R e k o m b i n a c j a D N A w
w e k t o r a c h n p .
p l a z m i d o w y c h :
1 . P r z y g o t o w a n i e
f r a g m e n t u D N A
2 . P r z y g o t o w a n i e w e k t o r a
d o k l o n o w a n i a
3 . L i g a c j a w e k t o r a i
w s t a w k i
4 . W p r o w a d z e n i e
z r e k o m b i n o w a n e g o
D N A d o o d p o w i e d n i e g o
g o s p o d a r z a n p .
t r a n s f o r m a c j a b a k t e r i i
z r e k o m b i n o w a n y m D N A
5 . A n a l i z a t r a n s f o r m a n t w
( s c r e e n i n g )
P r z y g o t o w a n i e f r a g m e n t u D N A
1 . D N A d o k l o n o w a n i a n a j c z [c i e j j e s t t r a w i o n e o d p o w i e d n i m
e n z y m e m r e s t r y k c y j n y m ( a l e m o |e m y t a k |e r e k o m b i n o w a
f r a g m e n t y D N A p o w i e l o n e t e c h n i k P C R )
2 . E l e k t r o f o r e t y c z n a k o n t r o l a j a k o [c i , p o p r a w n o [c i i w y d a j n o [c i
t r a w i e n i a ( l u b a m p l i f i k a c j i , j e [l i f r a g m e n t D N A p o w i e l a m y w
P C R )
O P C J O N A L N I E : O c z y s z c z e n i e p r o d u k t u t r a w i e n i a p r z e z i z o l a c j
f r a g m e n t u D N A z |e l u a g a r o z o w e g o
a ) D o d a n i e n o w e g o m i e j s c a r e s t r y k c y j n e g o p o t r a w i e n i u e n z y m e m
g e n e r u j c y m t p e k o Dc e - p o p r z e z l i g a c j l i n k e r w D N A * * n p .
w y p o s a |o n y c h w m i e j s c e r e s t r y k c y j n e * * * *
b ) Z a m i a n a l e p k i e g o 5 k o Dc a n a k o n i e c t p y ( n p . e g z o n u k l e a z ,
p o l i m e r a z K l e n o w a )
c ) Z a m i a n a l e p k i e g o 3 k o Dc a n a k o n i e c t p y
* *
* * * * W n i e k t r y c h e k s p e r y m e n t a c h ( d o t y c z y t o n p . r e k o m b i n o w a n i a w
w e k t o r a c h e u k a r i o t y c z n e g o c D N A ) n i e m o |n a u |y d o k l o n o w a n i a f r a g m e n t w
D N A o t r z y m a n y c h w w y n i k u d z i a Ba n i a e n z y m w r e s t r y k c y j n y c h . W y p o s a |a s i j e
w t e d y w s z t u c z n e l e p k i e k o Dc e ( c o m o |e r w n i e | d o t y c z y w e k t o r w ) . T e c h n i k a t a
p o l e g a n a d o s y n t e t y z o w a n i u d o k o Dc w 3 Ba Dc u c h w i d e n t y c z n y c h n u k l e o t y d w
k o m p l e m e n t a r n y c h ( a n g . H o m o p o l y m e r t a i l i n g ) . S y n t e z h o m o p o l i m e r o w y c h
j e d n o n i c i o w y c h z a k o Dc z e D D N A d o k o n u j e t e r m i n a l n a t r a n s f e r a z a
n u k l e o t y d o w a .
Z a l e t t e j t e c h n i k i j e s t t o |e n a z a s a d z i e k o m p l e m e n t a r n o [c i m o g s i z e s o b s k l e i
j e d y n i e f r a g m e n t y o b c e g o D N A i D N A w e k t o r a , a n i e m a m o |l i w o [c i
a u t o l i g a c j i w e k t o r a . W w y n i k u l i g a c j i c z s t e c z e k w y p o s a |o n y c h w s z t u c z n e
l e p k i e k o Dc e p o w s t a j w i c j e d y n i e c z s t e c z k i r e k o m b i n a n t w
P r z y g o t o w a n i e w e k t o r a p l a z m i d o w e g o
1 . W e k t o r d o k l o n o w a n i a m u s i b y p o c i t y o d p o w i e d n i m e n z y m e m
r e s t r y k c y j n y m ( t a k i m s a m y m j a k k l o n o w a n y f r a g m e n t * * )
B a m H I B g l I I
* * 5 ' - G ^ G A T C C - 3
5 ' - A ^ G A T C T - 3
3 ' - C C T A G ^ G - 5 ' 3 ' - T C T A G ^ A - 5 '
U w a g a ! N i e z o s t a j z a c h o w a n e m i e j s c a r e s t r y k c y j n e ! ! !
