ANALIZA USZKODZEC
DNA
Kwiecień, 2015
E. Ignatowicz;
[e-mail]
Przyczyny uszkodzeń DNA endogenne: błędy replikacji, reaktywne formy tlenu
(z
ródła RFT w warunkach fizjologicznych i patologicznych)
Egzogenne: RFT pojawiające się w wyniku metabolizmu ksenobiotyków
(jakich?), ekspozycji na promieniowanie jonizujące i UV, tworzenie dimerów
pirymidynowych
Skutki działania RFT na kwasy nukleinowe: utlenianie zasad, tlenowa
deaminacja, przerwy pojedynczej/podwójnej nici, miejsca
apurynowe/apirymidynowe, wiązania krzyżowe, addukty DNA z produktami
peroksydacji lipidów
Uszkodzenia wynikające z działania interkalujacych związków chemicznych
(jakich?), toksyn roślinnych (psoralenów), toksyn środowiskowych.
Chemioterapia: leki alkilujÄ…ce, antymetabolity.
Działanie policyklicznych węglowodorów aromatycznych na DNA  ten temat
można powiązać z analizą adduktów metodą 32P  postlabelingu.
USZKODZENIA DNA: MODYFIKACJA ZASAD
" I. POJEDYNCZE ZASADY
" A. Deaminacja cytozyny do uracylu
" B. Deaminacja adeniny do hipoksantyny
" C. Alkilacja
" D. Insercja lub delecja nukleotydu
" E. Inkorporacja analogu zasady
" F. Depurynacja
" II. DWIE ZASADY
" A. Indukowane światłem UV tworzenie dimerów
tyminy
" B. Tworzenie wiązań krzyżowych
USZKODZENIA DNA: MODYFIKACJE
A
AC
CUCHA
" III. PRZERWY POJEDYNCZEJ/PODWÓJNEJ NICI
" A. Promieniowanie jonizujÄ…ce
" B. Reaktywne formy tlenu
" IV. WI
ZANIA KRZYŻOWE
" A. Pomiędzy zasadami w tym samym łańcuchu lub
łańcuchu dopełniającym
" B. Pomiędzy DNA i białkami, np. histonami
 ENDOGENNE CZYNNIKI TWORZ
CE
WI
ZANIA KRZYŻOWE W DNA
" KWAS AZOTAWY POWSTAJE W
ŻOA
ADKU Z PRODUKTÓW
SPOŻYWCZYCH
" PRODUKTY PEROKSYDACJI LIPIDÓW
(MDA) ETENOADDUKTY
" HCHO (wiązania krzyżowe DNA-białko i
białko-białko)
POÅšREDNIE I BEZPOÅšREDNIE ODDZIAA
YWANIE RFT Z DNA
PROMIENIOWANIE KSENOBIOTYKI INFEKCJE AUTOUTLENIENIE
.
OH
PUFA
TOKSYCZNE ALDEHYDY
TLENOWE MODYFIKACJE
ADDUKTY
DNA
ZASAD
.
OH
PROMIENIOWANIE KSENOBIOTYKI INFEKCJE
POWSTANIE MIEJSCA APURYNOWEGO
Uszkodzenie DNA =/= mutacja
" Uszkodzenia mogÄ… ulec naprawie
(względem komplementarnej nici lub
homologicznego chromosomu)
" Mutacja  zmiana w sekwencji w obu
niciach; nie rozpoznanie przez enzymy
naprawcze.
