y
ródła uszkodzeń DNA
" Endogenne uszkodzenia DNA: błędy powstające w czasie
replikacji DNA, stres oksydacyjny (metabolizm tlenowy,
Naprawa DNA
reaktywne formy tlenu, peroksydacja lipidów)
Wykład 8 " Czyniki środowiskowe - egzogenne: promieniowanie
ultrafioletowe, promieniowanie jonizujące gamma i X,
mutageny chemiczne (zanieczyszczenie środowiska, palenie
tytoniu
Następstwa uszkodzeń DNA
Unikanie uszkodzeń DNA
" Zmiany w sekwencjach kodujących i regulacyjnych prowadzą do
powstania białek nieaktywnych, o zmienionej aktywności lub
" Mechanizmy usuwające reaktywne formy tlenu
braku białka.
" Akumulacja mutacji w wyniku dużego natężenia czynnika
mutagennego lub obniżenia aktywności systemów naprawy DNA " Enzym dUTPaza, która uniemożliwia wprowadzanie dUMP do DNA
prowadzi do nowotworów i starzenia organizmu.
" Mutacje w komórkach linii zarodkowej są dziedziczone i się
" Melanina w skórze jako ekran ochronny przeciwko UV
rozprzestrzeniają; powstają dziedziczne choroby genetyczne.
" Uszkodzenie DNA na dużą skalę prowadzą od razu do śmierci;
choroba popromienna.
Dowód na istnienie naprawy DNA
Uszkodzenia DNA są wydajnie naprawiane
i tylko niektóre uszkodzenia są mutagenne,
ale wraz ze wzrastającą dawką rośnie liczba mutantów
~100
1.0
Uszkodzeń jest zbyt dużo, aby
0.1
Przeżywalność po UV = S mogły być naprawione; mutanty
Przeżywalność = So
również zaczynają być zabijane
S/So 0.01
1.0
Częstość
0.001
0.1
mutacji
0.0001
S/So 0.01
Częstość
mutacji
0.001
Przeżywalność po UV = S
Przeżywalność = So
Dawka UV
0.0001
Rzadkie mutanty,
które są oporne
Krzywa przeżywalności nie jest liniowa: przy niskich dawkach UV przeżywalność na UV
jest wysoka, a przy wyższych dawkach w pewnym momencie przeżywalność Dawka UV
gwałtownie spada; przy bardzo wysokich dawkach pojawiają się komórki bardziej
oporne. Częstość mutacji natomiast najpierw wzrasta, a potem maleje. Jak
Mutant bez naprawy DNA
interpretować takie krzywe?
Rodzaje naprawy DNA u eukariontów
Rodzaje uszkodzeń DNA
" Aktywność egzonukleolityczna w kierunku 3 -5 polimerazy DNA
" Bezpośrednia naprawa uszkodzeń (reversion repair, RR)
" Naprawa niedopasowanych nukleotydów (Mismatch Repair, MR)
" Naprawa przez wycinanie zasad (Base Excision Repair, BER)
" Naprawa przez wycinanie nukleotydów (Nucleotide Excision Repair, NER)
Jednoniciowe Dwuniciowe
Zablokowane Dimery TT
" Niehomologiczne łączenie końców (Non-Homologous End Joining, NHEJ)
fragmenty złamania
widełki
Alkilacja
Jednoniciowe
DNA DNA
replikacyjne
DNA " Homologiczna rekombinacja (Homologous Recombination, HR)
pęknięcia
Naprawa błędów podczas replikacji Bezpośrednia naprawa uszkodzeń
" Częstość mutacji wynosi jedna na 1010 nukleotydów, mimo że
" Jednoniciowe pęknięcia mogą być łączone bezpośrednio przez
polimeraza DNA myli się raz na 108 nukleotydów
ligazę DNA
" Aktywność korekcyjna głównej polimerazy DNA � wycinana
" Alkilowe modyfikacje DNA mogą być usuwane przez specyficzne
błędnie wprowadzane nukleotydy; aktywność egzonukleolityczna
enzymy, np. przez metylotransferazę O6-metyloguaninową
