome group A protein to the nuc- pair in cancer chemotherapy. Trends Bioch. Sci.
lear matrix: possible relevance to transcrip- 20, 435 439.
tion-coupled DNA repair. Proc. Natl. Acad. Sci. USA ZDZIENICKA M. Z., 1999. Mechanizm naprawy podwój-
99, 201 206. nych pęknięć DNA (DSB) w komórkach ssaków:
KORNBERG R. D. 1999. Eukaryotic transcriptional con- podstawy molekularne i konsekwencje biologicz-
trol. Trends Bioch. Sci. 24, M46 M49. ne. Kosmos 48, 359 365.