Tom 53, 2004
Numer 3 4 (264 265)
Strony 295 303
AGNIESZKA KISIEL, ANNA SK
PSKA, WOJCIECH T. MARKIEWICZ
i MAREK FIGLEROWICZ
Instytut Chemii Bioorganicznej PAN,
Noskowskiego 12/14, 61-704 Poznań
e-mail:[e-mail]
[e-mail]
[e-mail]
[e-mail]
MIKROMACIERZE DNA
WST
P
Jednym z najbardziej spektakularnych DNA. Można więc przypuszczać, iż obok ge-
osiągnięć biologii molekularnej przełomu XX i nów kodujących białka występują również
XXI w. było poznanie pełnej sekwencji nukle- geny kodujące regulatorowe RNA. Dodatko-
otydowej genomu ludzkiego oraz genomów wo, istnieje szereg dowodów wskazujących, że
modelowych organizmów zwierzęcych (Cae- zapisana w genomie informacja może być
norhabditis elegans, Drosophila melanoga- tłumaczona w wieloraki sposób. Innymi słowy,
ster) i roślinnych (Arabidopsis thaliana, Ory- jeden gen może kodować nie tylko kilka róż-
za sativa). Dzięki tym odkryciom dowiedzie- nych białek, ale i RNA pełniące funkcje regula-
liśmy się, iż pojedyncza komórka eukariotycz- torowe. Jest zatem oczywiste, że dogłębne po-
na zawiera od kilku do kilkudziesięciu tysięcy znanie procesów biologicznych wymaga stwo-
genów (około 30 tysięcy u Homo sapiens, 20 rzenia całkowicie nowych, bardziej komplek-
tysięcy u C. elegans, 25 tysięcy u A. thaliana). sowych metod pozwalających badać nie poje-
Czasoprzestrzenne zróżnicowanie ich aktyw- dyncze geny, ale całe genomy.
ności sprawia, że organizmy żywe są niezwykle Pierwszy etap uwalniania zawartej w geno-
dynamicznymi i złożonymi strukturami. Akty- mie informacji polega na jej przepisaniu z DNA
wacja genu lub grupy genów może przejawiać na RNA (Ryc. 1). Proces ten zwany jest tran-
się na wiele różnych sposobów. Najłatwiej do- skrypcją, a jego produkty transkryptami pier-
strzec ją analizując produkty pośrednie wotnymi. Stosowana z powodzeniem od kilku-
(mRNA) lub końcowe (białka) procesu ekspre- dziesięciu lat metoda analizy transkryptów
sji informacji genetycznej (Ryc. 1). Zdecydo- Northern wykorzystuje zdolność jednonicio-
wanie trudniejszym zadaniem jest poznanie wych kwasów nukleinowych (DNA i RNA) do
mechanizmów decydujących jaka część zawar- hybrydyzacji, czyli rozpoznawania cząsteczek
tej w genomie informacji oraz w jakiej kolejno- o komplementarnej sekwencji i tworzenia z
ści zostaje uwolniona. Najnowsze badania nimi struktur dwuniciowych poprzez wiązania
wskazują, iż jednym z głównych czynników re- wodorowe. Metodą Northern bada się od-
gulujących proces ekspresji genów, zarówno działywanie sondy (znakowanego radioaktyw-
na poziomie transkrypcji jak i translacji, są nie- nie fragmentu RNA lub DNA) z pulą całkowite-
wielkie cząsteczki RNA. Podobnie jak mRNA, go RNA wyizolowanego z konkretnej tkanki
są one syntetyzowane w oparciu o genomowy czy organu i unieruchomionego na nośniku ta-
296 AGNIESZKA KISIEL i współaut.
Ryc. 1. Przepływ informacji genetycznej.
Obecny w jądrze komórkowym DNA genomowy jest powielany przez replikację oraz służy jako matryca do synte-
zy RNA w procesie transkrypcji. Po modyfikacjach RNA może być wykorzystany jako matryca do syntezy białek
(translacji) lub pełni funkcje regulatorowe.
kim, jak na przykład nylonowa membrana. W nieniu od genetyki, podstawowym obiektem
ten sposób poprzez stwierdzenie, iż doszło do jej zainteresowań jest nie gen, lecz genom. W
hybrydyzacji można ustalić czy interesujący ten sposób genomika otwiera przed badaczami
nas gen ulega aktywacji. Jest to prosta i czuła możliwość analizowania procesów biologicz-
metoda, jednak jej wykorzystanie do analizy nych w szerszym kontekście  wzajemnych od-
ekspresji więcej niż kilku lub kilkunastu ge- działywań i powiązań pomiędzy genami na po-
nów jest niezwykle pracochłonne. Dodatko- ziomie komórek, organów, a nawet całych or-
wo, nawet bardzo dokładny opis działania po- ganizmów.
