Replikacja DNA
" Składa się z 4 rodzajów zasad przyłączonych do rdzenia
cukrowo fosforanowego
" Jest polimerem zbudowanym z jednostek
monomerycznych - deoksyrybonukleotydów
" nukleotyd składa się z zasady azotowej, cukru oraz z
jednej lub więcej grup fosforanowych
" Cukrem jest deoksyryboza
" Zasadami azotowymi  pochodne puryny i pirymidyny
pirymidyna
puryna
Puryna i jej pochodne
adenina guanina
Pirymidyna i jej pochodne
tymina cytozyna
" A
ańcuch DNA składa się z
deoksyrybonukleotydów
(dAMP, dGMP, dTMP, dCMP).
Połączone są one resztami
fosforanowymi. Grupa 3'-
hydroksylowa reszty cukrowej
jednego nukleotydu połączona
jest z grupÄ… 5'-hydroksylowÄ…
następnej reszty cukrowej
wiÄ…zaniem fosfodiestrowym.
" Sekwencja nukleotydów w
łańcuchu kwasu nukleinowego
opisywana jest zazwyczaj za
pomocą skrótów
jednoliterowych np.:
A-T-G-C-T-A-C-A-G
" A
ańcuch DNA
wykazuje
polarność
" Kolejność zasad
zapisywana w
kierunku 5 ->3
Model Watsona i Cricka:
" W skład cząsteczki DNA wchodzą dwa
łańcuchy, które biegną antyrównolegle
(tzn. koniec jednego jest dokładnie
naprzeciw poczÄ…tku drugiego).
A
ańcuchy owijają się wokół wspólnej
osi i tworzą tzw. prawoskrętną
podwójną helisę.
" Jeden z łańcuchów-kolor
zielony, drugi-
pomarańczowy; zasady
purynowe i pirymidynowe
mniej intensywne barwy niż
rdzeń cukrowo-fosforanowy.
Rodzaj DNA/Funkcja B-DNA A-DNA Z-DNA
liczba par zasad 10,4 (ok. 10,2 dla 11 12
przypadająca na skręt tzw. wysp CpG)
helisy
kąt skręcania między + 34,6 + 32,7 - 30,0
sÄ…siednimi
parami zasad (w
stopniach)
skok helisy (w nm) 3,54 2,53 4,56
kierunek skręcania prawoskrętna prawoskrętna lewoskrętna
średnica helisy (w nm) 2,37 2,55 1,84
Model Watsona i Cricka:
" Zasady azotowe znajdujÄ… siÄ™ wewnÄ…trz, a fosforany i reszty
deoksyrybozy-na zewnątrz helisy; płaszczyzny zasad są
prostopadłe do osi helisy, a płaszczyzny pierścieni cukrów są
ułożone prostopadle względem zasad;
" Średnica helisy wynosi 2,0 nm. Odległość między zasadami
wynosi 0,34nm. Zasady są skręcone względem siebie pod
kÄ…tem 36 stopni;
" Dwa łańcuchy łączą się ze sobą wiązaniami wodorowymi
między zasadami tworzącymi komplementarne pary;
" Kolejność zasad nie jest w żaden sposób ograniczona. Ściśle
określona sekwencja zasad niesie informację genetyczną.
Typ wiązań
- wodorowe  wyst. między zasadami
- fosfodiestrowe  Å‚Ä…czy nukleotydy
- N-glikozydowe  czÄ…steczki cukru z
zasadÄ… azotowÄ…
Nukleosom
" Kompleks - składający się z DNA jądrowego owiniętego wokół 4 par niewielkich zasadowych
białek-histonów (piąty rodzaj histonu wiąże wolne odcinki DNA pomiędzy nukleosomami)
" podstawowa jednostka strukturalna fibryli chromatynowej
Fibryle chromatyny zwinięte są w spiralą strukturę zwaną solenoidem.
Chromatyna  między podziałowa postać materiału gen. u organizmów eukariotycznych w jądrze
kom.
