USZKODZENIA DNA
1. Uszkodzenia DNA:
a) PowstajÄ… podczas replikacji, jak i po niej
b) Zwykle dotyczą struktury I-rzędowej i polegają na chemicznej modyfikacji
zasad powstają nietypowe wiązania kowalencyjne ad dukty (połączenia
zasad z ksenobiotykami i produktami metabolizmu) zakłócenie regularnej
budowy helisy
2. Uszkodzenie to nie mutacja!
a) Uszkodzenie może być usunięte, jeśli jest dostępna informacja o
prawidłowej sekwencji zasad (komplementarna nić / homologiczny
chromosom)
b) Jeśli replikacja zajedzie przed podziałem komórki włączenie
nieprawidłowej zasady naprzeciw uszkodzonej dziedziczenie, które
powoduje, że nie można odtworzyć oryginalnej sekwencji,
nierozpoznawane przez enzymy naprawcze zmiany struktury i
funkcjonowania białek zdolność przeżycia i proliferacji
c) Mutacje mogą być korzystne lub zwiększać prawdopodobieństwo
kancerogenezy
3. Przyczyny uszkodzeń DNA:
a) endogenne:
·ð bÅ‚Ä™dy w replikacji (niedokÅ‚adne dziaÅ‚anie polimerazy DNA)
·ð reakcje oksydacyjne wywoÅ‚ane przez RFT
b) egzogenne:
·ð chemiczne (ksenobiotyki, zanieczyszczenia)
·ð fizyczne (wysoka temperatura, promieniowanie)
·ð biologiczne (wirusy)
c) najczęstsze uszkodzenia:
·ð wÅ‚Ä…czenie nieprawidÅ‚owego nukleotydu
·ð chemiczne modyfikacje zasad
·ð pÄ™kniÄ™cia jednej lub obu nici
·ð wytwarzanie nieprawidÅ‚owych wiÄ…zaÅ„ pomiÄ™dzy Å‚aÅ„cuchami
·ð tworzenie addkuktów
4. y
ródła RFT:
a) w procesie zapalnym:
·ð aktywność makrofagów i granulocytów obojÄ™tnochÅ‚onnych
·ð pod wpÅ‚ywem COX
b) w procesie niedotlenienia/reperfuzji:
c) promieniowanie jonizujÄ…ce i UV:
·ð radioliza wody Ä…ð RFT
5. UTLENIANIE:
1. czynniki = RFT oraz metabolizm ksenobiotyków (np. nitrozoamin,
parakwatu)
2. skutki:
Wojtek NaFarmacji, Anno Domini 2014
a) utlenienie zasad azotowych
b) utlenienie reszt cukrowych
c) rozerwanie wiązań fosfodiestrowych (nici)
d) tworzenie wiązań krzyżowych z oboma łańcuchami DNA/chromatyną
3. utlenianie zasad azotowych:
·ð najczęściej deaminacja (cytozyna do uracylu, ademina do
hipoksantyny)
·ð wywoÅ‚ywane mutacje  transwersje, tranzycje, np. 8-hydroksyguanina
powoduje zmianÄ™ G Ä…ð T w genie p53
o 8-hydroksyadenina A do G
o 2-hydroksyadenina A do T, C, G
o 8-hydroksyguanina G do T
o 5-hydroksyguanina C do T, G
4. powstawanie AP-miejsca purynowego/pirymidynowego:
·ð hydroliza wiÄ…zania ²-N-glikozydowego Ä…ð usuniÄ™cie zasady
·ð pÄ™kniÄ™cie pojedynczej nici DNA
·ð może być przyczynÄ… mutacji wideÅ‚ki replikacyjne zatrzymujÄ… siÄ™,
naprzeciw AP włączana jest adenina
·ð powstaje spontanicznie lub jako stan przejÅ›ciowy BER
5. peroksydacja lipidów:
a) dotyczny lipidów zawierających nienasycone kwasy tłuszczowe
·ð powstajÄ… toksyczne aldehydy (di aldehyd malonowy, aldehyd
krotonowy, akroleina, trans-4-hydroksy-2-nonenal), które są utleniane
dalej do epoksydów przez hydronadtlenki i nadtlenek wodoru
·ð te z kolei wiążą siÄ™ kowalencyjnie z DNA Ä…ð etenoaddukty i
propanoaddukty  pochodne z pięcio-/sześcioczłonowymi