jedynczego genu nie wystarcza do zrozumienia Jednym z działów genomiki jest genomika
jak zawarta w nim informacja przekłada się na funkcjonalna. Jej podstawowym celem jest po-
rozwój i funkcjonowanie całego organizmu. znanie reguł, zgodnie z którymi funkcjonuje
Jego fenotyp, czyli obserwowany efekt ekspre- cały genom. Już pierwsze badania pokazały, iż
sji informacji genetycznej jest wypadkową ol- osiągnięcie tego celu wymaga opracowania no-
brzymiej liczby zdarzeń. Zależy on między in- wych, bardziej wydajnych sposobów pozyski-
nymi od czasu i miejsca ekspresji poszczegól- wania i analizy danych. Kluczem do rozwiąza-
nych genów, ich wzajemnej pozytywnej i nega- nia tego problemu wydaje się być umiejętne
tywnej regulacji, czy wpływu czynników zew- połączenie informatyki i nowoczesnych mikro-
nętrznych. Jednym z głównych zadań stojących czy nanotechnologii z klasycznymi metodami
przed współczesną nauką jest zatem poznanie i biologii molekularnej (HUNT i LIVESEY 2000).
zrozumienie tych złożonych oddziaływań. Wy- W wyniku takiego właśnie myślenia powstały
zwanie to stało się bodz
cem do rozwoju nowej mikromacierze DNA (BROWN i BOTSTEIN
dziedziny wiedzy zwanej genomiką. W odróż- 1999).
Mikromacierze DNA 297
CO TO S
MIKROMACIERZE DNA?
Idea działania mikromacierzy jest prosta i W zależności od rodzaju i pochodzenia
wywodzi się bezpośrednio z tradycyjnych cząsteczek umieszczonych na szklanym
technik analizy ekspresji genów, z tą różnicą, podłożu rozróżniamy dwa rodzaje mikroma-
że w przypadku mikromacierzy  role zostały cierzy: mikromacierze cDNA oraz mikromacie-
odwrócone; na stałym podłożu  najczęściej rze oligonukleotydowe, zwane też  chipami
szklanej płytce  umieszczane są sondy DNA DNA (HARRINGTON i współaut. 2000). W
reprezentujące interesujące nas geny. Znako- pierwszym przypadku rolę sond pełnią frag-
wana jest z kolei próba pochodząca z badanego menty cDNA (zwykle około kilkusetnukleoty-
materiału biologicznego. W ten sposób można dowe), w drugim  krótkie oligonukleotydy
w jednym eksperymencie przeanalizować eks- otrzymane na drodze syntezy chemicznej. Z
presję tylu genów, ile reprezentujących je sond uwagi na skomplikowany sposób projektowa-
naniesiono na podłoże, czyli nawet kilkudzie- nia i produkcji, najczęściej korzysta się z goto-
sięciu tysięcy! Stało się to możliwe dzięki mi- wych chipów DNA, znajdujących się w ofercie
niaturyzacji oraz zastosowaniu barwników flu- szeregu firm biotechnologicznych. A
atwiejsze
orescencyjnych, które dają bardziej  zwarty do przygotowania mikromacierze cDNA zwy-
sygnał niż stosowane dotychczas radioaktyw- kle konstruowane są samodzielnie na potrzeby
ne izotopy. indywidualnych eksperymentów.
PRZEBIEG EKSPERYMENTU MIKROMACIERZOWEGO
Pierwszą decyzją, którą należy podjąć JORDAN 2001, AHARONI i VORST 2002). Pierw-
przed przystąpieniem do właściwego ekspery- szy etap to przygotowanie sond. Sondy cDNA
mentu jest wybór mikromacierzy. Jej rodzaj otrzymuje się przez amplifikację metodą
jest ściśle uzależniony od celu i obiektu badań. RT-PCR. Wykonanie macierzy cDNA nie stwa-
Aby przygotować chip DNA, niezbędna jest rza więc wielkich trudności. Wystarczy dobrze
dokładna znajomość sekwencji analizowanych zaprojektować startery do selektywnej i wydaj-
genów. Stąd obecnie produkuje się chipy DNA nej amplifikacji wybranych części genów, bez
wyłącznie dla wybranych gatunków o dobrze konieczności poznania całej sekwencji takiej
scharakteryzowanym genomie. Mikromacie- sondy. Niestety, otrzymanie każdej sondy wy-
rze cDNA nie wymagają takiej wiedzy, dlatego maga przeprowadzenia oddzielnej reakcji. Po
można je wykorzystać do analizy ekspresji ge- amplifikacji i oczyszczeniu, sondy nanoszone
nów o nieznanej lub częściowo znanej sekwen- są na podłoże przy pomocy specjalnych
cji, np. do przeszukiwań różnicowych biblio- urządzeń, w sposób kontaktowy  przy pomo-
tek cDNA. cy igieł lub niekontaktowy, np. piezoelektrycz-
Typowy eksperyment wykorzystujący mi- nie, z wykorzystaniem techniki znanej z druka-
kromacierze obejmuje: rek atramentowych.
