Sekwencjonowanie DNA
W przypadku wielu analiz uzyskanie produktów PCR jest wstępnym etapem i stanowi punkt wyjścia do dalszych
badań np. analizy produktu metodą SSCP lub PRC-RFLP (CAPS). Każda z tych metod umożliwia pośrednie
wykrycie mutacji. Bezpośrednią metodą analizy DNA, pozwalającą określić kolejność nukleotydów w jego
fragmencie jest sekwencjonowanie
Sekwencjonowanie wykorzystywane jest
- w celu poznania struktury genetycznej organizmów modelowych (sekwencjonowanie całych genomów)
- w diagnostyce molekularnej (określanie zmian w sekwencji krótkich odcinków DNA)
W 1977 opublikowana 2 metody sekwencjonowania
- chemiczna (Maxama i Gilberta)
- enzymatyczna (Sanger)
Ze względu na automatyzację druga z metod odegrała większą rolę, w szczególnie trudnych przypadkach
pierwsza metoda jest niezastąpiona.
Metoda chemiczna polega na częściowej chemicznej degradacji oczyszczonej jedno/dwuniciowej cząsteczki
DNA. Wykorzystuje chemiczną modyfikację zasad, a następnie degradację tak przygotowanych łańcuchów
DNA w obecności piperydyny. Wyznakowane radioaktywnie cząsteczki DNA każdej próbki dzieli się na 4
części i poddaje modyfikacji chemicznej. Modyfikację prowadzi się w 4 oddzielnych probówkach: G, A+G ,
C+T, C. Warunki reakcji modyfikacji dobrane są tak, że tylko jedna z zasad w danym fragmencie DNA jej
uległa.
Guanina siarczan dimetylu
Adenina+ Guanina kwas mrówkowy
Tymina+ Cytozyna hydrazyna
Cytozyna hydrazyna + NaCl
W reakcji G dochodzi do metylacji pierścienia guanozyny w pozycji N7 w obecności siarczanu dimetylu (DMS),
a następnie spontanicznego otwarcia pierścienia między C8 i N7.
W reakcji A+G następuje osłabienie wiązań glikozydowych reszt purynowych w obecności kwasu mrówkowego
przez proponowanie atomów azotu pierścieni purynowych.
W reakcji C+T ma miejsce rozszczepienie pierścieni pirymidyn w obecności hydrazyny.
W reakcji C wykorzystuje się specyficzność hydrazyny wobec reszt cytydyny w obecności NaCl.
W kolejnym etapie zmodyfikowane cząsteczki ulegają częściowej degradacji pod wpływem piperydyny. W
obecności tego związku następuje hydroliza wiązań N-glikozydowych, a następnie wiązań fosfodiestrowych po
stronie 3 zmodyfikowanych zasad. Dzięki temu uzyskuje się fragmenty różnej długości, które zawsze kończą
się zmodyfikowaną zasadą.
Fragmenty DNA w poszczególnych reakcji (G, A+G, T+C, C) rozdziela się na żelu poliakrylamidowym w 4
oddzielnych ścieżkach. Kolejność nukleotydów odczytuje się z autoradiogramu. Zaczynając od dołu
autoradiogramu odczytujemy właściwą kolejność nukleotydów w nici DNA.
Zaletą jest to, że jest bezpośrednią metodą chemiczną, niewrażliwą na sekwencje trudne do syntezy przez
polimerazy DNA np. bogate w GC, sekwencje palindromowe czy homopolimeryczne odcinki DNA.
Metoda enzymatyczna (dideoksy) jest najczęściej stosowaną metodą sekwencjonowania. Polega na
enzymatycznej replikacji jednoniciowej matrycy DNA, która rozpoczyna się od pojedynczego startera, a kończy
wbudowaniem do nici potomnej DNA dideoksynukleotydu. Jest to metoda kontrolowanego przerywania
dideoksynukleotydem reakcji syntezy DNA prowadzonej przez polimerazę. Do sekwencjonowania wymagane są
jednoniciowe cząsteczki DNA, wysoce oczyszczone i jednorodne. Polimeraza kopiuje matrycę rozpoczynając
syntezę od oligonukleotydowego startera łączącego się komplementarnie z początkiem matrycy. Reakcję
prowadzi się równolegle w 4 probówkach. Do każdej z nich oprócz równych ilości 4 nukleotydów: A, C, T, G,
które są komplementarnie włączane do powstającej nici, dodaje się niewielką ilość jednego z nukleotydów w
postaci dideoksy.