w kierunku odkwrotnym do syntezy DNA, czyli 3 5 ; z
(MGMT), która katalizuje w jednej reakcji przeniesienie grupy
polimerazę DNA � współdziała kompleks PCNA, który
metylowej z metyloguaniny (łączy się z T zamiast z C) na grupę
przytrzymuje polimerazę DNA do matrycy
cysteinową w centrum aktywnym enzymu, co inaktywuje enzym i
" Inne polimerazy DNA � i � biorą udział bezpośrednio w naprawie
kieruje enzym do ubikwitynacji i degradacji; ludzki enzym MGMT
uszkodzeń DNA napotkanych przez widełki replikacyjne;
jest homologiem bakteryjnego białka Ada
dokładny mechanizm nieznany
Bezpośrednia naprawa uszkodzeń -
Naprawa niedopasowanych nukleotydów
fotoliaza
(Mismatch Repair, MR)
Światło
" Mechanizm ten naprawia błędy zrobione
przez polimerazę DNA (stąd wynika
Replikacja
różnica między częstością mutacji
wprowadzanych przez polimerazę DNA in
vitro i in vivo) oraz powstałe w wyniku
Fotoreaktywacja
deaminacji, oksydacji i metylacji zasad
Przez krótki czas
nowa nić DNA nie jest
(zmiany we właściwościach parowania
metylowana
zasad)
" Metylowane są reszty adeniny na N6
oraz cytozyny; metylaza Dam rozpoznaje
Dimer cyklobutylowy
Po kilku minutach nowa nić DNA
Fotoliaza zawiera dwa chromofory flawinowy FADH sekwencje GATC oraz CCA/TGG
pomiędzy sąsiadującymi ulega metylacji; nowa i stara nić
oraz folianowy MTHF. Enzym przyłącza się do są nie do odróżnienia.
pirymidynowymi zasadami
" U eukariontów DNA nie jest tak często
dimeru, ale staje się aktywny dopiero pod wpływem
światła widzialnego: MTHF absorbuje foton i
metylowane i nowa nić może być
przekazuje energię wzbudzenia do FADH- , który
przekazuje elektron do dimeru generując anion rozpoznawana dzięki przerwom z nowej
dimeru, który przekształca się w pirymidyny, a
nici DNA
elektron powraca do FADH.
Naprawa niedopasowanych nukleotydów Naprawa przez wycinanie zasad (Base
(Mismatch Repair, MR) Excision Repair, BER)
Rozpoznanie uszkodzenia DNA
" BER jest odpowiedzialny za usuwanie zmodyfikowanych zasad, które są
(kompleks MutSą: MSH2 i MSH6)
rozpoznawane przez specyficzne enzymy zwane glikozylazami DNA
Rozpoznanie zmienionej nici DNA
" Rodzaje uszkodzeń: utlenione zasady (powstają spontanicznie w wyniku
(towarzyszy temu hydroliza ATP i
co prowadzi do zmiany konformacji
działania rodników tlenowych plus prom. UV i jonizujące), alkilowane
i możliwości ślizgania się po DNA
zasady (endogenne związki alkilujące, karcinogeny np. nitrozoamina)
Przyłączenie komplesku MutLą:
" Przykłady uszkodzeń: uracyl, pofragmentowane i utlenione pirymidyny,
MLH1 i PMS2
N-alkilowane puryny (np. 7-metyloguanina) czy 8-oksoguanina (główna
Translokacja kompleksu oraz
forma utlenionej puryny i jest wysoko mutagenna, bo łączy się z adeniną
przyłączenie ekzonukleazy I
zamiast z guaniną)
" N-alkilowane puryny są podatne na spontaniczną hydrolizę wiązania N-
Zdegradowana nić wraz z
mylnie wstawionym
glikozylowego, co powoduje odłączenie puryny i powstanie miejsca
nukleotydem jest odtwarzana
apurynowego AP
przez polimerazę �
Mutacje w MSH2, PMS2 i MLH1 powodują dziedzicznego niepolipowatego raka jelita grubego.