a) otrzymanie sond DNA oraz ich Ważną cechą sond, a przez to i macierzy
umieszczenie na podłożu; cDNA, jest brak lub bardzo niska specyficzność
b) izolację i wyznakowanie próby z ma- wobec genów homologicznych. Jeżeli sonda
teriału biologicznego, który ma zostać scharak- składa się z kilkuset nukleotydów, wówczas
teryzowany; mogą do niej hybrydyzować nie tylko w pełni
c) hybrydyzację próby (prób) do sond komplementarne sekwencje DNA. Ten pro-
DNA znajdujących się na mikromacierzy; blem można ominąć stosując sondy oligonukle-
d) zebranie i analizę wyników hybrydy- otydowe, jednak ich projektowanie jest o wiele
zacji. bardziej skomplikowane. Z teoretycznych obli-
czeń wynika, że 17-nukleotydowa sekwencja
powinna pojawić się tylko raz w DNA o długo-
KONSTRUKCJA MIKROMACIERZY
ści odpowiadającej całemu genomowi człowie-
ka. Jednak naturalne sekwencje DNA dalekie są
Konstrukcja mikromacierzy cDNA i oligo-
od rozkładu statystycznego. Przygotowanie oli-
nukleotydowych przebiega w zdecydowanie
gonukleotydów wchodzących w skład mikro-
odmienny sposób (DUGGAN i współaut. 1999,
macierzy DNA wymaga zatem poznania w zasa-
298 AGNIESZKA KISIEL i współaut.
dzie całej sekwencji genomu. Oligonukleotydy toindukowane odczynniki syntetyczne. W me-
muszą zostać tak zaprojektowane, by były w todzie tej poszczególne reakcje chemiczne z
pełni komplementarne do odcinka wybranego cyklu syntezy oligonukleotydu indukowane są
genu, a równocześnie maksymalnie różne od za pomocą światła. Zasięg reakcji jest więc
pozostałych genów. Aby zapewnić odpowied- ograniczony do miejsca, na które pada światło,
nio wysoką specyficzność, projektuje się od kil- zwykle światło ultrafioletowe. W ten sposób
ku do kilkunastu sond, pokrywających łącznie techniki fotolitograficzne zapewniają szczegól-
kilkusetnukleotydowy odcinek danego genu. nie wysoki poziom integracji syntetyzowanych
Dodatkowo projektowany jest drugi zestaw mikromacierzy DNA sięgający nawet kilkuset
sond, z których każda różni się od sondy w tysięcy różnych oligonukleotydów na po-
pełni komplementarnej tylko jednym nukle- wierzchni kilku cm2. W przypadku macierzy o
otydem. W ten sposób jeden gen jest reprezen- niższej gęstości, zawierających kilka czy kilka-
towany na chipie przez kilkanaście par oligo- naście tysięcy sond, oligonukleotydy mogą być
nukleotydów. naniesione na płytkę szklaną podobnie jak son-
Z kolei samo otrzymanie sond w przypadku dy cDNA.
chipów DNA wydaje się być zadaniem stosun-
kowo prostym. Dzięki pełnej automatyzacji,
PRZYGOTOWANIE PRÓBY
syntetyzery DNA są obecnie w stanie wyprodu-
kować nawet około 1000 oligonukleotydów w
Sposób przygotowania i znakowania próby
ciągu jednego etapu trwającego zwykle około
zależy od rodzaju użytej mikromacierzy. Jed-
2 godzin. Innym sposobem otrzymania krót-
nak w każdym przypadku pierwszym krokiem
kich sond jest ich bezpośrednia synteza na mi-
jest izolacja RNA z badanego materiału biolo-
kromacierzy. W tym celu najczęściej wykorzy-
gicznego (Ryc. 2, 3). Jeśli stosowane są mikro-
stywane są metody fotolitograficzne działające
macierze cDNA, to RNA jest po izolacji przepi-
w oparciu o fotoczułe grupy ochronne lub fo-
Ryc. 2. Schematyczny przebieg eksperymentu z wykorzystaniem mikromacierzy cDNA.