2 . E l e k t r o f o r e t y c z n a k o n t r o l a j a k o [c i , p o p r a w n o [c i i w y d a j n o [c i t r a w i e n i a
- b a r d z o w a |n e ! ! !
a ) O p c j o n a l n i e d e f o s f o r y l a c j a 5
k o Dc w w e k t o r a , k t r a z a p o b i e g a
a u t o l i g a c j i * * * D N A w e k t o r a ! ! !
L i g a c j a w e k t o r a i w s t a w k i w Ba [c i w a r e k o m b i n a c j a i n v i t r o
W r e k o m b i n a c j i i n v i t r o w y k r z y s t u j e s i l i g a z D N A u z y s k i w a n z k o m r e k E . c o l i
z a k a |o n y c h f a g i e m T 4 ( l i g a z a t a w y m a g a A T P i s k l e j a t a k |e t p e k o Dc e D N A )
O p t y m a l n a t e m p . d z i a Ba n i a l i g a z y T 4 o d 4 ( d l a k o Dc w l e p k i c h ) , 1 5 - 2 5 ( d l a
k o Dc w t p y c h )
S t o s u n e k i l o [c i o w y w s t a w k a : w e k t o r
" P r z y m a By m s t |e n i u D N A w s t a w k i n a j b a r d z i e j
p r a w d o p o d o b n e j e s t p o Bc z e n i e k o Dc w t e j
s a m e j c z s t e c z k i D N A ( r e c y r k u l a r y z a c j a ) .
" W z r o s t s t |e n i a D N A w r e a k c j i l i g a c j i z w i k s z a
p r a w d o p o d o b i e Ds t w o p o Bc z e n i a d w c h r |n y c h
c z s t e c z e k D N A
" D l a w i k s z o [c i a p l i k a c j i m o |n a p r z y j
s t o s u n e k m o l a r n y w s t a w k a : w e k t o r - 3 : 1
Z d o l n o [ t r a n s f o r m a c j i z a l e |y
o d t z w . s t a n u k o m p e t e n c j i
S t a n n a t u r a l n e j k o m p t e n c j i
u w a r u n k o w a n y j e s t
g e n e t y c z n i e . W t a k i e j
t r a n s f o r m a c j i n a j l e p i e j
p o b i e r a n y j e s t l i n i o w y n a t y w n y
d s D N A . J e d n a n i u l e g a
d e g r a d a c j i , d r u g a r e k o m b i n a c j i
d o g e n o m u g o s p o d a r z a .
N a t u r a l n z d o l n o [ w c h o d z e n i a
w s t a n k o m p e t e n c j i w y k a z u j
g B w n i e b a k t e r i e G r a m d o d a t n i e
( S t r e p t o c o c c u s ,
S t a p h y l o c o c c u s , B a c i l l u s ) .
B a k t e r i e G r a m - u j e m n e
z w Ba s z c z a t e z r o d z i n y
E n t e r o b a c t e r i a c e a e , p o d l e g a j
t r a n s f o r m a c j i z e z n a c z n i e
m n i e j s z a w y d a j n o [c i .
S z t u c z n a k o m p e n t c j a t r a n s f o r m a c j a E . c o l i p l a z m i d o w y m D N A
m e t o d c h e m i c z n
P r o c e d u r a t r a n s f o r m a c j i E . c o l i p l a z m i d o w y m D N A m e t o d c h e m i c z n :
1 . P r z y g o t o w a n i e h o d o w l i b i o r c y w e w c z e s n e j f a z i e l o g a r y t m i c z n e j ( O D 6 0 0 0 . 3 - 0 . 4 )
2 . O t r z y m a n i e k o m r e k k o m p e t e n t n y c h p r z e z t r a k t o w a n i e b a k t e r i i z i m n y m ( 0 s t .