Naprawa przez wycinanie zasad
Naprawa przez wycinanie nukleotydów
(Base Excision Repair, BER)
(Nucleotide Excision Repair, NER)
" ETAP 1: Rozpoznanie uszkodzenia, usunięcie zasady oraz
przecięcie nici DNA: specyficzna glikozylaza, która
" NER odpowiedzialny jest za usuwanie różnych modyfikacji chemicznych
hydrolizuje wiązanie glikozydowe między zasadą a
Glikozylaza
rybozą (powstaje miesce AP); typ I glikozylazy tylko
zaburzających strukturę DNA
usuwa zasadę natomiast typ II ma aktywność 3 -
" Działanie UV: dimery pirymidynowe, fotoprodukty, międzyniciowe nowe wiązania
Utworzenie endonukleazy (liaza AP) i eliminuje wiązanie
miejsca AP
fosfodiestrowe i powstaje koniec 3 -OH oraz 5 -
poprzeczne
deoksyryboza-5-fosforan (5 -dRP); w przypadku typu I
" Działanie toksyn: przyłączanie do DNA wiązaniami kowalencyjnymi dodatkowych
Przecięcie nici DNA
nić jest przecinana przez endonukleazę AP (APE1)
związków chemicznych
Odsunięcie nici DNA
synteza pierwszego nukleotydu" ETAP 2: odsunięcie nici DNA i synteza pierwszego " Znanych jest około 30-stu białek związanych z NER
nukleotydu (polimeraza �)
" Wyróżniamy dwa szlaki NER: GGR (global genomic repair; naprawa na skalę
genomową, nie związana z transkrypcją) i TCR (transcription-coupled repair;
" ETAP 3 (szlak podstawowy): usunięcie końca 5 -dRP
przez polimerazę � (aktywność liazy AP) oraz połączenie
naprawa związana z transrypcją)
końców dzięki kompleksowi ligaza III  białko XRCC1
" Komórki z uszkodzonym szlakiem NER wykazują nadwrażliwość na promieniowanie
UV; znanych jest kilka zespołów chorobowych z tym związanych: xeroderma
" ETAP 3 (szlak alternatywny): niektóre końce są odporne
na działanie polimerazy � (forma aldehydowa) i wtedy po
pigmentosum (XPA, XPB, XPC, XPD), zespół Cockayne a (mutacje w genach CSA i
jej odłączeniu przyłącza się kompleks polimeraz �/� i
CSB), trichotiodystrofia, zespół wrażliwości na UV (UVSS); wieloobjawowe
PCNA, które wydłużają nić DNA od miejsca AP;
Szlak podstawowy
zespoły chorobowe: zaburzenia neurologiczne, zwiększona zachorowalność na
odstający koniec 5 -dRP zostaje usunięty przez
endonukleazę FEN1, a przerwa w DNA zostaje połączona
nowotwory, starzenie skóry, choroby oczu
Szlak alternatywny przez ligazę I
Naprawa przez wycinanie nukleotydów - TCR
Naprawa przez wycinanie nukleotydów - GGR
Uszkodzenie
Uszkodzenie
" Rozpoznanie uszkodzenia: biorą w tym
udział trzy kompleksy, kolejność i ch
" Uszkodzenie blokuje kompleks
przyłączanie nie jest ostatecznie
polimerazy RNA II podczas transkrypcji
ustalona; są to XPC-HR23B, XPA-RPA
genu
oraz kompleks XPE zbudowany z dimeru
" Przyłączenie białek CSA i CSB oraz
DDB1 i DDB2
TFIIS, których zadaniem jest
" Rozkręcenie DNA: kompleks czynnika
translokacja kompleksu polimerazy RNA
transkrypcyjnego TFIIH zbudowanego z
siedmiu białek (m.in. z XPB i XPD) ma
II z miejsca uszkodzenia i zrobienie
aktywność helikazy DNA
miejsca dla białek naprawczych
" Wycięcie DNA z uszkodzeniem: od