Zwykły nukleotyd posiada grupę 3 OH rybozy, do której podczas syntezy nici DNA przyłączany jest kolejny
nukleotyd. Postać dideoksy w miejscu grupy 3 OH ma pojedynczy atom wodoru, co uniemożliwia przyłączenie
kolejnego nukleotydu.
Dideoksynukleotydy występują w mieszaninie reakcyjnej w niewielkiej ilości, więc są losowo przyłączane
niekiedy na początkowym, innym razem na końcowym etapie syntezy nici. W probówce zawierającej
dideoksynukleotyd np. ddG, synteza łańcucha DNA przerywana po wstawieniu ddG, co doprowadzi do
powstania fragmentów DNA o różnych długościach, zakończonych zawsze ddG.
W każdej z 4 probówek powstaje mieszanina fragmentów różnej długości, których synteza została przerwana na
jednym z 4 nukleotydów dideoksy.
Jeśli produkty reakcji z poszczególnych probówek podda się elektroforezie na żelu poliakrylamidowym w 4
równoległych ścieżkach, to powstała drabinka fragmentów pozwoli na ustalenie sekwencji nici komplementarnej
do badanej. Dzięki zastosowaniu reakcji znakowanego radioizotopem nukleotydu lub startera detekcji dokonuje
się za pomocą autoradiografii. Sekwencję nici odczytuje się na podstawie znajomości końcowe zasady w kolejno
coraz dłuższych fragmentach.
Zastąpienie znaczników izotopowych barwnikami fluorescencyjnymi umożliwiło automatyzację metod detekcji i
odczytu sekwencji. W przypadku stosowania dideoksynukleotydów wyznakowanych fluorochromami o różnych
barwach reakcja może być prowadzona w 1 probówce i podczas elektroforezy żelowej (płytowej) lub kapilarnej
korzysta się z jednej ścieżki. Laser wzbudza dołączony barwnik, a detektor odczytuje końcową zasadę na
podstawie długości fali emitowanej fluorescencji.
Najpowszechniej stosowane sekwenatory DNA oparte są na elektroforezie kapilarnej. Średnica kapilary wynosi
25-100 źm. Detekcja odbywa się na końcu kapilary, a czas rozdziału skrócony jest do kilkunastu minut dzięki
zastosowaniu napięcia rzędu 10000-30000V. Kapilary napełnione są polimerem optymalnym dla kwasów
nukleinowych, tzw. LPA, który zapewnia najwyższej jakości rozdział DNA. Stosowany polimer jest różny w
zależności od długości sekwencjonowanych fragmentów (POP-4, POP-6, POP-7).
Objętość nanoszonych próbek jest bardzo mała i wynosi zaledwie 10-100nl. Po zakończeniu rozdziału kapilary
są przemywane i regenerowane poprzez ponowne napełnienie złożem, dzięki czemu wyeliminowano problem z
zanieczyszczeniami, które pozostawały po poprzedniej analizie. Nowoczesny sekwenator kapilarny powinien
cechować się pełną automatyką procesu, wysoką rozdzielczością, możliwością analizy sekwencji DNA,
genotypowania oraz identyfikacji SNP i niezawodnością.
Sekwenatory o najwyższej wydajności posiadają 96 kapilar, co umożliwia sekwnecjonowanie ponad 2 mln
nukleotydów na dobę. W przypadku standardowego sekwenatora posiadającego 16 kapilar możliwe jest
sekwencjonowanie około 330tys. nukleotydów w ciągu doby. W jednej kapilarze można wykonać kilkadziesiąt
rozdziałów fragmentów DNA, a maksymalna długość odczytu wynosi do 950bp.
