REPLIKACJA
REPLIKACJA - Podstawowy proces umo\
liwiający dokładne skopiowanie
całkowitej informacji zawartej w genomie, która następnie zostaje przekazana
komórkom potomnym.
Obie nici rodzicielskie - matryca dla nici potomnych
Mechanizm replikacji jest SEMIKONSERWATYWNY.
Ka\
da nić podwójnej helisy DNA niesie tę samą informację, dlatego obie nici
rodzicielskie mogą słu\
yć jako matryca do syntezy nowej komplemetarnej nici
potomnej. Po zakończeniu syntezy powstają dwie identyczne kopie genomu, przy
czym jedna nić pochodzi z komórki rodzicielskiej a druga jest
nowozsyntetyzowaną nicią potomną. Nowopowstałe cząsteczki podczas podziału
komórkowego zostają przekazane do dwóch komórek potomnych.
Podwójna helisa rodzicielska
Widełki
replikacyjne
replikacyjne
Brown, Genomy, 2001, Rys 12.1
Dwie helisy potomne
Proces replikacji DNA mo\
na podzielić na trzy etapy:
1. Incjacja
2. Elongacja
3. Terminacja.
Miejsce inicjacji replikacji Ori (ang. origine)
widełki replikacyjne - ruch w przeciwnych kierunkach
REPLIKON - fragment DNA replikujący jako pojedyncza cząsteczka.
Kolisty chromosom bakteryjny - jeden replikon,
Kolisty chromosom bakteryjny - jeden replikon,
Chromosom eukariotyczny - wiele miejsc inicjacji
Inicjacja replikacji
Inicjacja replikacji u Prokaryota
w obrębie oriC występują:
- 9-cio nukleotydowe fragmenty (pięciokrotnie powtórzone)
- 13-sto nukleotydowe fragmenty  bogate w pary A-T
Mechanizm inicjacji u E.coli
(A) Struktura miejsca inicjacji oriC
sekwencje 13-nukleotydowe sekwencje 9-nukleotydowe
miejsca wiązania białka DnaA
miejsca wiązania białka DnaA
(B) Topnienie struktury helisy
region podlegający topnieniu
kompleks DnaA w kształcie baryłki
Brown, Genomy, 2001, Rys 12.7
Mechanizm inicjacji u E.coli
Do powstałego oczka przyłączają się białka DnaB-DnaC.
" DnaC - przenośnik
" DnaB  helikaza odpowiedzialna za przerywanie wiązań
wodorowych pomiędzy zasadami dwóch nici łańcucha DNA.
Wykształcenie  oczka replikacyjnego
i uformowanie aktywnych widełek replikacyjnych kończy
fazę inicjacji.
Replikacja kolistego chromosomu bakteryjnego
Replikacja chromosomu eukariotycznego
u dro\
d\
y: ok. 300 miejsc inicjacji; długość replikonu ~ 40 kpz
u człowieka: ok. 20 000 miejsc inicjacji, długość replikonu 40 - 200 kpz
Mechanizm inicjacji u dro\
d\
y
Miejsce inicjacji replikacji u dro\
d\
y ARS (ang. Autonnomously
Replicating Sequence) (ok. 200pz);
obejmuje subdomeny A, B1, B2, B3.
- A i B1 - wią\
ą kompleks rozpoznający ORC (ang. Origin
- A i B1 - wią\
ą kompleks rozpoznający ORC (ang. Origin
Recognition Complex);
- B2 - miejsce rozplatania helisy
- B3 - wiązanie czynnika białkowego ABF1
Replikony mogą ulegać replikacji tylko raz w trakcie cyklu
komórkowego!