dodatkowymi pierścieniami przy grupie aminowej (mogą one powstać
również w wyniku działania chlorku winylu i uretanu)
·ð blokada polimerazy DNA
·ð mutacje punktowe, np. transwersja A Ä…ð T (w Ras, p53)
·ð podwyższony poziom ETENOADDUKTÓW może być również
spowodowany:
- ekspozycjÄ… na kancerogenne metabolity
- dietÄ… bogatÄ… w NKT (szeregu omega 6)
- chorobami zapalnymi (NLPZ spełniają rolę chemoprewencyjną,
hamujÄ…c kancerogenezÄ™; podobna funkcja diety bogatej w
antyoksydanty: karotenoidy, tokoferole, Wit. C, polifenole)
- nieprawidłowym spichrzaniem metali (hemochromatoza, choroba
Wilsona)
6. Ekspozycja na UVB
a) Tworzą się wiązania krzyżowe pomiędzy sąsiednimi resztami
cytozyny i/lub tyminy dimery pirymidynowe
Wojtek NaFarmacji, Anno Domini 2014
b) Dimery zatrzymujÄ… replikacjÄ™ przestrzennie nie dopasowujÄ… siÄ™ do
helisy DNA
c) Ponadto transwersja CC -> TT (gł. W nowotworach skóry)
7. Czynniki chemiczne, będące przyczynami uszkodzeń DNA: PWA,
formaldehyd, chlorek winylu, nitrozaminy, akroleina, kwas azotowy
8. Psolareny (roślinne furanokumaryny)  po aktywacji światłem UVA tworzą
wiązania kowalencyjne furan  tymina zahamowanie replikacji śmierć
komórki (w warunkach kontrolowanych w terapii fotodynamicznej)
9. Indukcja uszkodzeń DNA a leki przeciwnowotworowe:
a) Powstawanie wiązań krzyżowych (jedna / obie nici / DNA / białka),
tworzenie adduktów i alkilowanie (najczęściej metyzacja)
b) Alkilacja wywołana także przez gazy bojowe (iperyt) i nitrozaminy
c) Najczęstsze metylowe pochodne: 7-metyloguanina, 1-metyloadenina, 6-
O-metyloguanina
d) W leczeniu nowotworów pomocne
·ð Analogi zasad purynowych (fludarabina)
·ð Analogi zasad pirymidynowych (cytarabina, fluorouracyl)
·ð Analogi nukleozydów (antymetabolity)
·ð Acyklowir  analog 2-deoksyguanozyny, w leczeniu zakażeÅ„
wirusami DNA, wbudowanie kończy syntezę nici DNA brak
grupy 3  hydroksylowej (podobnie działa zidowudyna przy
HIV)
10. Uszkodzenia DNA przez zwiążki interkalujące (barwniki akrydynowe,
bromek etydyny)
a) Jako płaskie cząsteczki wnikają pomiędzy zasady w obu niciach
zniekształcenie helisy DNA
b) Przyczyny insercji i delecji
11. Uszkodzenia DNA przez zaktywowane ksenobiotyki:
a) Działanie ksenobiotyków zależy od aktywacji i powstania reaktywnej,
elektrofilowej pochodnej
b) Produktem ubocznym mogą być RFT (nitrozoaminy)
c) PWA tworzą pochodne zdolne do wytwarzania wiązań
kowalencyjnych z DNA, np. benzo[a]piren (B[a]P)  w szeregu reakcji
katalizowanych przez cytochromo P450-zależne enzymy powstaje
metabolit, który występuje jako para diastereoizomerów pochodne
reagujÄ… z grupami aminowymi DNA i RNA i resztÄ… fosforanowÄ…
addkuty
d) Inne zwiÄ…zki o analogicznym mechanizmie: 3-metylocholantren,
benzo[a]antracen, DMBA  większość łączy się z guaniną (DMBA z
adeninÄ…)
Wojtek NaFarmacji, Anno Domini 2014
e) Addukty zlokalizowane w mniejszym rowku helisy DNA utrudniajÄ…
aktywację polimerazy RNA podczas transkrypcji opóz
niajÄ…
rozpoznawanie przez enzymy naprawcze prekursory mutacji, np.