Mikromacierze DNA 299
sywany na komplementarny jednoniciowy ścią wbudowywania do cDNA, mimo że fluoro-
DNA, przy pomocy enzymu zwanego od- fory stanowią sporą zawadę przestrzenną.
wrotną transkryptazą. W czasie odwrotnej W przypadku chipów znakowany jest nie
transkrypcji do powstających cząsteczek DNA cDNA, a tak zwany antysensowny RNA (Ryc. 3,
włączane są znakowane nukleotydy  posia- cRNA). Ma on sekwencję komplementarną do
dające dołączony barwnik fluorescencyjny, co sond oligonukleotydowych umieszczonych na
umożliwia póz
niejsze obrazowanie i oszaco- chipie, cojest warunkiemhybrydyzacji. Wcelu
wanie ilości cząsteczek (Ryc. 2). jego otrzymania, wyizolowany RNA zostaje
Jedną z istotnych zalet mikromacierzy przepisany na cDNA, równocześnie liczba anal-
cDNA jest to, że znakując dwie próby różnymi izowanych cząstek ulega zwielokrotnieniu.
barwnikami fluorescencyjnymi możemy w po- Należy jednak pamiętać, że amplifikacja musi
jedynczym eksperymencie zbadać i porównać mieć charakter liniowy, bowiem tylko przy za-
ekspresję genów w próbie eksperymentalnej i chowaniu wyjściowych proporcji różnych
w próbie kontrolnej (na przykład w zmienio- cząsteczek w puli można określić, jaki był ich
nej chorobowo i w zdrowej tkance). Najczę- względny poziom w badanych komórkach czy
ściej używana do znakowania para fluorofo- tkankach. Utworzony cDNA służy jako matryca
rów to Cyanine-3 (Cy3) i Cyanine-5 (Cy5). Wid- do tranaskrypcji in vitro, wczasiektórej dopo-
ma emisji tych barwników pokrywają się w wstającego cRNA dołączana jest biotyna. Nas-
bardzo niewielkim stopniu, co pozwala na wy- tępnie, już po hybrydyzacji, biotynylowany
biórcze zliczenie intensywności sygnału emito- cRNA znakuje się przy pomocy kompleksu
wanego przez każdą z hybrydyzowanych prób. streptawidyny z barwnikiem fluorescency-
Ważnejest równieżto, iżnukleotydyznakowa- jnym, fikoerytryną. Wreszcie, inaczej niż przy
ne Cy3 i Cy5 charakteryzują się dobrą wydajno- mikromacierzach cDNA, w pojedynczym eks-
Ryc. 3. Schematyczny przebieg eksperymentu z wykorzystaniem chipów DNA.
300 AGNIESZKA KISIEL i współaut.
perymencie można hybrydyzować do chipa tyl- Opracowano szereg algorytmów wykorzysty-
ko jedną próbę. wanych przy normalizacji danych uzyskanych
Hybrydyzacja obu typów mikromacierzy z mikromacierzy. Zazwyczaj wchodzą one w
zachodzi podczas kilkunastogodzinnej inkuba- skład pakietów oprogramowania czytnika.
cji w komorze hybrydyzacyjnej, w warunkach Wskazane jest również umieszczenie na mikro-
zapewniających równomierny dostęp próby macierzy kontroli negatywnych, czyli sond dla
do całej powierzchni mikromacierzy. Po hybry- genów, które nie powinny hybrydyzować z
dyzacji i odmyciu niezwiązanej próby, mikro- analizowaną próbą, np. genów zwierzęcych na
macierz jest gotowa do analizy. mikromacierzach przeznaczonych dla roślin.