" Przyłączenie białek ERCC1-XPF i XPG,
końca 3 DNA przecina XPG, a z
które wycinają uszkodzony fragment
drugiego końca kompleks ERCC1-XPF
DNA
" Uzupełnienie przerwy w DNA:
" Luka jest wypełniana przez polimerazy i
polimerazy � i � syntetyzują nową nić,
ligazę; kompleks transkrypcyjny
która jest łączona z DNA przez DNA
przyłącza się na nowo
ligazę I
Naprawa przez rekombinację  naprawa
dwuniciowych złamań DNA, które są dla komórki
Struktura i funkcje kompleksu MRN
najgroz
niejsze
" Rozpoznanie dwuniciowego pęknięcia DNA
" Niehomologiczne łączenie końców (Non-Homologous End Joining, NHEJ):
" Obróbka końców: wyrównanie końców do
generuje błędy, dominuje u ssaków i w fazie G0/G1 połączenia na drodze NHEJ lub indukowanie
tworzenia długich jednoniciowych końców dla
" Homologiczna rekombinacja (Homologous Recombination, HR): nie
homologicznej rekombinacji
" Przyłączenie kinazy Atm (Tel1) i promowanie
powoduje zmian w DNA, dominuje u drożdży i w fazach S i G2
fosforylacji histonu H2A
" Białka rozpoznające dwuniciowe złamania DNA inicjują zarówno naprawę
" Przytrzymywanie razem końców złamania
DNA, jak również inicjują sygnał o uszkodzeniu DNA w celu zatrzymania " Przyłączanie kohezyn
" Przez tworzenie długich jednoniciowych
cyklu komórkowego
końców DNA umożliwia przyłączenie ATR
" Pierwszymi białkami lokalizującym dwuniciowe złamanie DNA jest (Mec1) i innych białek odpowiedzi na
uszkodzenia DNA
kompleks MRN (Mre11-Rad50-Nbs1; u drożdży Mre11-Rad50-Xrs2),
" Niezbędny do przyłączania kompleksów
który niezależnie promuje naprawę przez NHEJ i HR
przebudowujących chromatynę
Kompleks MRN oraz ufosforylowany histon H2A
Niehomologiczne łączenie końców (Non-
warunkują przyłącznie kohezyn w obrębie
Homologous End Joining, NHEJ)
uszkodzonego DNA
" Do złamania niezależnie przemieszcza się
kompleks MRN oraz heterodimer Ku70-Ku80
" MRN ma aktywność helikazy, endo i
egzonukleazy; przycina wystające końce 3 ;
końce 5 prawdopodobnie przycina białko FEN-1
" Ku70/80 chroni końce DNA przed trawieniem
egzonukleazami oraz przyłącza podjednostka
katalityczna DNA-PK (kinaza białkowa zależna
od DNA z rodziny ATR i ATM, nie występuje u
drożdży), która jest aktywowana przez
jednoniciowe DNA przy złamaniu
" Do kompleksu Ku70/80 przyłącza się też białko
Artemis, które bierze udział w obróbce końców
DNA
Domena kohezynowa wokół pęknięcia
" DNA-PK aktywuje XRCC4, które tworzy
DNA ma wielkość 100 kb i pełni funkcję
kompleks i aktywuje ligazę IV, która łączy końce
przytrzymywania blisko siebie końców złamania
DNA
Homologiczna rekombinacja (Homologous
Organizacja w czasie i przestrzeni
Recombination, HR)
obróbki dwuniciowe pęknięcia DNA
" Przyłączenie MRN, który indukuje resekcję (degradację jednej
nici DNA) w kierunku 5 -3
" Do końców jednoniciowe DNA przyłącza się Rad52, które może
promować naprawę przez dopasowanie pojedynczych nici DNA
(SSA) na podstawie krótkich mikrohomologii (~30 pz) lub prze