Mechanizm inicjacji u dro\
d\
y
(A) Struktura dro\
d\
owego miejsca inicjacji replikacji
20 bp
B3 B2 B1 A
Origin recognition
Origin recognition
sequences
(B) Proces topnienia helisy
region podlegający topnieniu
ABF1 ORC
ABF1 - ARS binding factor 1
Brown, Genomy, 2001, Rys 12.8
Inicjacja replikacji u wy\
szych eukariotów
" Brak sekwencji ARS
" Strefy inicjacyjne o dł. do 10 000 pz w obszarach
międzygenowych
" Replikacja zaczyna się wewnątrz ka\
dej strefy, w obrębie
" Replikacja zaczyna się wewnątrz ka\
dej strefy, w obrębie
jednego odcinka DNA o dł. 200-500 pz
" Podczas ró\
nych rund replikacyjnych odcinki te
występować mogą w ró\
nych miejscach strefy replikacyjnej
Schemat aktywacji miejsc inicjacji replikacji
u wy\
szych eukariotów
Elongacja
Polimeraza DNA:
-Synteza nici DNA - tylko w kierunku 5  > 3 ,
-Obecność tzw. startera,
- Substraty - 5 -trifosforany deoksyrybonukleotydów (dATP, dCTP,
- Substraty - 5 -trifosforany deoksyrybonukleotydów (dATP, dCTP,
dGTP, dTTP).
dGTP, dTTP).
- Aktywność 3  > 5 egzonukleazy, umo\
liwia naprawę błędów przypadkowo
popełnionych podczas syntezy
- Aktywność 5  > 3 egzonuklezy - niektóre.
Faza Elongacji:
- Jedna nić syntetyzowana w sposób ciągły - tzw. nić wiodąca.
- Druga nić  synteza nieciągła: fragmenty Okazaki  tzw. nić opóz
niona.
U bakterii długość fragmentów Okazaki: 1000 - 2000 pz.
U bakterii długość fragmentów Okazaki: 1000 - 2000 pz.
W komórkach eukariotycznych: 100 - 200 pz.
Białka zaanga\
owane w proces replikacji u bakterii:
-helikaza -rozplata podwójną helisę DNA
- białka wią\
ące jednoniciowy DNA SSB - stabilizują jednoniciowe obszary DNA,
-prymaza - enzym syntetyzujący startery RNA
-polimeraza DNA III - prowadzi syntezę obu nici DNA wiodącej i opóz
nionej
Polimeraza DNA III nie posiada aktywności egzonukleolitycznej 5  >3 , nie mo\
e
usuwać starterów RNA, dlatego po odłączeniu enzymu od nici opóz
nionej, przyłącza
się polimeraza DNA I, która usuwa sekwencje starterowe i uzupełnia brakujący
fragment łańcucha wydłu\
ając koniec 3 poprzedniego fragmentu Okazaki.
- polimeraza DNA I - usuwa startery (aktywność egzonukleazy 5  > 3 ) i
dobudowuje brakujący fragment
-ligaza DNA - łączy rozdzielone fragmenty powstałe na matrycy opóz
nionej
Brakujące wiązanie fosfodiestrowe uzupełnia ligaza DNA.
-topoizomeraza (gyraza)  wprowadza ujemne superskręty
Synteza DNA
Dwie nici helisy DNA mają przeciwną polarność, a wszystkie polimerazy DNA katalizują
dodawanie nukleotydów do grupy hydroksylowej końca 3` rosnącego łańcucha DNA, tak
więc nici DNA mogą powstawać wyłącznie w kierunku 5`3`.
Replikacja u Procaryota
Prymosom - kompleks zło\
ony z DnaB i Prymazy DNA
Replisom - kompleks polimerazy III i prymosomu
Replikacja u Eukariota
- DNA ulega replikacji tylko podczas fazy S!
" euchromatyna  wczesna faza S,
" heterochromatyna - póz
na fazie S,
" na końcu  centromery i telomery.
- DNA musi zostać odwinięte z nukleosomów,
- DNA musi zostać odwinięte z nukleosomów,
- białko replikacyjne A (RPA ang. Replication Protein A)  stabilizuje
jednoniciowe DNA
- Polimeraza DNA ą  posiada aktywność prymazy, synteza starterów.