Można również przed znakowaniem dołączyć
do obu pul RNA znaną ilość RNA obcego po-
ZBIERANIE I ANALIZA WYNIKÓW
chodzenia (ang. spiking controls), który po hy-
brydyzacji z odpowiednią sondą na mikroma-
cierzy może być wykorzystany do normalizacji
Dane zbierane są przez czytnik konfokalny,
obu kanałów fluorescencji. Inna strategia nor-
po wzbudzeniu znaczników fluorescencyj-
malizacji polega na analizie sygnałów po-
nych światłem lasera o odpowiedniej długości.
chodzących od genów o konstytutywnej eks-
Zmierzona intensywność fluorescencji, po-
presji w każdym typie komórek i w każdych
mniejszona o wartość tła, obrazuje ilość cząste-
warunkach (ang. housekeeping genes).
czek, które hybrydyzowały do danego elemen-
Podstawowym celem eksperymentu mikro-
tu mikromacierzy. Analiza chipów obejmuje:
macierzowego jest zbadanie poziomu ekspre-
(i) porównanie intensywności fluorescencji w
sji genów w próbie badanej względem próby
obrębie każdej pary sond (specyficzny RNA
kontrolnej i wyróżnienie genów o zmienionej
obecny w próbie będzie silniej hybrydyzował z
ekspresji. Dla mikromacierzy cDNA dane te
całkowicie komplementarną sondą niż z sondą
otrzymuje się w pojedynczym eksperymencie,
różniącą się jednym nukleotydem) oraz (ii) ze-
dla chipów oligonukleotydowych trzeba po-
stawienie wyników uzyskanych dla wszystkich
równać wyniki zebrane z niezależnych hybry-
sond reprezentujących dany gen. Na tej podsta-
dyzacji. Do eksperymentatora należy ustalenie
wie można wnioskować o obecności lub braku
jaką różnicę w ekspresji genów należy uznać za
ekspresji genu oraz porównywać ze sobą po-
znaczącą statystycznie. Z reguły za znaczące
ziomy ekspresji wielu genów.
przyjmuje się różnice wyższe niż dwu  cztero-
W przypadku mikromacierzy cDNA, gdzie
krotne.
hybrydyzowane są z reguły dwie próby jedno-
W wielu przypadkach takie  proste porów-
cześnie, sygnały pochodzące od barwników
nanie poziomów ekspresji genów między
fluorescencyjnych zbierane są oddzielnymi
dwiema próbami stanowi dopiero początek ba-
kanałami i tworzone są dwa obrazy: ekspery-
dań. Szczególnie poznanie zmian za-
mentalny i kontrolny. Obrazy te można na sie-
chodzących podczas długotrwałych procesów,
bie nakładać i porównywać intensywności sy-
np. wzrostu organów, rozwoju choroby czy re-
gnału dla poszczególnych genów.
akcji na długotrwałe działanie czynników zew-
Zanim jednak przejdziemy do dalszych ana-
nętrznych, wymaga zestawienia wyników uzy-
liz i interpretacji, należy przede wszystkim
skanych w kilku czy kilkunastu eksperymen-
znormalizować takie  surowe dane. Normali-
tach. Istnieje szereg metod umożliwiających ta-
zacja jest niezbędna z uwagi na możliwość
kie porównania (QUACKENBUSH 2001). Należy
popełnienia szeregu błędów, często trudnych
do nich metoda grupowania hierarchicznego
do zdiagnozowania na wcześniejszych eta-
(ang. hierarchical clustering) (EISEN i
pach, a mogących mieć znaczny wpływ na wy-
współaut. 1998). Polega ona na grupowaniu
niki pomiarów. Należą do nich: (i) różnice w
podobnie zachowujących się genów, a następ-
ilości wyjściowego RNA lub wydajności znako-
nie łączeniu powstałych w ten sposób grup w
wania prób odmiennymi fluoroforami; (ii) róż-
kolejne, jeszcze większe. Proces ten powtarza-
nice w ilości sond naniesionych na mikroma-
ny jest tak długo, aż wszystkie geny zostaną
cierz, spowodowane np. nieprawidłowym
połączone w pojedyncze drzewo hierarchicz-
działaniem urządzenia do produkcji mikroma-
ne. Analiza takich grup genów o podobnej eks-
cierzy; (iii) nierównomierna hybrydyzacja, wy-
presji pozwala kompleksowo spojrzeć na pro-
nikająca ze złej dystrybucji roztworu hybrydy-
cesy biologiczne  umożliwia między innymi
zacyjnego oraz (iv) różnice w intensywności
przyporządkowanie funkcji genom na podsta-
tła, spowodowane np. zanieczyszczeniami.