homologiczną rekombinację
Rad52
Rad59 " W SSA biorą udział białka Rad52 oraz Rad59; fragmenty
niehomologiczne są usuwane przez Rad1-10 oraz MSH2 i MSH6;
Rad1-10
generowane są delecje
MSH2 MSH6
" Rad52 o strukturze pierścienia chroni nici przed degradacją
egzonukleolityczną, podobną funkcję ma białko Rpa1 (Rfa1),
które opłaszcza jednoniciowe DNA i razem z Rad52 oraz
przyciąga Rad51
" Rad51 opłaszcza jednoniciowe DNA i tworzy tzw. filamenty
Rad51, który są odpowiedzialne za inwazję DNA do
homologicznej cząsteczki DNA; w interakcje z Rad51 wchodzą
też białka BRCA1 i BRCA2  rola nieznana oraz Rad54, 55, 57 i
59
" Tworzy się struktura Holliday a  struktura heterodupleksu
między homologicznymi niciami, która się następnie
przemieszcza na boki, czemu towarzyszy synteza brakujących
nici. Potem dochodzi do ligacji nowych fragmentów i cząsteczki
DNA się oddzielają
Rola modyfikacji i przebudowy
Rola modyfikacji i przebudowy
chromatyny w naprawie DNA
chromatyny w naprawie DNA
" Przyłączenie ATM i fosforylacja H2AX
Fosforylacja
H2A/H2AX " Do ufosforylowanego H2A przyłączają się
kohezyny oraz kompleks modyfikujący
chromatynę NuA4; następuje acetylacja
histonów
Przyłączanie kompleksów
modyfikujących chromatynę
" Umożliwia to przyłączenie kompleksu INO80,
do miejsca uszkodzenia
który usuwa histony przy złamaniu DNA, aby
mogły być utworzone regiony jednoniciowego
DNA, co ułatwia przyłączanie białek szlaku
Usunięcie histonów ułatwia
odpowiedzi na uszkodzenia DNA i naprawę DNA
przyłączanie białek szlaku
odpowiedzi na uszkodzenia
DNA i naprawę DNA
" Przyłączenie kompleksu TIP60 pozwala na
usunięcie dimerów H2AX/H2B i wstawienie
nieufosforylowanych histonów H2A  wyłączenie
Odtworzenie normalnej
sygnału i odtworzenie normalnej struktury
struktury chromatyny po
chromatyny po zakończeniu naprawy
zakończeniu naprawy
Rola kodu histonowego w wykryciu
Rola białka adaptorowego Rad9
uszkodzenia DNA i jego naprawie
1. Aktywacja Mec1-Ddc2
2. Fosforylacja białka adaptorowego Rad9
3. Ufosforylowany Rad9 może przyłączyć
Rad53
4. Co umożliwia fosforylację Rad53 przez
Mec1
5. Fosforylacja Rad53 aktywuje jego
autofosforylację w wieli miejscach
Naprawa DNA Cykl komórkowy
6. W pełni zaktywowany Rad53 jest
uwalniany
a. Przyłączenie ATM i fosforylacja H2AX
b. Do ufosforylowanego H2A przyłączają się kompleksy
7. Nowa cząsteczka Rad53 może zostać
przebudowujące chromatynę, a przyłączona kinaza ATR
przyłączona  amplifikacja sygnału (drugi
fosforyluje dalej H2AX oraz białka adaptorowe
c. Histony w pobliżu złamania DNA są usuwane przez kompleksy
mechanizm: zwielokrotnienie miejsc
przebudowujące chromatynę, które być może odsłaniają
przyłączenia dla Rad9 w obrębie
zmetylowaną resztę K79 histonu H3
uszkodzenia DNA: fosforylacja H2A i
d. Ufosforylowana seryna H2A zmetylowana lizyna H3 są
miejscami przyłączenia białek adaptorowych, które wzmacniają
odsłonięcie zmetylowanej lizyny 79
sygnał o uszkodzeniu DNA
histonu H3)