protoonkogeny c-Ha Ras aktywacja szlaków sygnałowych
aktywacja czynników transkrypcyjnych reakcje immunologiczne i
zapalne
12. Odpowiedz
komórki na uszkodzone DNA:
a) Naprawa  ominięcie/tolerancja  apoptoza
b) Następuje indukcja/supresja genów zablokowanie widełek
replikacyjnych zatrzymanie cyklu komórkowego i hamowanie
podziałów
c) Komórka nie przechodzi do następnego cyklu, jeśli wszystko nie jest ok
 rola produktów genu p53: kinazy ATM/ATR w etapach G1/S i
G2/M
·ð ATM uaktywnia siÄ™ po przerwaniu podwójnej nici i uszkodzenia
chromatyny
·ð ATR uaktywnia siÄ™ po blokadzie wideÅ‚ek replikacyjnych
·ð Aktywowane kinazy fosforyzujÄ… biaÅ‚ka docelowe zatrzymanie
cyklu apoptoza uszkodzonych komórek
d) Ważna rola znajomości regulacji cyklu w terapii nowotworów
·ð PoczÄ…tkowo zdrowe i chore komórki majÄ… podobnÄ… dÅ‚ugość
cyklu, ale zdrowe sÄ… w fazie G0
·ð Po I fazie leczenia wzrost tlenu i substancji wzrostowych 
więcej komórek przechodzi do G1
·ð II etap  usuniÄ™cie replikujÄ…cych komórek rakowych (najbardziej
wrażliwe na cytotoksyny w G2/M, najmniej w S)
13. Naprawa uszkodzeń DNA:
a) UÅ‚atwiona gdy dochodzi do odwracalnego zahamowania cyklu
komórkowego
b) Jeśli nie zachodzi przerwanie nici DNA niepotrzebna matryca
chemiczne odwrócenie zmian np. naprawa dimerów tyminy i
zmetylowanej guaniny
·ð Dimery tyminy rozcinane przez aktywowana Å›wiatÅ‚em fotoliazÄ™
DNA
·ð metylowana guanina  reakcja stechiometryczna (nie
katalityczna!) zależna od MGMT (białko o funkcjach
metylotransferazy); 1 czÄ…steczka MGMT przenosi 1 grupÄ™
metylowÄ…, potem degradacja ALE wzrost tworzenia MGMT pod
wpływem leków alkilujących mechanizm oporności
nowotworów na chemioterapię lekami alkilującymi
c) W przypadku pojawienia się utlenionych zasad, adduktów, przerwania
pojedynczej lub podwójnej nici inne machnizmy:
Wojtek NaFarmacji, Anno Domini 2014
·ð Wycinanie zasad (BER)  dotyczy pojedynczej zasady
uszkodzonej przez alkilacjÄ™, utlenianie, hydrolizÄ™, deaminacjÄ™
(tu także naprawa etenoadduktów)
o wiązanie N-glikozydowe między deoksyrybozą a
zmienionÄ… zasadÄ… rozcinane przez glikozydazy
monofunkcyjne = powstanie miejsc AP
o glikozydazy dwufunkcyjne także tworzą miejsca AP, ale
usuwajÄ… je w procesie ²-eliminacji
·ð Wycinanie nukleotydów (NER) - dotyczy adduktów
objętościowych, uszkodzeń zakłócających podwójną spiralę:
dimerów pirymidynowych, fotoproduktów
o pierwszy etap- wycięcie segmentu 12 nukleotydów wraz
z uszkodzonym fragmentem
o brakujÄ…cy fragment- syntetyzowany przez polimerazÄ™
DNA I od końca 3 nici uszkodzonej na matrycy nici
nieuszkodzonej
o następnie ligaza DNA łączy łańcuchy
o poziom naprawy większy w genach aktywnych
transkrypcyjnie, a szybsza naprawa w nici
transkrybowanej model TCR (naprawy powiÄ…zanej z
transkrypcją)  zatrzymanie wydłużania nici
transkrybowanej (przez blokadę aktywności polimerazy
RNA II) uruchamia naprawÄ™ szkody
·ð Naprawa bÅ‚Ä™dnie sparowanych zasad (MMR) - koryguje bÅ‚Ä™dy
replikacji i rekombinacji DNA wynikajÄ…ce z tautomerii zasad
o odrębne enzymy identyfikują pojedyncze błędne zasady i