- Polimeraza DNA � oddziaływuje z białkiem PCNA (ang. Proliferating
Cell Nuclear Antigen).
Ligazy DNA
Ligazy DNA  enzymy syntetyzujące wiązanie fosfodiestrowe
między sąsiadującymi grupami 3`-OH i 5`-P nukleotydów
połączonych wiązaniami wodorowymi z matrycową nicią DNA
jako część procesów replikacji, naprawy i rekombinacji DNA
Zale\
ność od kofaktorów:
- enzymy NAD-zale\
ne: ligazy bakteryjne
- enzymy ATP-zale\
ne: ligazy eukariontów i wirusów
(np. bakteriofagów)
Terminacja
Terminacja replikacji DNA
- sekwencje terminatorowe - wiązanie białka Tus
- potomne cząsteczki DNA rozłączone przez topoizomerazę IV,
- W komórkach eukariotycznych nie znaleziono sekwencji odpowiada-
- W komórkach eukariotycznych nie znaleziono sekwencji odpowiada-
jących s. terminatorowym, ani białek podobnych do białka Tus.
Prawdopodobnie terminacja ma miejsce po połączeniu się sąsiednich
widełek replikacyjnych.
Terminacja replikacji DNA u E. coli
Brown, Genoms, 2006, Ryc 13.22
Polimerazy DNA
Polimerazy DNA E. coli
Polimeraza III DNA E. coli
Hipotetyczny obraz struktury dimeru holoenzymu
polimerazy III DNA
Eukariotyczne polimerazy DNA
Funkcje eukariotycznych polimeraz
Mutacje i naprawa DNA
I. Mutacje punktowe - zmiana jednej zasady
1) Substytucje - (podstawienia)
a) TRANZYCJE - zamiana puryny w purunę, lub pirymidyny w
a) TRANZYCJE - zamiana puryny w purunę, lub pirymidyny w
pirymidynę: A G, G A, C T lub T C.
b) TRANSWERSJE - zmiany puryny w pirymidynę lub pirymidyny w
purynę: A C, A T, G C, G T, C A, C G,
T A, T G.
Substytucje mogą prowadzić do:
- zmiany funkcji białka
- utraty funkcji białka
Mutacje ciche - gdy nie powodują zauwa\
alnych efektów
Mutacje minisensowne - gdy dochodzi do zmiany kodowanego
Mutacje minisensowne - gdy dochodzi do zmiany kodowanego
aminokwasu
aminokwasu
zamiana synonimiczna - nowy kodon odpowiada
temu samemu aminokwasowi
zamiana niesynonimiczna  dochodzi do zamiany
aminokwasu
Mutacje nonsensowne - gdy dochodzi do wprowadzenia kodonu stop
niesynonimiczna
nonsens
pominięcie stop
synonimiczna
2) Delecje - usunięcie jednej lub większej liczby par zasad
3) Insercje - wstawienie jednej lub większej liczby par zasad
Delecje i insercje często nazywane są mutacjami zmiany fazy.
Mutacje zachodzące w komórce mogą spowodować znaczące skutki od
Mutacje zachodzące w komórce mogą spowodować znaczące skutki od
zaburzenia prawidłowego działania po śmierć komórki.
Mutacje są równie\
przyczyną chorób genetycznych i powstawania
nowotworów.
Mutacje mogą powstawać na dwa sposoby:
1) spontanicznie - jako błędy podczas replikacji
2) pod wpływem mutagenu
Aby zwiększyć dokładność replikacji polimeraza DNA posiada:
- mechanizm selekcji nukleotydów
- aktywność egzonukleazy 3  >5
Szybkość zachodzienia mutacji spontanicznych u Escherichia coli
wynosi ok. jednego błedu na 1010 dodawanych nukleotydów.
Mutacje spontaniczne mogą pojawiać się równie\
na skutek
występowania izomerów strukturalnych zasad azotowych tzw.