Mikromacierze DNA 301
wie podobieństwa profilu ich ekspresji do pro- trolujących procesy biologiczne, np. poszuki-
filu innych genów z grupy. Jest również bardzo wania wspólnych elementów regulatorowych
prawdopodobne, że geny o podobnym profilu w sekwencjach genów.
ekspresji podlegają podobnej regulacji. Przy ta-
kim założeniu analiza ekspresji może stanowić
punkt wyjścia dla badania mechanizmów kon-
MIKROMACIERZE W DIAGNOSTYCE I TERAPII CHORÓB NOWOTWOROWYCH
Prowadzone w ostatnich kilku latach bada- mórkowy, stres oksydacyjny i programowaną
nia ukazały jak liczne i różnorodne korzyści śmierć komórki. Dzięki możliwości jednocze-
przynieść może zastosowanie mikromacierzy snej analizy aktywności praktycznie wszyst-
DNA. Szczególnie duże nadzieje wiązane są z kich genów uzyskujemy pełny obraz działania
ich praktycznym wykorzystaniem w medycy- testowanego czynnika na organizm. W ten spo-
nie (AITMAN 2001). Uważa się, iż chipy DNA sób można identyfikować nowe potencjalne
umożliwią szybszą i precyzyjniejszą diagnosty- karcynogeny, wyjaśniać mechanizmy ich
kę wielu chorób, lepsze poznanie ich etiologii i działania, określić standardy bezpiecznego ich
mechanizmu molekularnego oraz trafniejszy stosowania (VRANA i współaut. 2003).
dobór optymalnej terapii. W jaki sposób ocze-
kiwania te są obecnie realizowane najłatwiej
DIAGNOZA
dostrzec na przykładzie nowoczesnej onkolo-
gii.
Poznanie różnic we wzorze ekspresji setek
Chociaż istnieją nowotwory powstające w
genów może służyć jako narzędzie ułatwiające
wyniku mutacji pojedynczego genu, to jednak
klasyfikację histologicznie nierozróżnialnych
większość z nich rozwija się na skutek niepra-
nowotworów, wykazujących jednak różnice w
widłowego działania wielu genów, z których
zachowaniu klinicznym. Tą drogą można pra-
żaden samodzielnie nie doprowadziłby do
widłowo zdiagnozować choroby w bardzo
transformacji. Efektywna walka z nowotwora-
wczesnym stadium rozwoju i dobrać indywi-
mi wymaga zatem wielokierunkowych działań.
dualną, optymalną dla danego pacjenta terapię
Najważniejsze z nich to:
(MACGREGOR i SQUIRE 2002).
 identyfikacja zarówno czynników powo-
Klasyczne metody diagnostyczne są często
dujących powstawanie i rozwój nowotwo-
niewystarczające dla właściwego rozróżnienia
rów, jak i mechanizmów obronnych orga-
nowotworów. Z sytuacją taką możemy się spo-
nizmu;
tkać próbując odróżnić ostrą białaczką szpi-
 postawienie odpowiednio wczesnej i pra-
kową (AML) od ostrej białaczki limfatycznej
widłowej diagnozy;
(ALL). Tymczasem obie jednostki chorobowe
 właściwy dobór terapii;
wymagają zupełnie innego leczenia, a dodatko-
 poznanie czynników wpływających na sku-
wo stwarzają całkowicie inne zagrożenie dla
teczność terapii.
zdrowia pacjenta. Dzięki zastosowaniu techno-
Choć może się to wydawać wręcz niepraw-
logii mikromacierzy znaleziono jednoznaczne
dopodobne  mikromacierze DNA okazują się
markery genetyczne obu chorób. W tym celu
przydatnym narzędziem na każdym z wymie-
do macierzy zawierającej 6800 genów hybry-
nionych etapów.
dyzowano próby pochodzące z krwi chorych
cierpiących na oba typy białaczek. W rezultacie
zidentyfikowano 50 genów ulegających zdecy-
ROZPOZNANIE PRZYCZYN
dowanie różnej ekspresji u chorych cier-
Identyfikacja przyczyn choroby to pierw- piących na AML i ALL (GOLUB i współaut
szy krok do jej zapobiegania. Wiele chorób no- 1999).
wotworowych związanych jest z czynnikami
środowiskowymi. Podstawowym zadaniem ba-
DOBÓR TERAPII  ROKOWANIE
daczy jest więc ich identyfikacja. Do takich ana-
liz konstruowane są macierze złożone z genów
odpowiedzialnych za naprawę DNA, metabo- W ciągu ostatniej dekady repertuar leków
lizm obcych dla organizmu substancji, cykl ko- przeciwnowotworowych uległ znacznemu po-