C ) r o z t w o r e m 5 0 l u b 1 0 0 m M c h l o r k u w a p n i a ( w n i e k t r y c h m o d y f i k a c j a c h
s t o s u j e s i d o d a t e k i n n y c h j o n w n p . M g l u b R b ) . R o z t w o r y c h l o r k w s p r a w i a j z e
o s Bo n a k o m r k o w a s t a j e s i p r z e p u s z c z a l n a n p . d l a p l a z m i d u
3 . Z m i e s z a n i e k o m r e k k o m p e t e n t n y c h z p r e p a r a t e m D N A ( p l a z m i d a d s o r b u j e s i n a
p o w i e r z c h n i k o m r k i ) i p o d d a n i e k r t k o t r w a Be m u d z i a Ba n i u s z o k u c i e p l n e g o .
S z y b k i e p o d w y |s z a n i e t e m p e r a t u r y ( d o 4 2 s t . C n a o k . 3 m i n . )
p o w o d u j e z m i a n y w p o w Bo k a c h k o m r k o w y c h b a k t e r i i ( p o d w y |s z o n a t e m p e r a t u r a
w p By w a n a s t a n f i z y c z n y l i p i d w w b Bo n i e p o w o d u j c p o w i k s z e n i e
p o r w ) p o z w a l a j c e n a w n i k n i c i e c z s t e c z e k D N A d o w n t r z a k o m r e k
4 . P o z o s t a w i e n i e k o m r e k w p o d Bo |u n i e s e l e k c y j n y m n a o k r e s u m o |l i w i a j c y
p o w r t k o m r e k d o n o r m a l n e g o s t a n u f i z j o l o g i c z n e g o i w y r a |e n i e s i g e n w
z a w a r t y c h n a w p r o w a d z a n y m p l a z m i d z i e l u b w e k t o r z e f a g o w y m ( c o n a j m n i e j 1
g o d z . W p o |y w c e b e z a n t y b i o t y k u z n a p o w i e t r z a n i e m ) - b a r d z o w a |n e ! ! !
5 . W y s i e w k o m r e k n a p o d Bo |a s e l e k c y j n e l u b w p r z y p a d k u t r a n s f o r m a c j i z
w y k o r z y s t a n i e m w e k t o r a f a g o w e g o ( n p . M 1 3 ) n a p By t k i b e z s e l e k c j i z a g a r e m
m i k k i m t o p a g a r e m
E l e k t r o t r a n s f o r m a c j a E . c o l i p l a z m i d o w y m D N A e l e k t r o p o r a c j a
I s t o t m e t o d y j e s t p r z e p u s z c z e n i e p r z e z z a w i e s i n k o m r e k k r t k i e g o
( 5 - 1 0 m s e k ) p u l s u p r d u o b a r d z o w y s o k i m n a p i c i u ( 1 2 5 0 - 2 5 0 0 V ) .
P r o w a d z i d o p o w s t a w a n i a p o r w ( d o 2 n m ) w b Bo n i e ( i m p u l s
e l e k t r y c z n y p r z e j [c i o w o i o d w r a c a l n i e p r z e r y w a c i g Bo [ b Bo n y ) , p r z e z
k t r e d o k o m r e k m o |e w n i k a D N A .
P o r a z p i e r w s z y z a s t o s o w a n a p r z e z D o v e r a i w s p . 1 9 8 8 r o k u d l a b a k t e r i i ,
z y s k a Ba w i e l k p o p u l a r n o [, p o n i e w a | p o z w a l a t r a n s f o r m o w a g a t u n k i ,
k t r e t r u d n o u z y s k u j k o m p e t e n c j m e t o d a m i c h e m i c z n y m i .
D z i k i e l e k t r o p o r a c j i m o |n a u z y s k a :
" b a r d z o w y s o k w y d a j n o [ t r a n s f o r m a c j i ( 1 0 9 - 1 0 1 0 t r a n s f o r m a n t w n a
mg D N A ) ,
" w p r o w a d z a b a r d z o d u |e c z s t e c z k i D N A ( n p . p l a z m i d y z i n s e r t a m i
w i e l k o [c i s e t e k k p z ) n p . B A C z d u |y m i w s t a w k a m i .