Uszkodzenia DNA a mutacje
Naprawa uszkodzeń DNA  krótkie przypomnienie wiadomości z biochemii
(BER, NER, MMR, NHEJ, & )
Odpowiedz
komórek na uszkodzenia DNA
Cykl komórkowy, punkty kontrolne - krótkie przypomnienie wiadomości z biochemii
NAPRAWA USZKODZONEGO DNA
" Bezpośrednie  odwrócenie uszkodzenia 
nie jest wymagana matryca, nie zachodzi
przerwanie pojedynczej nici:
 Tworzenie dimerów tyminy pod wpływem UV 
dodatkowe wiązania kowalencyjne pomiędzy
sÄ…siednimi T  fotoreaktywacja przy udziale
fotoliazy (aktywność zależna od absorpcji światła
300-600 nm)
 Metylacja guaniny odwracana przez aktywność
MGMT (metylotransferaza), reakcja
stechiometryczna a nie katalityczna, 1 czÄ…steczka
MGMT może być użyta 1x); MGMT jest
indukowana przez niskie dawki czynników
alkilujacych, warunkuje oporność komórek
nowotworowych na chemioterapiÄ™
NAPRAWA USZKODZONEGO DNA
" UÅ‚atwiona gdy dojdzie do odwracalnego zahamowania cyklu
komórkowego
" Naprawa chemiczna: brak przerwania pojedynczej nici
(naprawa dimerów tyminy, zmetylowanej guaniny)
" Naprawa enzymatyczna: pojawienie siÄ™ utlenionych zasad,
adduktów, przerwy w pojedynczej lub podwójnej nici
enzymy naprawcze rozpoznajÄ… i naprawiajÄ… zmiany poprzez :
1. Wycinanie zasad (BER)
2. Wycinanie nukleotydów (NER)
3. Naprawa błędnie sparowanych zasad (MMR)
4. Naprawa przez łączenie niehomologicznych końców DNA
(NHEJ)
5. Naprawa przez łączenie mikrohomologicznych końców DNA
(MMEJ)
6. Rekombinacja homologiczna (HR)
BER
1.Wycinanie zasad (BER)
-dotyczy pojedynczej zasady
uszkodzonej przez alkilacjÄ™,
utlenianie, hydrolizÄ™,
deaminacjÄ™
-naprawa etenoadduktów: 1,N6-
etenoadeniny,
3,N4-etenocytozyny, N2,3-
etenoguaniny
- wiÄ…zanie N-glikozydowe
między deoksyrybozą a
zmienionÄ… zasadÄ… rozcinane
przez glikozydazy
monofunkcyjne = powstanie
miejsc AP
NER
2. Wycinanie nukleotydów
(NER)
-dotyczy adduktów
objętościowych, uszkodzeń
zakłócających podwójną
spiralę: dimerów
pirymidynowych,
fotoproduktów
-pierwszy etap- wycięcie
segmentu 12 nukleotydów
wraz z uszkodzonymi
-brakujÄ…cy fragment-
syntetyzowany przez
polimerazÄ™ DNA I
-następnie ligaza DNA łączy
łańcuchy
MMR
3. Naprawa błędnie sparowanych zasad
(MMR)
-koryguje błędy replikacji i rekombinacji DNA
wynikajÄ…ce z tautomerii zasad
-odrębne enzymy identyfikują pojedyncze błędne
zasady i krótkie insercje/delecje oraz defekty
obejmujÄ…ce wiele zasad
-enzymy MMR współpracują z mechanizmami kontroli
cyklu komórkowego w G2 i regulatorami apoptozy
NHEJ
4. Naprawa przez Å‚Ä…czenie
niehomologicznych końców
DNA (NHEJ)
-ważny przed replikacją DNA,
aktywny w G0/G1 i we
wczesnej fazie S
-na przerwane końce działa
ligaza DNA IV
-wymaga obecnośći białka Ku i
zależnej od DNA kinazy
białkowej
-dokładność tego procesu
zapewniają krótkie sekwencje
mikrohomologiczne obecne
na końcach pojedynczych
nici, ulegające połączeniu
MMEJ
5. Naprawa przez Å‚Ä…czenie mikrohomologicznych
końców DNA (MMEJ)
-istotne znaczenie  mikrohomologiczne sekwencje 5-
25 pz usytuowane wzdłuż pękniętych nici przed
połączeniem
-nie wymaga obecności białka Ku i zależnej od DNA
kinazy białkowej
-zachodzi w fazie S cyklu komórkowego
-błędy mechanizmy przyczyną delecji (podobnie jak w
NHEJ)
HR
6. Rekombinacja homologiczna (HR)
-wymiana sekwencji nukleotydów pomiędzy
identycznymi lub podobnymi czÄ…steczkami DNA
-podczas mejozy=HR jest czynnikiem zróżnicowania
genetycznego  crossing over
-w komórkach dzielących się =nie tworzy produktu
 crossing over
Wywołanie biologicznych następstw uszkodzeń DNA i
schemat naprawy
naprawa enzymatyczna
naprawa chemiczna
uszkodzenie
DNA ¾ð®ð DNA* ¾ð®ð DNA* ¾ð®ð biologiczne nastÄ™pstwa uszkodzeÅ„ DNA
błędna naprawa uszkodzeń
naprawa
enzymatyczna
DNA**
DNA* - cząsteczka uszkodzona, DNA** - cząsteczka błędnie naprawiona