302 AGNIESZKA KISIEL i współaut.
większeniu. Niestety ich stosowanie często od- specyficzne dla 32 genów o znanym, stałym po-
bywało się metodą prób i błędów. Analiza pro- ziomie ekspresji, by przy ich pomocy znormali-
filu ekspresji genów pozwoliła znacząco po- zować intensywność uzyskanych sygnałów. Z
prawić ten stan rzeczy przez znalezienie macierzą hybrydyzowano jednocześnie próby
związków pomiędzy rodzajem nowotworu a pobrane ze zdrowej tkanki i próby z 20 zróżni-
jego wrażliwością na dany rodzaj terapii czy na- cowanych nowotworów. Dziesięć próbek gu-
wet na konkretny lek. Zademonstrowano rów- zów pochodziło od pacjentek, które przeżyły
nież kliniczną użyteczność mikromacierzy bez nawrotu choroby przez ponad 5 lat (5y-S),
DNA w procesie przewidywania skutków cho- dziesięć zaś od pacjentek, które zmarły w prze-
roby nowotworowej u pacjentów poddanych ciągu 5 lat po operacji (5y-D). W ten sposób zi-
określonej terapii. dentyfikowano 257 genów o podwyższonej i
Poniższy przykład obrazuje wykorzystanie 378 genów o obniżonej ekspresji w tkance
mikromacierzy w opracowywaniu skutecz- zdrowej w porównaniu z tkanką zmienioną no-
nych dróg diagnostyki, terapii i prognozowa- wotworowo. Przeanalizowano także różnice w
nia u pacjentek z nowotworami piersi. Klinicz- ekspresji genów pomiędzy grupami 5y-S i 5y-D.
ny przebieg choroby po usunięciu zmiany no- Ustalono, że próby tkanki nowotworowej po-
wotworowej może być bardzo zróżnicowany  brane od pacjentek o odmiennym przebiegu
od przypadków szybkiego nawrotu ze skut- choroby znacząco się różniły  znaleziono 71
kiem śmiertelnym, aż do przeżycia ponad 10 lat genów o zdecydowanie wyższej ekspresji w
po operacji bez najdrobniejszych objawów grupie 5y-D oraz 15 genów o wyższej ekspresji
choroby. W zależności od charakteru zmiany w grupie 5y-S. Jak nietrudno się domyślić, u pa-
nowotworowej pacjentkom po operacji pro- cjentek ze śmiertelnym przebiegiem choroby
ponuje się odmienne terapie. Do niedawna sta- podwyższonej ekspresji ulegały geny zaanga-
wiane prognozy pooperacyjne obarczone były żowane we wzrost i tworzenie przerzutów, ob-
dużym ryzykiem błędu, gdyż opierały się tylko niżała się natomiast ekspresja genów związa-
na zewnętrznych przesłankach, takich jak np. nych z naprawą materiału genetycznego i prze-
rozmiar guza. Dzięki mikromacierzom można kazywaniem sygnału w komórce. Dla spraw-
poznać także profil genetyczny zmiany, co pod- dzenia wiarygodności wyników dodatkowo
wyższa wiarygodność uzyskanej prognozy. porównano poziomy ekspresji wybranych 18
O skuteczności metod diagnostycznych genów innymi metodami stosowanymi w bio-
opartych o mikromacierze świadczyć mogą ba- logii molekularnej. Po uzyskaniu zgodnych re-
dania pacjentek z niewrażliwym na hormony zultatów zidentyfikowane geny potraktowano
nowotworem piersi. W ich pierwszym etapie jako markery pozwalające skonstruować ma-
wykorzystano macierz zawierającą sondy cierz diagnostyczną. Jej zastosowanie dla loso-
cDNA dla ponad 25 tysięcy ludzkich genów. wej próby pacjentek podniosło trafność roko-
Zastosowano cDNA o długości od 200 do 1100 wań do 90% (NAGAHATA i współaut. 2004).
par zasad, wśród nich między innymi sondy
PODSUMOWANIE
Zaprezentowane powyżej przykłady sku- obserwacje poczynione za pomocą mikroma-
tecznego wykorzystania mikromacierzy DNA cierzy w proste, powtarzalne testy. Będące w
nie ograniczają się jedynie do chorób nowo- użyciu mikromacierze różnią się zestawem i
tworowych. Podobną strategię postępowania długością zastosowanych sond, metodą hybry-
można zastosować również w wielu innych dyzacji lub detekcji sygnału. W tej sytuacji uzy-
schorzeniach, na przykład w alergiach  odpo- skane efekty mogą być zależne od wielu trudno
wiednio skonstruowana mikromacierz mierzalnych czynników.