U eukariontów DNA występuje w kompleksie zwanym
chromatynÄ…
" Replikacja zapewnia wierne przekazywanie
informacji zawartej w DNA, zarówno z komórki
macierzystej do komórek potomnych w mitozie,
jak i z jednego pokolenia na kolejne w procesie
mejozy;
" Błędy zachodzące podczas replikacji
umożliwiają zachodzenie procesu ewolucji
" Częstotliwość błędów: jeden na około 10 000
000 zasad do jednego na 1 000 000 000 zasad.
Zasada replikacji DNA
Podwójna nić ulega
skopiowaniu;
Replikacja jest
semikonserwatywna
(półzachowawcza) - w każdej z
dwóch uzyskanych podwójnych
nici DNA będzie jedna nić nowa
i jedna macierzysta
Replikacja DNA jest elementem cyklu komórkowego
Replikacja DNA
enzymy uczestniczÄ…ce w procesie
topoizomerazy  rozplatają podwójną helisę DNA, udostępniając w ten
sposób matrycę dla enzymów replikacyjnych lub transkrypcyjnych.
topoizomeraza I - hydroliza jednego wiązania - nacięcie jednej nici,
topoizomerazy II - hydroliza dwóch wiązań - nacięcie obu nici,
,
helikazy - rozrywają wiązania wodorowe między nićmi matrycowego DNA,
rozkręcając helisę i umożliwiając rozpoczęcie procesu;
prymaza  polimeraza RNA zależna od DNA, syntetyzuje startery
rybonukleotydowe;
polimeraza DNA - polimeryzuje zgodnie z zasadą komplementarności
DNA
fosforany deoksyrybonukleotydów;
egzonukleaza - usuwa startery RNA z nici;
ligaza DNA  Å‚Ä…czy fragmenty Okazaki;
białko SSB (ang. single strand binding protein) stabilizuje jednoniciowe
(rozplecione) odcinki DNA
białko "ruchomej obręczy" wiąże polimerazę DNA z nicią DNA. Na nici
opóz
nionej, każdorazowo po zakończeniu syntezy fragmentu Okazaki
uwalnia polimerazÄ™ DNA.
Polimeraza DNA
" najważniejszy enzym replikacji DNA.
" Ma aktywność syntetazy w kierunku 5' -- >3' nowej nici tzn.
dobudowuje nukleotydy DNA w tym kierunku.
" Jednocześnie posiada aktywność nukleazy w kierunku 3' -- >5',
dzięki czemu może cofać się i wycinać z
le wstawiony przez siebie
nukleotyd i zastąpić go prawidłowym. Dzięki tej aktywności
polimeraza DNA koryguje swoje błędy co nazywa się
redagowaniem.
" Dobudowuje brakujące fragmenty DNA, na nici opóz
nionej, po
wycięciu starterów RNA
Replikacja DNA
" Zaczyna siÄ™ zawsze w konkretnych miejscach, zwanych miejscami
inicjacji replikacji (ang. origin)
" Od tego miejsca replikacja zazwyczaj przebiega równocześnie w
dwóch kierunkach-widełki replikacyjne przesuwają się w prawo i
lewo, aż połączą się wszystkie oczka replikacyjne.
ORI (Origins of replication)
Specyficzna sekwencja 200 pz jest minimalnÄ… sekwencja wymaganÄ… do
inicjacji replikacji chromosomowego DNA.
U ssaków inicjacja (ORI) obejmuje sekwencję 10 000 pz
U roślin sekwencje ORI nie są zidentyfikowane
W chromosomach istnieje wiele potencjalnych ORI, ale nie wszystkie
funkcjonują w każdej komórce
Fragment DNA replikowany z jednego ORI nosi nazwę replikonu ( u roślin
długość replikonu to przeciętnie 50-70 kb)
Nie wszystkie ORI startujÄ… w tym samym momencie, jednak porzÄ…dek ich
uruchamiania jest w komórkach ściśle kontrolowany i zależy od stanu
kondensacji chromatyny w danym miejscu.