krótkie insercje/delecje oraz defekty obejmujące wiele
zasad
o błędne fragmenty wycinane, zastępowane prawidłowymi
kopiami, całość łączy ligaza DNA
o enzymy MMR współpracują z mechanizmami kontroli
cyklu komórkowego w G2 i regulatorami apoptozy
·ð naprawa przez Å‚Ä…czenie niehomologicznych koÅ„ców DNA
(NHEJ)  mechanizm ważny przed replikacją DNA, aktywny w
G0/G1 i we wczesnej fazie S
o na przerwane końce działa ligaza DNA IV
o wymaga obecności białka Ku i zależnej od DNA kinazy
białkowej
o dokładność tego procesu zapewniają krótkie sekwencje
mikrohomologiczne obecne na końcach pojedynczych
nici, ulegające połączeniu
o możliwe delecje (oraz translokacje)
·ð naprawa przez Å‚Ä…czenie mikrohomologicznych koÅ„ców DNA
(MMEJ) - istotne znaczenie majÄ… mikrohomologiczne sekwencje
5-25 pz usytuowane wzdłuż pękniętych nici przed połączeniem
Wojtek NaFarmacji, Anno Domini 2014
o nie wymaga obecności białka Ku i zależnej od DNA
kinazy białkowej
o zachodzi w fazie S cyklu komórkowego
o błędy mechanizmu przyczyną delecji (podobnie jak w
NHEJ)
·ð rekombinacja homologiczna (HR)  polega na wymianie
sekwencji nukleotydów pomiędzy podobnymi/identycznymi
czÄ…steczkami DNA
o podczas mejozy=HR jest czynnikiem zróżnicowania
genetycznego  crossing over
o w komórkach dzielących się nie tworzy produktu
 crossing over , lecz odtwarza czÄ…steczkÄ™ sprzed
uszkodzenia
14. Analiza uszkodzeń DNA
a) Polega na analizie oksydacyjnych uszkodzeń DNA i identyfikacji oraz
oznaczaniu ilościowym adduktów po reakcji z kancerogenami
b) GC/MS lub LC/MS  połączenie chromatografii gazowej ze
spektrometrią mas; wykorzystywane w oznaczaniu produktów
utleniania DNA
·ð hydroliza próbki w warunkach kwasowych (GC) /
enzymatyczna (LC) uzyskujemy pojedyncze nukleotydy ze
zmienionymi zasadami
·ð deprywatyzacja (waporyzacja) próbki z BSTFA (tylko dla GC)
·ð próbka w postaci gazowej nakÅ‚adana na kolumnÄ™ kapilarnÄ…
wypełnioną nośnikiem; stały przepływ gazu, który nie reaguje z
nałożoną próbką (argon, hel, wodór, azot)
·ð Spektrometria mas (MS): czÄ…steczki naÅ‚adowane elektrycznie
przechodzÄ… przez pole magnetyczne
o w komorze jonizacyjnej czÄ…steczki rozpadajÄ… siÄ™ na jony w
kolizji z elektronami
o Określone napięcie powoduje przejście tylko jednego
naładowanego fragmentu do detektora
o Zderzenie jonu z powierzchniÄ… detektora wybija
elektrony (fotopowielacz  wzmocnienie Å‚adunku)
o Elektrony wychwytywane w kolektorze  pomiar
Å‚adunku
o Masa proporcjonalna do wykrytego Å‚adunku: m/z
o Wykres widma masowego: każdy pik odzwierciedla inny
fragment struktury cząsteczki; cząsteczka w całości 
największa masa widma (jon molekularny;  masa
macierzysta )
o Ograniczenia metody: zdolność rozdzielcza detektora
c) Elektroforeza kometkowa  wykrywa się pęknięcia
pojedynczej/podwójnej nici Dna w miejscach AP (skutek działania
czynników utleniających)
Wojtek NaFarmacji, Anno Domini 2014
·ð Komórki zatopione w agar ozie poddane lizie (detergent + NaCl)
zostaje tylko DNA w postaci nukleoidu (występują