TAUTOMERÓW .
Tworzenia błędnych par
przez tautomery.
keto-tymina
Przemiana tautomeryczna
tworzy parę
z G zamiast A
enol-tymina
amino-adenina
Przemiana tautomeryczna
tworzy parę
z C zamiast T
imino-adenina
keto-guanina
Przemiana tautomeryczna
tworzy parę
z T zamiast C
enol-guanina
Rodzaje czynników środowiskowych uszkadzających \
ywe komórki:
KARCYNOGEN - wywołuje nowotworzenie- transformację neoplastyczną
komórek eukariotycznych
KLASTROGEN - powoduje fragmentowanie chromosomów
MUTAGEN - powoduje mutacje
MUTAGEN - powoduje mutacje
PROMOTOR NOWOTWORU - powoduje rozwój nowotworu
TERATOGEN - powoduje zaburzenia w rozwoju
Według: Twyman (1998)
Mutageny to czynniki fizyczne lub chemiczne, które powodują mutacje.
Mutageny chemiczne:
- Analogi zasad - np. 5-bromouracyl (analog tyminy, przewa\
a forma
enolowa tworząca parę z G zamiast A) lub
2-aminopuryna (analog adeniny, przewa\
a forma
iminowa tworząca parę z C zamiast T)
- Czynniki deaminujące - tj. kwas azotowy deaminujący adeninę,
cytozynę i guaninę, lub dwusiarczan sodowy
działający na cytozynę.
działający na cytozynę.
- Czynniki alkilujące - np. metanosulfonian etylowy (EMS), dodają grupy
alkilowe do nukleotydów w cząsteczkach DNA.
Efekt zale\
y od pozycji w jakiej zostanie
zmodyfikowany nukleotyd jak i od rodzaju
dodanej grupy alkilowej.
- Czynniki interkalujące - np. bromek etydyny, mogą wsuwać się
pomiędzy pary zasad w podwójnej helisie,
zwiększając odległość między nimi (mutacje
typu insercji).
5-Bromouracyl
Tworzenie par komplementarnych przez 5-bromouracyl
5-bromouracyl Adenina 5-bromouracyl Guanina
tautomer ketonowy tautomer enolowy
Właściwości mutagenne 5-bromouracylu
powrót do tautomeru ketonowego
przemiana
tautomeryczna
insercja
5-bromouracylu
zmutowana cząsteczka
Czynniki deaminujące i błędne parowanie.
Deaminacja
Adenina Hipoksantyna
Hipoksantyna tworzy parę z C zamiast T.
Bromek etydyny
Bromek etydyny i działanie.
Efekt mutagenny
EtBr
Mutageny fizyczne:
- Promieniowanie nadfioletowe (UV) - indukuje dimeryzację
sąsiadujących ze sobą zasad pirymidynowych,
zwłaszcza tymin.
- Promieniowanie jonizujące - (np. promieniowanie X czy ł) w zale\
ności
od rodzaju i natę\
enia wywierać mo\
e
mutacje punktowe, delecje lub insercje.
Mo\
e działać bezpośrednio na DNA lub
pośrednio uczestnicząc w tworzeniu
pośrednio uczestnicząc w tworzeniu
aktywnych cząsteczek jak nadtlenki.
- Ciepło - w obecności wody stymuluje odłączenie zasady (zazwyczaj
purynowej) od grupy cukrowej, co prowadzi do powstania luki,
która rzadko ale mo\
e być wypełniona błędnym nukleotydem.
Naprawa DNA
Kategorie systemów naprawy:
1) Systemy naprawy bezpośredniej - działają na uszkodzone nukleotydy
przywracając oryginalną strukturę.
2) Naprawa z wycinaniem zasad - usunięcie uszkodzonej zasady
azotowej, wycięcie krótkiego fragmentu wokół i ponowna synteza przez
polimerazę DNA.
polimerazę DNA.