W a d j e s t t o |e Ba t w o m o |n a z n i s z c z y ( z a b i ) z a w i e s i n k o m r e k .
M e t o d y w p r o w a d z a n i a D N A d o i n n y c h t y p w k o m r e k
P r o b l e m z n o m e n k l a t u r ! ! !
Z e w z g l d u n a g o s p o d a r z a :
1 . T r a n s f o r m a c j a d o t y c z y b a k t e r i i , d r o |d |y i r o [l i n ,
a l e n i e z w i e r z t i l u d z i
2 . T r a n s f e k c j a z a r e z e r w o w a n e d l a w p r o w a d z a n i a
D N A d o k o m r e k z w i e r z t i l u d z i , w o d r |n i e n i u o d
t r a n s f o r m a c j i n o w o t w o r o w e j t y c h k o m r e k
Z e w z g l d u n a n a t u r p r o c e s u w p r o w a d z a n i a
" B i o l o g i c z n e w s z y s t k i e m e t o d y z w y k o r z y s t a n i e m
w e k t o r w w i r u s w , s z t u c z n y c h c h r o m o s o m w , b a k t e r i i
" F i z y c z n e ( b e z w e k t o r o w e , b e z p o [r e d n i e )
" E l e k t r o p o r a c j a
" B i o b a l i s t y k a
" M i k r o i n i e k c j a
" L i p o f e k c j a
W p r o w a d z a n i e D N A d o k o m r e k d r o |d |y :
" T r a n s f o r m a c j a k o m r e k d r o |d |y o d b y w a s i n a
z a s a d a c h p o d o b n y c h j a k w p r z y p a d k u t r a n s f o r m a c j i
k o m r e k b a k t e r y j n y c h
" t r a n s f o r m a c j a z w y k o r z y s t y w a n i e m w e k t o r w
" m o |e m y t e | w p r o w a d z a D N A b e z w e k t o r o w o n p . p r z e z
e l e k t r o p o r a c j
W p r o w a d z a n i e D N A d o k o m r e k r o [l i n
1 . R o [l i n y d w u l i [c i e n n e - m e t o d y w e k t o r o w e - w e k t o r a m i
s b a k t e r i e z r o d z a j u R h i z o b i u m : A g r o b a c t e r i u m
t u m e f a c i e n s i A g r o b a c t e r i u m r h i z o g e n e s , k t r e p o s i a d a j
n a t u r a l n z d o l n o [ d o w p r o w a d z a n i a s w o j e g o D N A d o
r o [l i n . P o s i a d a j w s w o j e j k o m r c e p l a z m i d , k t r y
z a w i e r a i n f o r m a c j o b i a Bk a c h n i e z b d n y c h d o
z a a t a k o w a n i a r o [l i n y . J e d e n z f r a g m e n t w t e g o
p l a z m i d u , n a z w a n y o d c i n k i e m T ( T - D N A ) , i n t e g r u j e s i z
m a t e r i a Be m g e n e t y c z n y m k o m r k i g o s p o d a r z a . D z i k i
u s u n i c i u c z [c i s e k w e n c j i w e w n t r z p l a z m i d u T , w t o
m i e j s c e m o |n a s t a w i d o w o l n y f r a g m e n t o b c e g o D N A .
O b e c n i e d o t r a n s f o r m a c j i r o [l i n u |y w a s i p l a z m i d w
p o c h o d z c y c h z A g r o b a c t e r i u m t u m e f a c i e n s .
M e t o d a t a m a p o w a |n e o g r a n i c z e n i e - m o |n a j a
s t o s o w a w y Bc z n i e d o r o [l i n d w u l i [c i e n n y c h ,
p o n i e w a | t y l k o o n e u l e g a j i n f e k c j i p r z e z A g r o b a c t e r i u m .
R o [l i n y j e d n o l i [c i e n n e , d o k t r y c h n a l e | z b o |a ,
t r a w y i c e b u l o w a t e n i e m o g b y
t r a n s f o r m o w a n e t y m s p o s o b e m .