Inicjacja
(replikacja zaczyna się jednocześnie w wielu miejscach)
Miejsca startu replikacji
Bańki replikacyjne
I etap - Inicjacja
I etap - Inicjacja
" replikacja rozpoczyna się w ściśle określonym miejscu, które nazywa
siÄ™ origin (ori) lub (O)  specjalny odcinek o specyficznej sekwencji
nukleotydów (200-300par) (u prokariotów 1 takie miejsce, u
eukariontów wiele nawet kilka tysięcy)
" w miejscach ori nici DNA pod wpływem białka enzymatycznego
helikazy rozdzielają się (rozrywanie wiązań wodorowych) i tworzą tak
zwane oczko replikacyjne. Replikacja przebiega w 2 kierunkach, widełki
replikacyjne przesuwaja się w lewo i w prawo tak długo aż połączą się
wszystkie oczka replikacyjne.
" następnie syntetyzowane są krótkie (do 10 nukleotydów) odcinki RNA
tzw. startery (primery) przez enzym prymazę ponieważ enzym
prymazÄ™
polimeraza DNA potrafi dobudowywać trifosforany nukleozydów tylko
do już istniejących fragmentów dwuniciowych.
Kontrola inicjacji
" Licencjonowanie (kontrola pozytywna)  zapewnia, że chromosomy
będą się replikować tylko wtedy, gdy w sposób prawidłowy przejdą
przez mitozę i znajda się w komórce potomnej.
" Aby nastąpiła inicjacja, do ORI musi się przyłączyć Kompleks
RozpoznajÄ…cy Origin (ORC  Origin Recognition Complex) i
dodatkowe białka (czynniki licencjonujące Cdc-6 i Cdt-1)
umożliwiające ścisłe pokrycie sąsiadującego DNA białkami MCM
(Minichromosome Maintenance). Tylko DNA pokryty białkami MCM
może być replikowany. Białka MCM są usuwane przez
przesuwające się widełki replikacyjne.
Licencjonowanie w ORI
Negatywna kontrola inicjacji - Geminina
" Geminina  białko występujące w komórkach w fazie G2
" Przeciwdziała przyłączaniu się białek MCM do świeżo
zreplikowanego DNA (zablokowanie czynnika Cdt-1)
" Jest degradowana po zakończeniu mitozy
" Gemininy nie wykryto w drożdżach i roślinach!
Kontrola inicjacji w cyklu komórkowym
Widełki replikacyjne
Przyłączanie deoksyrybonukleotydów przez polimerazę DNA
II  Elongacja
II  Elongacja
" w widełkach replikacyjnych na nici o polarności 3`5` powstaje nowa nić o
kierunku 5`3` w sposób ciągły. Powstała nić potomna to nić wiodąca.
" natomiast na nici 5`3` syntetyzowane są krótkie (liczące około kilkuset
nukleotydów) odcinki w kierunku 5`3` odcinki te nazwano fragmentami
Okazaki. Syntetyzowana nić to nić opóz
niona.
III  Terminacja
III  Terminacja
" Zachodzi gdy z wszystkich widełek replikacyjnych zostają usunięte startery
(przez odpowiednie nukleazy). Polimeraza uzupełnia brakujące odcinki DNA, a
Polimeraza
ligaza Å‚Ä…czy fragmenty nici DNA.
ligaza
" Następuje odłączenie kompleksu od nici DNA. Błędy replikacyjne wyłapuje i
naprawia polimeraza DNA. (replikacja DNA z uwzględnieniem systemu korekty
polimeraza DNA
= 1 błędnie wstawiony nukleotyd na miliard 1 000 000 000)
Telomery  końcowe odcinki DNA. Przy każdym podziale skracają się, jak już
skrócą się maksymalnie komórka przestaje się dzielić
Telomeraza  enzym który wydłuża telomery przez co komórki mogą się ciągle
Telomeraza
dzielić.