3) Naprawa z wycinaniem nukleotydów - podobnie jak w poprzednim
przypadku z tym, \
e rozpoczęte wycięciem całego nukleotydu.
4) Naprawa niedopasowanych nukleotydów - wycięcie fragmentu
jednoniciowego DNA z niewłaściwym nukleotydem i wypełnienie luki.
5) Naprawa rekombinacyjna - wykorzystana do naprawy dwuniciowych
przerw DNA.
1) Systemy naprawy bezpośredniej
- pęknięcia (spowodowane np. przez promieniowanie jonizujące) mogą być
naprawiane przez ligazę DNA; ligaza mo\
e działać gdy przerwane jest
wiązanie fosfodiestrowe bez uszkodzenia grupy 3 -hydroksylowej i 5 -
fosforanowe
- niektóre formy uszkodzenia przez alkilację są odwracalne dzięki
aktywności enzymów tj. alkilotransferaza usuwająca grupy alkilowe z
O6-alkiloguaniny;
- fotoreaktywacja - to proces naprawy dimerów cyklobutylowych,
zale\
ny od światła, prowadzony przez enzym fotoliazę DNA;
2) Wycinanie zasad
- glikozydaza DNA przecina wiązanie �-N-glikozydowe
- zasada jest usuwana i powstaje tzw. miejsce AP
- zasada jest usuwana i powstaje tzw. miejsce AP
- endonukleaza AP przecina DNA w tych miejscach, a dzięki aktywności
egzonukleazowej mo\
e poszerzyć przerwę do luki
- wypełnienie brakującego fragmentu przez polimerazę DNA
- przywrócenie ciągłości poprzez działanie ligazy DNA,
Usuwanie uszkodzonej zasady przez glikozydazę DNA
DNA
glikozydaza
Uszkodzona
zasada jest
odcinana
Schemat szlaku
Uszkodzony nukleotyd
DNA glikozydaza
miejsce AP
endonukleaza AP, prawdo-
podobnie z fosfodiesterazą
jednonukleotydowa luka
polimeraza DNA +
ligaza DNA
3) Naprawa z wycinaniem nukleotydów
Endonukleaza przecina precyzyjnie nić DNA po obu stronach
uszkodzenia w miejscach oddalonych o określoną liczbę nukleotydów.
Uszkodzony fragment jest usuwany i odtwarzany jak w poprzednim
przypadku na matrycy drugiej nici.
Przykładem kompleksu zaanga\
owanego w ten proces naprawy jest
Przykładem kompleksu zaanga\
owanego w ten proces naprawy jest
endonukleaza UvrABC.
U Eucaryota naprawa przez wycinanie sprzę\
ona jest z transkrypcją
dzięki czemu nici genów słu\
ące jako matryca do syntezy RNA są
naprawiane szybciej ni\
rejony nie ulegające transkrypcji.
Uszkodzony nukleotyd
zniekształca helisę
Obszar stopiony
Miejsce
cięcia
Wycięcie uszkodzonego obszaru
Polimeraza DNA + ligaza DNA
4) Naprawa niedopasowanych nukleotydów
- rozpoznanie braku komplementarności pomiędzy nicią
matrycową a potomną.
- fragment nici potomnej musi być wycięty i zsyntetyzowany na nowo
System naprawczy musi rozró\
nić te nici. U E.coli umo\
liwia to fakt i\

nić potomna jest słabiej zmetylowana w stosunku do nici matrycowej.
Proces metylacji na nici potomnej jest opóz
niony w stosunku do
replikacji, co daje czas systemowi naprawczemu na wyszukiwanie
niedopasowanych nukleotydów i wprowadzenie poprawek.
niedopasowanie w cząsteczce potomnej
grupa metylowa
przyłączenie MutH i MutS
MutH nacina DNA
odłączenie i usunięcie nici
odłączenie i usunięcie nici
egzonukleaza
helikaza DNA II
polimeraza DNA + ligaza DNA