I n n e m e t o d y w p r o w a d z a n i a D N A d o r o [l i n
- M i k r o w s t r z e l i w a n i e b i o b a l i s t y k a z a s a d n i c z o w e k t o r o w e a l e m o |l i w e
b e z u |y c i a w e k t o r a
- U |y c i e l i p o s o m w r z a d k o s t o s o w a n a - b e z w e k t o r o w e
- M i k r o i n i e k c j a d o j d r o w a r z a d k o s t o s o w a n a - b e z w e k t o r o w e
- E l e k t r o t r a n s f o r m a c j a r z a d k o s t o s o w a n a
P o z w a l a j o n e n a w p r o w a d z a n i e D N A d o d o w o l n y c h k o m r e k r o [l i n
W p r z y p a d k u r o [l i n t r z e b a p a m i t a , |e z a n i m f r a g m e n t b d z i e m g B b y
w p r o w a d z o n y d o k o m r k i g o s p o d a r z a , t a m u s i b y p o z b a w i o n a [c i a n y k o m r k o w e j
( o p r c z m i k r o w s t r z e l i w a n i a ) . B y t o o s i g n m o |n a p o d d a j d z i a Ba n i u
e n z y m w d e g r a d u j c y c h [c i a n .
O t r z y m u j e s i w t e n s p o s b t z w . p r o t o p l a s t .
M e t o d y w p r o w a d z a n i a D N A d o k o m r e k
z w i e r z c y c h i l u d z k i c h :
" D o m i n u j m e t o d y b i o l o g i c z n e
z u |y c i e m w e k t o r w
w i r u s o w y c h i s o n e
n a j b a r d z i e j s k u t e c z n e
" L i p o f e k c j a z w y k l e D N A
b e z w e k t o r o w e
" M i k r o i n i e k c j a d o j d r o w a - D N A
b e z w e k t o r o w e
" E l e k t r o p o r a c j a z a r w n o z
w y k o r z y s t a n i e m w e k t o r w j a k i
m e t o d y b e z w e k t o r o w e - h o d o w l e
t k a n k o w e
" B i o b a l i s t y k a D N A b e z w e k t o r o w e a l e r w n i e |
z w y k o r z y s t a n i e m w e k t o r w - h o d o w l e
t k a n k o w e
W y k o r z y s t a n i e l i p o s o m w i
l i p o p l e k s w l i p o f e k c j a
n a j c z [c i e j z e w z g l d u n a o g r a n i c z o n
p o j e m n o [ l i p o s o m w w p r o w a d z a s i D N A
b e z w e k t o r o w o
L i p o s o m y t o d r o b n e s y n t e t y c z n e p c h e r z y k i l i p i d o w e .
P o w s t a j o n e s p o n t a n i c z n i e , j e |e l i p e w n e t y p y
l i p i d w z a w i e s i s i w r o z t w o r z e w o d n y m . I c h b Bo n
s t a n o w i p o d w j n a w a r s t w a l i p i d o w a , t a k w i c
b u d o w p r z y p o m i n a j n p . b Bo n k o m r k i .
L i p o s o m y w i | i k o n d e n s u j D N A s p o n t a n i c z n i e ,
t w o r z c k o m l e k s y o w y s o k i m p o w i n o w a c t w i e d o b Bo n
k o m r k o w y c h .
M i k r o i n i e k c j a d o j d r o w a
( g B w n i e t k a n k i z w i e r z c e i
l u d z k i e )
" M e t o d a p o w s t a Ba w l a t a c h 7 0 X X
w i e k u .
" P o l e g a n a w s t r z y k i w a n i u D N A
b e z p o [r e d n i o d o j d e r k o m r e k z a
p o m o c s z k l a n y c h m i k r o i g i e B,
k o n t r o l o w a n y c h p r z e z s t e r o w a n e
h y d r a u l i c z n i e m i k r o m a n i p u l a t o r y ,
p r z y r w n o c z e s n e j o b s e r w a c j i p o d
m i k r o s k o p e m o w y s o k i e j
r o z d z i e l c z o [c i .
" M e t o d a t a j e s t b a r d z o w y d a j n a
" D o [w i a d c z e n i e w y k o n y w a n i e j e s t
p r z e z r c z n i e c z Bo w i e k a .
M e t o d a p r a c o - i c z a s o c h Bo n n a .
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