charakterystyczne pętle po nawijaniu nici na histony)
·ð W Å›rodowisku silnie alkalicznym po przyÅ‚ożeniu napiÄ™cia - ruch
DNA w kierunku anody gdy mamy pęknięcia, uwolnione
fragmenty migrujÄ… swobodnie
·ð Pod wpÅ‚ywem barwników interkalujÄ…cych widoczne uwolnione
odcinki jako kometa (głowa + ogon)
·ð Ilość DNA w ogonie = ilość uwolnionych fragmentów pÄ™tli
ilość pęknięć nici DNA (im więcej utlenionych zasad, tym więcej
przerw w łańcuchu więcej DNA w ogonie)
·ð Prowadziny inkubacjÄ™ nukleoidu z endonukleazÄ… DNA, która
przerwa łańcuch, jeśli napotka na utlenioną zasadę
o Glikozydaza formamidopirymidynowa nacina łańcuch w
miejscu 8-oksoguaniny i formamidopirymidyny
o Endonukleaza III nacina łańcuch w miejscu utlenionych
reszt pirymidynowych
d) Wykrywanie adduktów DNA metodą 32P-postlabelingu
·ð Wyizolowany DNA jest hydrolizowany enzymatycznie do 3 -
mononukleotydów (nukleaza mikrokokowa + fosfodiesteraza II)
·ð Nukleaza P1 rozkÅ‚ada niezmodyfikowane nukleotydy
·ð Znakowanie 32P pozostaÅ‚ych nukleotydów w pozycji 5`
·ð Chromatografia TLC w czterech kierunkach (czasem HPLC)
o Pierwsze dwa służą usunięciu podstawowych
nukleotydów i nadmiaru ATP
o Właściwy rozdział w trzecim i czwartym kierunku
dwuwymiarowa mapa adduktów kancerogen:DNA
o Ad dukty lokalizuje siÄ™ autoradiograficznie i oznacza
mierząc radioaktywność poszczególnych plam
e) Zsynchronizowana spektrofotometria fluorescencyjna (SFS) 
stosowana w odniesieniu do adduktów tworzonych przez PWA
·ð Skondensowane pierÅ›cienie PWA = silna fluorescencja
·ð SFS = rejestrowanie widma fluorescencyjnego przy zmiennej
długości fali wzbudzenia i emisji, ale przy utrzymywaniu stałej
różnicy między tymi wartościami (pojawia się pik, gdy sygnał
odpowiada przedziałowi między pasmem wzbudzenia i emisji
zmniejszamy liczbę niepotrzebnych pików możemy prowadzić pomiar
przy obecności innych związków wykazujących fluorescencję) 
porównujemy intensywność fluorescencji wzorcowych
addkutów DNA:kancerogen z próbą badaną
·ð Metoda stosowana dla okreÅ›lenia poziomu adduktów
epokydiolu bezno[a]pirenu z DNA
·ð CzuÅ‚ość metody zwiÄ™kszona poprzez kwaÅ›nÄ… hydrolizÄ™ DNA
·ð Ograniczenie: potrzebna duża próbka DNA do oznaczenia
f) Techniki immunologiczne - RIA (klasyczna technika
radioimmunologiczna) , ELISA
Wojtek NaFarmacji, Anno Domini 2014
·ð Wykorzystuje siÄ™ fakt, że modyfikacje DNA wywoÅ‚ane
kancerogenem powodują wzrost jego immunogenności
(normalnie kwasy nukleinowe- słabe właściwości
immunogenne)
·ð Otrzymano wiele przeciwciaÅ‚ przeciwko adduktom kancerogen:
DNA, które z różną czułością rozpoznają addukt w DNA.
·ð Za pomocÄ… technik immunologicznych można wykryć 1
addukt/ 107-8 nukleotydów
·ð Ograniczenie metody wiąże siÄ™ z faktem dysponowania
specyficznymi przeciwciałami do określonych adduktów
·ð Modyfikacja  mikroskopia fluorescencyjna: stwierdzenie
obecności adduktów DNA:kancerogen w pojedynczych
komórkach i frakcjach subkomórkowych poprzez zastosowanie
przeciwciał połączonych ze znacznikami fluorescencyjnymi
Wojtek NaFarmacji, Anno Domini 2014