ODPOWIEDy
KOMÓREK NA USZKODZENIA DNA
bodz
ce kompleks
onkogenne p19(ARF) mdm2-p19(ARF) stabilizacja
¾ð p53
Odpowiedz
komórki na
mdm2
uszkodzenie p53 p53 degradacja p53
uszkodzenia DNA
DNA
ub ub ub
p21(Cip1)
apoptoza
zatrzymanie cyklu
Rola białka p53:
komórkowego
" jest kluczowym regulatorem cyklu komórkowego
" aktywność biologiczną wykazuje tetramer ufosforylowany, który rozpoznaje
ściśle określoną sekwencję DNA czyli zachowuje się jak czynnik
transkrypcyjny
" pod koniec fazy G 1 ilość białka P53 rośnie
" przedostaje się do jądra komórkowego
" gdy w DNA pojawia się uszkodzenie ilość P53 w jądrze rośnie powodując
zatrzymanie cyklu komórkowego
" produkt genu p53 włącza mechanizmy zależne od kinaz z rodziny ATM i
ATR
(na etapie G1/S i G2/M)
TECHNIKI ANALITYCZNE SA
UÅ»
CE DO OCENY
USZKODZEC
DNA
" Elektroforeza kometkowa
" GC/MS
32
" P-postlabeling
" Zsynchronizowana spektrofotometria
fluorescencyjna
ELEKTROFOREZA KOMETKOWA
GC/MS
" Kolumna kapilarna wypełniona nośnikiem, stały przepływ gazu, który
nie reaguje z nałożoną próbką (argon, hel, wodór, azot)
" Spektrometria mas (MS): cząsteczki naładowane elektrycznie
przechodzą przez pole magnetyczne  rozpad naładowanych
cząsteczek i identyfikacja fragmentów obciążonych ładunkiem,
identyfikacja całej cząsteczki  poskładanej z fragmentów
" Próbka do analizy MS musi mieć postać gazu (waporyzacja); w
komorze jonizacyjnej czÄ…steczki rozpadajÄ… siÄ™ na jony w kolizji z
elektronami (M+ lub M+.); każdy jon indywidualnie wchodzi do
akceleratora. Wszystkie jony majÄ… te samÄ… energiÄ™ kinetycznÄ….
Określone napięcie powoduje przejście tylko jednego naładowanego
fragmentu do detektora
" Zderzenie jonu z powierzchniÄ… detektora wybija elektrony
(fotopowielacz  wzmocnienie Å‚adunku)
" Elektrony wychwytywane w kolektorze  pomiar Å‚adunku
" Masa proporcjonalna do wykrytego Å‚adunku: m/z
" Wykres widma masowego: każdy pik odzwierciedla inny fragment
struktury cząsteczki; cząsteczka w całości  największa masa widma
(jon molekularny;  masa macierzysta )
" Ograniczenia metody: zdolność rozdzielcza detektora
32
P-POSTLABELING: WYKRYWANIE ADDUKTÓW,
np. kancerogen-DNA
Policykliczne węglowodory
aromatyczne sÄ… kancerogenne po
aktywacji metabolicznej, która może
prowadzić do powstawania
adduktów  produktów interakcji
metabolitów chemicznych
kancerogenów z DNA.
Addukty kancerogen - DNA uważane
sÄ… za krytyczne uszkodzenia
decydujÄ…ce o inicjacji procesu
nowotworowego.
W badaniach in vitro lub na zwierzętach możliwe jest
zastosowanie kancerogenów znakowanych izotopami (tryt)
32
P-POSTLABELING
Hydroliza Mikrokokalna nukleaza
enzymatyczna fosfodiesteraza II
Np(m5Cp+Cp+Tp+Ap+Gp)+G*p+A*p
" Wyizolowany DNA jest
hydrolizowany
Nukleaza P1
enzymatycznie do
N+pi+G*p+A*p
nukleotydów
Nukleaza P1 rozkłada
niezmodyfikowane
nukleotydy
32
P-labeling
Znakowanie 32P
pozostałych
nukleotydów w pozycji
5`
32
P-G*p+32P-A*p
Chromatografia TLC
Autoradiografia
Rozdział chromatograficzny
ZSYNCHRONIZOWANA SPEKTROFOTOMETRIA
FLUORESCENCYJNA
Pomiar zsynchronizowanej
spektrofotometrii
fluorescencyjnej 
rejestrowanie widma
fluorescencyjnego przy
zmiennej długości fali
wzbudzenia i emisji, ale
przy utrzymywaniu stałej
różnicy między tymi
wartościami "=34 nm
a  wzorcowe addukty
DNA:kancerogeny
b  DNA izolowane z próby
badanej
Techniki immunologiczne
RIA (klasyczna technika radioimmunologiczna), ELISA
" Wykorzystuje się fakt, że modyfikacje DNA wywołane
kancerogenem powodują wzrost jego immunogenności
(prawidłowe kwasy nukleinowe posiadają słabe
właściwości immunogenne)
" Za pomocą technik immunologicznych można wykryć 1
addukt/107 -108 nukleotydów
" Ograniczenie metody wiąże się z faktem dysponowania
specyficznymi przeciwciałami do określonych adduktów.