mogłaby być pomocna przy jednoczesnej anali- Można stwierdzić, że wszystkie zalety i
zie szerokiej gamy alergenów. Zanim jednak wady mikromacierzy DNA wypływają z tej sa-
mikromacierze zostaną wprowadzone do ruty- mej ich właściwości  są one z
ródłem olbrzy-
nowego stosowania w diagnostyce, trzeba po- miej ilości bardzo złożonych danych, których
konać szereg trudności. Podstawową kwestią, analiza może dostarczyć wiele informacji, jest
którą należy dopracować jest standaryzacja ona jednak niezwykle skomplikowana.
metody. Nie ustalono jeszcze jak przekształcić
Mikromacierze DNA 303
DNA MICROARRAYS
S u mma r y
The breakthrough in DNA sequencing technology oligonucleotides (about 30 nt), perfectly matching the
and completion of sequencing of first eucaryotic target gene, and several oligomers with a single mis-
genomes raised the need for high-throughput meth- match. Oligonucleotides are usually synthetised on a
ods of gene function analysis. To solve this problem glass slide using the photolithographic technique and
the DNA microarray technology has been developed. the slide is hybridized to fluorescently labeled target
It is based on traditional transcript profiling methods RNA. Analysis of microarray data includes the compar-
which use the hybridization ability of DNA and RNA to ison of gene expression in the experimental and con-
monitor gene expression. Due to miniaturisation and trol probes or the comparison of gene expression pro-
the use of fluorescent dyes DNA microarrays allow for files obtained in several experiments, by different
simultaneous monitoring of the expression of tens of clustering methods.
thousands genes. There are two main types of DNA Medicine is one of the fields where DNA
microarrays: cDNA microarrays and oligonucleotide microarrays have already found practical application.
microarrays, also called DNA chips. In the former, sev- At present they are especially useful in cancer re-
eral-hundred-nucleotide long cDNA probes are search. DNA microarray analysis of tumor tissues al-
printed on a glass plate and hybridized to a lows to differentiate among various cancer types, to
fluorescently labeled target cDNA obtained from the prognose the illness progress and plan the therapy.
tissue of interest. In the latter, type of microarrays, DNA microarrays are also an irreplaceable tool in a
each gene is represented by several short search for new drugs.
LITERATURA
AHARONI A., VORST O., 2002. DNA microarrays for func- HUNT S. P., LIVESEY F. J. (red.), 2000. Functional Geno-
tional plant genomics. Plant Mol. Biol. 48, 99 118. mics. Oxford University Press, Avon.
AITMAN T. J., 2001. DNA microarrays in medical practi- JORDAN B. R. (red.), 2001. DNA Microarray: Gene
ce. BMJ 323, 611 615. Expression Applications. Springer, Heidelberg.
BROWN P. O., BOTSTEIN D., 1999. Exploring the new MAcGREGOR P. F., SQUIRE J. A., 2002. Application of
world of the genome with DNA microarrays. Nat. Microarrays to the Analysis of Gene Expression in
Genet. Suppl. 21, 33 37. Cancer. Clin. Chem. 48, 1170 1177.
DUGGAN D. J., BITTNER M., CHEN Y., MELTZER P., TRENT J. NAGAHATA T., ONDA M., EMI M., NAGAI H., TSUMAGARI K.,
M., 1999. Expression profiling using cDNA micro- FUJIMOTO T., HIRANO A., SATO T., NISHIKAWA K., AKIY-
arrays. Nat. Genet. Suppl. 21, 10 14. AMA F., SAKAMOTO G., KASUMI F., MIKI Y., TANAKA T.,
EISEN M. B., SPELLMAN P. T., BROWN P. O., BOTSTEIN D., TSUNODA T. 2004. Expression profiling to predict
1998. Cluster analysis and display of ge- postoperative prognosis for estrogen receptor-ne-
nome-wide expression patterns. Proc. Natl. Acad. gative breast cancers by analysis of 25,344 genes
Sci. USA 95, 14863 14868. on a cDNA microarray. Cancer Sci. 95, 218 225.
GOLUB T. R., SLONIM D. K., TAMAYO P., HUARD C., GAASEN- QUACKENBUSH J., 2001. Computational analysis of
BEEK M., MESIROV J. P., et al., 1999. Molecular classi- microarray data. Nat. Rev. Genet. 2, 418 427.
fication of cancer: class discovery and class pre- VRANA K. E., FREEMAN W. M., ASCHNER M., 2003. Use of
diction by gene expression monitoring. Science Microarray Technologies in Toxicology Research.
286, 531 537. Neuro Toxicol. 24, 321 332.
HARRINGTON CH. A., ROSENOW C., RETIEF J., 2000. Moni-
toring gene expression using DNA microarrays.
Curr. Opin. Microbiol. 3, 285 291.