Aktywność telomerazowa -replikacja końców
chromosomów (telomerów)
Szybkość replikacji
" Bakteria 1000pz/ sek
" Człowiek 100pz/ sek
Czas trwania replikacji całego DNA:
" Bakteria 40 min
" Komórki człowieka 6-12 godz.
Dokładność replikacji
" 1 błąd /miliard pz
" Polimeraza DNA wykazuje aktywność
korektorskÄ…
Niektórych błędów nie da się skorygować
Liczba kopii powielanego fragmentu wzrasta wykładniczo 2n (n-liczba
przeprowadzonych cykli powielania)
Zastosowanie reakcji PCR:
1) diagnostyka chorób dziedzicznych oraz zakażeń wirusowych i
bakteryjnych
2) modyfikacja powielanej sekwencji poprzez użycie nie całkiem
komplementarnych primerów (tzw. ukierunkowana mutageneza)
3) namnażanie DNA ze szczątków ludzi lub organizmów wymarłych
dawno temu
4) w kryminalistyce do identyfikacji ze śladów pozostawionych na
miejscu przestępstwa
5) w sÄ…downictwie przy ustalaniu ojcostwa
6) do ilościowego oznaczania zawartości sekwencji namnażanej
matrycy w próbce
Przyczyny uszkodzeń DNA i ich efekty
" Tlen, wolne rodniki
" Przerwanie łańcucha
" UV
" Modyfikacje chemiczne zasad
" ZwiÄ…zki alkilujÄ…ce
" włączanie niesparowanych zasad
w trakcie replikacji
" Spontaniczna deaminacja (C do
U)
Uszkodzenia DNA - przykłady
Systemy naprawy DNA
" Wycięcie nukleotydów
" System helikazy XPA (Xerdoerma
" (dimery pirymidyn, aberracje struktury) pigmentosum)
" Naprawa błędnie sparowanych
" Homologi bakteryjnych białek typu
nukleotydów (mylnie sparowane
Mut
zasady)
" Glikozylaza DNA, polimeraza ´
" Naprawa przez wycięcie zasad
(nietypowe  hipoksantyna, uracyl-,
zalkilowane zasady)
" Naprawa bezpośrednia
" Guanino-6-metylotransferaza
(metyloguanina, dimery pirymidyn)
Rekombinacja DNA
" Gra ważną rolę w podziale mejotycznym komórek (zapewnia
zróżnicowanie genetyczne gamet) i, na dłuższą metę - w ewolucji
(rearanżacje sekwencji DNA umożliwiają nowe kombinacje
sekwencji, które mogą generować nowe rodzaje RNA i białek,
wpływając na fenotyp).
" Mechanizmy rekombinacji są powiązane ściśle z mechanizmami
replikacji i naprawy
Rekombinacja w podziałach mejotycznych
Rodzaje rekombinacji
" Rekombinacja homologiczna występuje pomiędzy długimi
sekwencjami, które zawierają rejony w dużym stopniu do siebie
podobne (np. rekombionacja mejotyczna). Wymaga białek typu
RecA; katalizują one reakcję przeniesienia nici, która umożliwia
jednoniciowemu fragmentowi wniknięcie w strukturę dwuniciową w
rejonie homologii (powstaje przejściowa struktura trójniciowa).
" Rekombinacja miejscowo specyficzna (np. rearanżacja genów
immunoglobulin) występuje w specyficznych loci, nie wymaga
długich rejonów homologii ani białek typu RecA. Wymaga białka
rekombinazy (integrazy) i krótkich sekwencji palindroomowych w
DNA donorowym i akceptorowym.
" Rekombinacja nieuprawniona może zachodzić w obecności krótkich
rejonów homologicznych (udział polimerazy RNA), a także przy
braku jakiejkolwiek homologii (np. integracja do genomów roślin)
(udział gyrazy, tj. topoizomerazy II).
Struktura Hollidaya  etap pośredni w rekombinacji
homologicznej