Obecnie do sekwencjonowania stosuje się 2 typy polimeraz
- pochodne polimerazy Taq (termosekwenaza, "Taq)
- pochodne polimerazy DNA faga T7 z komórek E.coli (sekwenaza, sekwenaza 2.0)
Zastosowanie pochodnych polimerazy Taq umożliwia prowadzenie sekwencjonowania w cyklach analogicznych
do reakcji PCR- sekwencjonowanie cykliczne. Różnica między sekwencjonowaniem, a klasycznym PCR polega
na tym, że do sekwencjonowania wykorzystujemy jeden starter, więc ilość produktu przyrasta liniowo, a nie w
sposób wykładniczy, jak w przypadku zastosowania 2 starterów.
Polimeraza faga T7 jest enzymem, którego optymalna temperatura działania wynosi 37C. Nie wykazuje on
właściwości termostabilnych i szybko traci aktywność w wyższych temperaturach, stąd sekwencjonowanie przy
udziale tego enzymu nazywamy sekwencjonowaniem izotermicznym. Zastosowanie tego enzymu pozwala na
odczytywanie długich sekwencji- ponad 600bp.
Matrycę do sekwencjonowania stanowią zazwyczaj produkty reakcji PCR lub fragmenty DNA klonowane w
wektorze, najczęściej plazmidowym. Niezwykle istotne jest oczyszczenie produktów PCR przed
sekwencjonowaniem; przede wszystkim usunięcie nieużytych starterów i dNTP. Istotne jest także pozbycie się
RNA. Startery i inne jednoniciowe fragmenty DNA można usunąć za pomocą egzonukleazy I E.coli (Exo),
natomiast dNTP za pomocą alkalicznej fosfatazy (SAP).
Skuteczne przeprowadzenie sekwencjonowania jest możliwe tylko wtedy gdy dysponuje się homogennym
produktem PCR. Pewnym rozwiązaniem jest wycięcie fragmentu żelu zawierającego badany fragment DNA i
elucja z niego DNA. Innym podejściem jest klonowanie produktu do wektora plazmidowego. Klonowanie jest
niezbędne jeśli fragment przeznaczony do sekwencjonowania uzyskany został metodą amplifikacji z jednym
rodzajem startera np. RAPD
Pirosekwencjonowanie
Technika umożliwiająca analizę polimorfizmu pojedynczych nukleotydów poprzez sekwencjonowanie
określonego locus. Jest metodą sekwencjonowania DNA w czasie rzeczywistym. Wykorzystuje się jednoczesne
działanie 4 enzymów: polimerazy DNA, sulfurylazy ATP, lucyferazy i apirazy. Podczas syntezy DNA
uwalniany jest pirofosforan. W wyniku kaskady reakcji enzymatycznych dochodzi do emisji światła, którego
intensywność zależy od ilości uwolnionego pirofosforanu, a tym samym liczby wbudowanych nukleotydów.
- matrycą do pirosekwencjonowania jest jednoniciowe DNA do którego przyłączany jest starter sekwencyjny
- w mieszaninie reakcyjnej znajdują się 4 enzymy oraz ich substraty (APS- adenozyno-5-fosforosiaczan oraz
lucyferyna)
- do mieszaniny dodawane są pojedynczo poszczególne dNTP; jeśli dodany nukleotyd jest komplementarny to
dochodzi do jego wbudowania i uwolnienia pirofosforanu
- sulfurylaza ATP przekształca pirofosforan do ATP, który wykorzystywany jest przez lucyferazę do utlenienia
lucyferyny, czemu towarzyszy emisja światła. Podczas braku komplementarności dNTP nie obserwuje się
żadnego efektu
Sygnał świetlny jest tym intensywniejszy im więcej tych samych nukleotydów jest kolejno wbudowywanych.
Apiraza w sposób ciągły degraduje ATP i niezwiązane dNTP, co regeneruje mieszaninę reakcyjną.
Pirosekwenator umożliwia jednoczesną analizę 96 lub 384 próbek, ale długość analizowanych sekwencji wynosi
zaledwie 40-60bp.